用於生產乙醇酸的固定的微生物腈水解酶的改進的製作方法

2023-10-25 15:38:27

專利名稱：用於生產乙醇酸的固定的微生物腈水解酶的改進的製作方法
技術領域：
本發明涉及有機酸的合成和微生物學領域。更具體地，本發明提供了製備酶催化 劑的方法，所述酶催化劑在乙醇腈水解為乙醇酸過程中的初始腈水解酶活性的保留得到改 進，所述方法包括在固定和交聯之前以戊二醛預處理酶催化劑。如上所述，與未經戊二醛預 處理的固定的和交聯的酶催化劑相比，戊二醛預處理的固定的和交聯的酶催化劑具有改進 的比活性，從而具有將乙醇腈轉化為乙醇酸的改進的總的催化劑活性、催化劑生產力和單 位體積生產力。
背景技術：
乙醇酸(H0CH2C00H ；CAS註冊號為79-14-1)是羧酸的α -羥基酸家族的最簡單的 成員。乙醇酸的性質使其具有理想的廣範圍的消費和工業應用，包括用於水井復原、皮革工 業、油氣工業、洗衣和紡織工業、作為單體製備聚乙醇酸(PGA)，以及作為個人護理產品的成 分。乙醇酸還是多種工業上的清潔劑(奶製品和食品加工設備清潔劑，家居和機構清潔劑， 工業清潔劑[用於運輸設備、石工技術、印刷電路板、不鏽鋼鍋爐和處理設備、冷卻塔/熱交 換器]和金屬加工[用於金屬酸洗、銅的拋光、蝕刻、電鍍、電解法拋光])的主要成分。也 有報導指出乙醇酸可作為氣體屏障材料(即顯示出高度的氧氣屏障特性)用於包裝食物和 碳酸飲料(WO 2005/106005Α1)。但是，乙醇酸的傳統化學合成產生大量的雜質，在使用前必 須除去這些雜質。工業界迫切需要商業化生產乙醇酸的新技術，特別是以低成本生產高純 度乙醇酸的新技術。微生物酶催化劑能夠使用腈水解酶(EC 3. 5. 5. 7)將腈(例如乙醇腈)直接水解 為相應的羧酸(例如乙醇酸)，其中不產生相應的醯胺中間體(反應式1)；或者可通過腈水 合酶(EC 4. 2. 1. 84)與醯胺酶(EC 3. 5. 1. 4)的組合將腈(例如乙醇腈)水解為相應的羧 酸(例如乙醇酸)，其中腈水合酶(NHase)首先將腈轉化為醯胺，然後醯胺被醯胺酶轉化成 相應的羧酸(反應式2))
權利要求
一種方法，用於改進乙醇腈轉化為乙醇酸過程中具有腈水解酶活性的酶催化劑的初始比活性的保留，所述方法包括(a)通過發酵產生具有腈水解酶活性的酶催化劑；(b)以戊二醛預處理所述酶催化劑；(c)任選地在戊二醛預處理之後以亞硫酸氫鹽將未反應的戊二醛滅活；(d)從(b)或(c)回收酶催化劑並將所述酶催化劑固定於角叉菜膠中；和(e)以戊二醛和聚乙烯亞胺將(d)中產生的角叉菜膠 固定的酶催化劑進行交聯，從而產生戊二醛預處理的固定的和交聯的酶催化劑，並且其中所述戊二醛預處理的固定的和交聯的酶催化劑在相同反應條件下與未經戊二醛預處理的固定的和交聯的酶催化劑相比，在乙醇腈轉化為乙醇酸過程中的初始比活性的保留得到改進。
2.根據權利要求1所述的方法，其中(a)的酶催化劑包含胺基酸序列標誌基序SEQID NO :1 或 SEQ ID NO :2。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述酶催化劑包含具有選自SEQIDN0:4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、29、31、33、35、37、39、41、 43、45、47、49、51、53、55和57的胺基酸序列的多肽。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述酶催化劑是敏捷食酸菌72W。
5.根據權利要求1所述的方法，其中在以戊二醛進行預處理的過程中將PH保持在5.0 至 9. 0。
6.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(b)中以戊二醛進行預處理包括向步驟(a) 產生的發酵液中加入大約3g/L(0.025g GA/OD550)至大約5g/L(0. 042g GA/OD550)的戊二醛。
7.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(b)中以戊二醛進行預處理包括以50mg/L/h 至500mg/L/h的速率向步驟(a)產生的發酵液中加入戊二醛。
8.根據權利要求1所述的方法產生的戊二醛預處理的固定的和交聯的酶催化劑。
9.根據權利要求8所述的酶催化劑，其中所述催化劑在至少4個連續批式循環反應之 後，保留其初始比活性的至少大約70%。
10.一種將乙醇腈水解為乙醇酸的改進的方法，包括改進乙醇腈轉化為乙醇酸過程中 具有腈水解酶活性的固定的酶催化劑的初始比活性的保留，所述方法包括(a)通過發酵產生具有腈水解酶活性的酶催化劑；(b)以戊二醛預處理所述酶催化劑；(c)任選地在戊二醛預處理之後以亞硫酸氫鹽將未反應的戊二醛滅活；(d)從(b)或(c)回收酶催化劑並將所述酶催化劑固定於角叉菜膠中；(e)以戊二醛和聚乙烯亞胺將(d)中產生的角叉菜膠-固定的酶催化劑進行交聯，從而 產生交聯的固定的酶催化劑；和(f)在合適的反應條件下，在水溶液中將(e)的交聯的固定的酶催化劑與乙醇腈接觸， 從而產生乙醇酸。
11.根據權利要求10所述的方法，還包括步驟(g)回收步驟(f)中產生的乙醇酸。
12.根據權利要求10所述的方法，其中在固定的酶催化劑的每克幹細胞重產生至少 40g乙醇酸之後，所述交聯的固定的酶催化劑保留其初始比活性的至少大約70%，並且與 另一種產生乙醇酸的方法相比，所述方法具有改進的生產乙醇酸的生產力，所述另一種產生乙醇 酸的方法使用包含未經過戊二醛預處理的具有腈水解酶活性的酶催化劑的交聯的 固定的酶催化劑。
全文摘要
本發明提供了製備具有將乙醇腈水解為乙醇酸的腈水解酶活性的酶催化劑的方法，所述酶催化劑在具有催化劑循環的連續批式反應中其回收的催化劑活性的保留得到改進，所述方法包括以戊二醛預處理酶催化劑。與未經戊二醛預處理的酶催化劑相比，戊二醛預處理的酶催化劑具有改進的比活性，從而具有改進的總的催化劑活性和生產力。
文檔編號C12N11/00GK101965399SQ200880124121
公開日2011年2月2日 申請日期2008年10月31日 優先權日2007年10月31日
發明者A·本-巴薩特, R·迪科西莫 申請人:納幕爾杜邦公司