培育高蛋氨酸轉基因植物方法

2023-10-10 07:55:49 1

專利名稱：：培育高蛋氨酸轉基因植物方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，尤其涉及一種培育高蛋氨酸轉基因植物方法。
背景技術：
：蛋氨酸是人類和動物所必需胺基酸之一。大豆(Glycinemax(L.)Merr.)作為優質高蛋白作物，其含硫胺基酸尤其是蛋氨酸含量偏低。通過常規育種方法進行高蛋氨酸品種培育存在較大的困難，因此需要藉助分子育種手段來解決這一瓶頸問題。擬南芥CGS基因編碼蛋氨酸合成過程中的關鍵酶一胱硫醚Y-合成酶，可促進游離蛋氨酸的合成。擬南芥D-AyCGS基因是CGS基因的氮端部分缺失形式，它具有對反饋抑制的不敏感性，通過對該基因在擬南芥中的過表達，能夠大幅度提高植株游離蛋氨酸的含量。葉片是蛋氨酸合成的主要場所，因此，通過D-AtCGS的組成型表達，可使葉片中蛋氨酸大量合成，擴大了蛋氨酸的「源」，更利於大豆籽粒「庫」中蛋氨酸的積累。同時也有報導認為大豆籽粒中也可進行游離蛋氨酸的合成，提高籽粒中蛋氨酸的含量。
發明內容本發明的一個目的是提供一種培育高蛋氨酸轉基因植物方法。本發明提供的方法，為將D-AtCGS蛋白的編碼基因導入目的植物，得到轉基因植物，所述轉基因植物的胺基酸含量高於所述目的植物；所述D-AtCGS蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列2。所述D-AtCGS蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。所述轉基因植物的胺基酸含量高於所述目的植物為如下I)或2):所述轉基因植物籽粒中的游離胺基酸含量高於所述目的植物；所述轉基因植物籽粒中的總胺基酸含量高於所述目的植物。所述游離胺基酸為游離蛋氨酸、游離丙氨酸(Alanine)、游離纈氨酸(Valine)、游離絲氨酸(Serine)、游離亮氨酸(Leucine)、游離蘇氨酸(Threonine)、游離異亮氨酸(Isoleucine)、游離脯氨酸(Proline)、游離甘氨酸(Glycine)、游離高絲氨酸(Homoserine)、游離蛋氨酸(Methionine)、游離天冬氨酸(Aspartate)、游離苯基丙氨酸(Phenylalanine)、游離半胱氨酸(Cysteine)、游離穀氨酸鹽(Glutamate)、游離高半胱氨酸(Homocysteine)、游離天冬醯胺酸(Asparagine)、游離賴氨酸(Lysine)、游離酪氨酸(Tyrosine)和/或游離色氨酸(Tryptophan)。所述D-AtCGS蛋白的編碼基因通過植物表達載體導入所述目的植物；所述植物表達載體為pLEG-DCGS；所述pLEG-DCGS按照如下方法構建I)將啟動子leguminB4插入pGPTV-Bar的HindIII和NcoI酶切位點間得到中間載體；2)將D-AtCGS蛋白的編碼基因插入步驟I)得到的中間載體的NcoI和XbaI酶切位點間得到的重組載體。所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，優選為雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為大豆。大豆為自貢冬豆、吉林小粒I號大豆。本發明的另一個目的是提供一種培育高蛋氨酸轉基因植物方法。本發明提供的方法，為將D-AtCGS蛋白的編碼基因導入目的植物，得到轉基因植物，所述轉基因植物的胺基酸含量高於所述目的植物；所述D-AtCGS蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列2。所述D-AtCGS蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I;所述轉基因植物的胺基酸含量高於所述目的植物為所述轉基因植物葉片中的游離蛋氨酸的含量高於所述目的植物。所述D-AtCGS蛋白的編碼基因通過植物表達載體導入所述目的植物；所述植物表達載體按照如下方法製備DpBIN-TMTL經HindIII和BamHI，回收750bp小片段；2)將步驟I)得到的750bp小片段插入pET-28a的HindIII和BAmHI識別位點間，得到中間載體A;3)將D-AtCGS蛋白的編碼基因插入步驟2)得到的中間載體A的NcoI和XbaI識另Ij位點，得到中間載體B;4)將中間載體B經HindIII和XbaI酶切得到3.3kb的片段插入pTFlOl.I的HindIII和XbaI識別位點間得到的重組載體。所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，優選為雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為大豆。大豆品種為自貢冬豆或吉林小粒I號。本發明的實驗證明，通過分別構建含有擬南芥D-AtCGS基因的種子特異性植物表達載體和組成型植物表達載體，採用農桿菌介導的子葉節轉化方法，將氮端部分缺失的擬南介CGS基因導入吉林小粒I號和晚熟大ii品種自貝冬ii中，以實現大ii杆粒遊尚蛋氣酸含量的提高，並獲得大豆全株蛋氨酸含量提高的大豆品系。通過草丁膦塗抹和PCR檢測轉基因陽性植株進行鑑定，並對轉基因後代進行了相應的草丁膦抗性實驗和分子檢測，獲得了生長正常的轉基因陽性植株，為大豆分子育種工作提供優異育種材料。圖I為pLEG-DCGS質粒部分結果示意2為pET-DCGS亞克隆的構建流程圖3為pTF-DCGS載體的構建流程圖4為農桿菌介導的大豆子葉節轉化流程圖5為T2代轉D-AtCGS自貢冬豆植株(pLEG-DCGS)草丁膦塗抹檢測結果圖6為T2代轉D-AtCGS吉林小粒I號植株(pLEG-DCGS)草丁膦塗抹檢測結果圖7為轉化植株的PCR檢測圖8為SouthernBlot檢測結果圖9為SouthernBlot檢測結果圖10為WesternBlot檢測結果圖11為轉D-AtCGS基因植株的種子游離蛋氨酸含量圖12為轉D-AtCGS植株的種子總蛋氨酸含量圖13為Ttl代轉D-AtCGS吉林小粒I號植株(pTF_DCGS)塗抹實驗圖14為草丁膦陽性Ttl代轉D-AtCGS自貢冬豆植株(pTF-DCGS)的PCR檢測圖15為PCR檢測陽性Ttl代轉D-AtCGS自貢冬豆植株(pTF-DCGS)成熟期的短日處理圖16為T1代轉D-AtCGS自貢冬豆植株(pTF-DCGS)塗抹實驗圖17為T1代轉D-AtCGS自貢冬豆植株(pTF-DCGS)PCR檢測圖18為T1代轉D-AtCGS自貢冬豆植株(pTF-DCGS)RT-PCR檢測圖19為組成型轉基因植株的WesternBlot結果圖20為組成型轉基因植株的蛋氨酸含量具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、種子特異性表達載體和組成型的轉化載體的獲得大豆受體材料轉化實驗採用的大豆(Glycinemax(L.)Merr.)受體品種為自貢冬豆、吉林小粒I號；吉林小粒I號記載在鄭惠玉，楊兆宇，韓春鳳，孫運嶺，利用野生大豆(G.soja)種質育成小粒大豆新品種「吉林小粒I號」的選育報告，吉林農業科學，1991，03-0029-11中，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。自貢冬豆(Zigongdongdou)記載在DongCao,WenshengHou,ShikuiSong,HongboSun，CunxiangWu,YongshengGao,TianfuHan.AssessmentofconditionsaffectingAgrobacteriumrhizogenes-mediatedtransformationofsoybean.PlantCellTissueOrganCulture(2009)96:45-52中，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。菌株實驗使用的大腸桿菌菌株為DH5a(購於百泰克公司)。根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHAlOl記載在HoodEE.，HelmerGL，FraleyRT，ChiltonM-D.ThehypervirulenceofAgrobacteriumtumefaciensA281isencodedinaregionofpTiBo542outsideofT-DNA[J].JBacteriol，1986，168:1291-1301.中，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。根癌農桿菌Agrobacteriumtumefaciens)EHA105記載在PazMM，MartinezJC，KalvigAB，FongerTM，KanW.ImprovedcotyledonarynodemethodusinganalternativeexplantderivedfrommatureseedforefficientAgrobacterium-mediated[J].PlantCellRep,2006,25:206-213.中，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。I、種子特異性表達載體pLEG-DCGS將擬南芥CGS基因的氮端部分缺失即為D-AtCGS基因，其核苷酸序列為序列表中的序列1，其胺基酸序列為序列表中的序列2，可人工合成。啟動子為leguminB4(accessionnoX03677的第1534-2766位核音酸。)，插ApGPTV-Bar(DetlefBecker,ElkeKemper,JeffSchellandRobertMasterson.NewplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftT-DNAborder.1992.PlantMolecularBiology20:1195-1197,公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。)的HindIII和NcoI酶切位點間，得到中間載體。再將D-AtCGS基因插入中間載體的NcoI和XbaI酶切位點間，得到重組質粒。將重組質粒送去測序，結果為將序列表中的序列I(序列表中的序列I)插入pGPTV-Bar的NcoI和XbaI酶切位點間得到的載體，將該載體命名為pLEG-DCGS，該載體中含有目的基因D-AtCGS及基於Bar基因的植物抗性篩選標記表達盒。pLEG-DCGS的結構示意圖如圖I所/Jno2、組成型的轉化載體pTF-DCGS將pBIN_TMTL(記載在王慶中，轉BoTMT基因大豆的獲得及鑑定，中國農業科學院碩士學位論文，2006中，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。)經HindIII和BamHI，回收750bp的小片段，即為啟動子D35S::Q。將啟動子D35S::Q與經過HindIII和BamHI酶切的pET_28a(Novagen公司，cat.NO.69864-3)連接，得到pET_D35S::Q；將pLEG-DCGS經NcoI和XbaI酶切，得到2.4kb的目的片段(D-AtCGS)，將該片段與經過同樣酶切的pET-D35S::Q載體骨架連接，得到PET-D35S-DCG，構建流程如圖2所示；將pET-D35S-DCG經HindIII和XbaI酶切，得到3.3kb的片段(D35S::Q、中間序列和D-AtCGS)，將該片段與經過同樣酶切的pTFlOl.I(記載在Paz，M.，Martinez,J.C.,Kalvig,A.,Fonger,T.,Wang,K.ImprovedcotyledonarynodemethodusinganalternativeexplantderivedfrommatureseedforefficientAgrobacterium-mediatedsoybeantransformation.PlantCe11Reports,25:206-213(2006)中，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。)載體骨架連接，將連接產物轉入大腸桿菌，得到轉化子，將轉化子提取質粒。將質粒用HindIII和XbaI酶切，得到3.3bp目的片段的片段的為陽性質粒。將陽性質粒送去測序,結果為將含有序列表中的序列I的DNA分子(該DNA分子由D35S::Q啟動子、中間序列和D-AtCGS組成)插入pTFlOl.I的HindIII和XbaI酶切位點間得到的載體，將該載體命名為PTF-DCGS，構建流程如圖3所示，中間序列為序列表中的序列3自5』末端第7-98位核苷酸。實施例2、轉D-AtCGS大豆的獲得及功能研究I、自貢冬豆和吉林小粒I號種子滅菌分別挑選無病害、無裂痕、飽滿的自貢冬豆(以下稱為野生型自貢冬豆)和吉林小粒I號大豆(以下稱為野生型吉林小粒I號)種子，將種子平鋪於乾燥器中的培養皿中。乾燥器中放置裝有IOOml次氯酸鈉溶液的燒杯，沿壁緩緩加入4ml12mol/L的鹽酸，迅速關閉乾燥器頂蓋，使大豆種子在氯氣中滅菌12h。滅菌後的種子放入超淨工作檯釋放殘餘氯氣，並將種子接種於發芽培養基上，蓋上培養皿蓋子，不封口，放入培養間，溫度24°C，光照時數18h，自貢冬豆發芽4天，吉林小粒I號發芽5天，得到自貢冬豆外植體和吉林小粒I號外植體，用於轉化。轉化相關培養基I)發芽培養基(GM)GamborgB5basesalt+Sucrose20mg/L，pH5.8，Agar7.6g/L02)共培養培養基(CCM)l/10GamborgB5basesalt+GamborgB5Vitamin+MES3.9g/L+BAPI.6mg/L+GA30.25ml/L+AS0.04g/L+DTT150mg/L+Cys400mg/L+Sucrose30g/L+Washedagar8g/L，pH5.4。3)芽誘導培養基(SIM)GamborgB5salt+BAPI.6mg/L+Sucrose20g/L+MES3mM+PhytageI3g/L，pH5.I,Cefotaxime200mg/L，Timentin50mg/Lo4)伸長培養基(SEM)MSbasesalt+GamborgB5Vitamin+MES3mM+Asplml/L+Glulml/L+IAA300ug/L+Zeatin-Rlmg/L+GA3500ug/L+Sucrose20mg/L+Phytagel3g/L,pH5.I,Cefotaxime200mg/L，Timentin50mg/Lo5)生根培養基(RM)MSbasesalt+GamborgB5Vitamin+MES3mM+Asplml/L+Glulml/L，Agar8g/L，pH5.6,Cefotaxime200mg/L，Timentin50mg/Lo6)大腸桿菌培養基(LB)Yeastextract5g/L+TryptonelOg/L+Nacl10g/L，(Agar15g/L)，pH7.0。7)農桿菌培養基(YEP)YeastextractlOg/L+TryptonelOg/L+Nacl5g/L，(Agar15g/L)，pH7.0。培養基組成如下表I所示表I培養基各成分權利要求1.一種培育高蛋氨酸轉基因植物方法，為將D-AtCGS蛋白的編碼基因導入目的植物，得到轉基因植物，所述轉基因植物的胺基酸含量高於所述目的植物；所述D-AtCGS蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列2。2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述D-AtCGS蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。3.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於所述轉基因植物的胺基酸含量高於所述目的植物為如下I)或2):所述轉基因植物籽粒中的游離胺基酸含量高於所述目的植物；所述轉基因植物籽粒中的總胺基酸含量高於所述目的植物。4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特徵在於所述游離胺基酸為游離蛋氨酸、游離丙氨酸、游離纈氨酸、游離絲氨酸、游離亮氨酸、游離蘇氨酸、游離異亮氨酸、游離脯氨酸、游離甘氨酸、游離高絲氨酸、游離蛋氨酸、游離天冬氨酸、游離苯基丙氨酸、游離半胱氨酸、游離穀氨酸鹽、游離高半胱氨酸、游離天冬醯胺酸、游離賴氨酸、游離酪氨酸和/或游離色氨酸。5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特徵在於所述D-AtCGS蛋白的編碼基因通過植物表達載體導入所述目的植物；所述植物表達載體為pLEG-DCGS；所述pLEG-DCGS按照如下方法構建1)將啟動子leguminB4插入pGPTV_Bar的多克隆位點得到中間載體；2)將D-AtCGS蛋白的編碼基因插入步驟I)得到的中間載體的多克隆位點得到的重組載體。6.根據權利要求1-5任一所述的方法，其特徵在於所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，優選為雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為大豆。7.一種培育高蛋氨酸轉基因植物方法，為將D-AtCGS蛋白的編碼基因導入目的植物，得到轉基因植物，所述轉基因植物的胺基酸含量高於所述目的植物；所述D-AtCGS蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列2。8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述D-AtCGS蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I;所述轉基因植物的胺基酸含量高於所述目的植物為所述轉基因植物葉片中的游離蛋氨酸的含量高於所述目的植物。9.根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於所述D-AtCGS蛋白的編碼基因通過植物表達載體導入所述目的植物；所述植物表達載體按照如下方法製備DpBIN-TMTL經HindIII和BamHI，回收750bp小片段；2)將步驟I)得到的小片段插入pET-28a的多克隆位點間，得到中間載體A;3)將D-AtCGS蛋白的編碼基因插入步驟2)得到的中間載體A的多克隆位點，得到中間載體B;4)將中間載體B經HindIII和XbaI酶切得到3.3kb的片段的片段插入pTFlOl.I的多克隆位點間得到的重組載體。10.根據權利要求7-9中任一所述的方法，其特徵在於所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，優選為雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為大豆。全文摘要本發明公開了一種培育高蛋氨酸轉基因植物方法。本發明提供的培育高蛋氨酸轉基因植物方法，為將D-AtCGS蛋白的編碼基因導入目的植物，得到轉基因植物，所述轉基因植物的胺基酸含量高於所述目的植物；所述D-AtCGS蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列2。所述D-AtCGS蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。本發明通過分別構建含有擬南芥D-AtCGS基因的種子特異性植物表達載體和組成型植物表達載體，採用農桿菌介導的子葉節轉化方法，將氮端部分缺失的擬南芥CGS基因導入吉林小粒1號和晚熟大豆品種自貢冬豆中，以實現大豆籽粒游離蛋氨酸含量的提高，並獲得大豆全株蛋氨酸含量提高的大豆品系。文檔編號C12N15/84GK102776230SQ20111011817公開日2012年11月14日申請日期2011年5月9日優先權日2011年5月9日發明者于洋,伊塔瑪·高朵,依法特·馬提亞胡,侯文勝,吳存祥,宋時奎,瑞徹爾·埃米爾,韓天富申請人:中國農業科學院作物科學研究所