基於微流控晶片的秀麗隱杆線蟲單卵捕獲及培養方法
2023-10-05 02:34:29
專利名稱：基於微流控晶片的秀麗隱杆線蟲單卵捕獲及培養方法
技術領域：
本發明涉及微流控領域，特別提供了一種基於通道微流控晶片的秀麗隱杆線蟲單卵捕獲及長期培養的方法。
背景技術：
秀麗隱杆線蟲(Caenorhabditis elegans)是一種經典的模式生物,它被廣泛用於現代發育生物學、遺傳學、基因組學和神經生物學等領域。目前秀麗隱杆線蟲的培養主要在陣列微孔板中或瓊脂板上進行，即將線蟲培養於96孔板或瓊脂板，定期更換培養基或將線蟲轉移到新的瓊脂板上。雖然線蟲培養數量多，但是試劑和耗材消耗量大；針對線蟲的操作採用手工進行，費時費力，通量低；操作步驟較為繁瑣、複雜；難以實現對單個線蟲整個生命歷程的追蹤觀察。整體而言，隨著線蟲相關研究的發展，當前的模式生物技術的發展遠不能滿足現代生物醫藥研發的需要。開發一種新的更為高通量、自動化的單線蟲培養新平臺，實現培養技術的微型化、集成化和成本低廉化是未來發展的必然趨勢，也是藥物評價研究的發展需要。而近幾年發展起來的微流控晶片平臺恰恰可以滿足這些要求，並已成為重要的單線蟲研究工具之一。最近，微流控晶片因其與秀麗隱杆線蟲尺寸匹配、環境可控、通量高、易於實現自動化、集成化等特徵而成為線蟲相關研究的重要平臺，但仍為實現從卵開始的線蟲整個生命過程的培養。發明內容
本發明的目的在於提供一種操作簡單、通量高的，具體說是一種基於PDMS(聚二甲基矽氧烷)通道微流控晶片的秀麗隱杆線蟲單卵捕獲及長期培養方法。
本發明提供了一種微流控晶片，該微流控晶片的材料均為PDMS聚合物，採用PDMS 軟刻蝕及等離子體不可逆封接技術構建，由上、下兩層組成，上層為用於線蟲單卵捕獲及長期培養的液路層，下層為用於封接的空白PDMS層；
其中，液路層由100 200個線蟲分析功能單元組成，所有功能單元串聯連接；每個分析功能單元由線蟲卵及藥品入口、線蟲培養室組成，每個線蟲培養室中含有一個線蟲單卵捕獲器；
其中，線蟲單卵捕獲器位於線蟲培養室的中心軸上；線蟲卵及藥品入口通過進樣通道與線蟲培養室連接，多個培養室由一條主通道連接起來，最後連接到廢液池。
本發明提供的微流控晶片,所述線蟲培養室為橢圓形,長軸為2mm,短軸為Imm,高度為80 μ m。
本發明提供的微流控晶片，所述線蟲單卵捕獲器的尺寸由線蟲卵的大小和流體力學特徵所決定。所述線蟲單卵捕獲器前端寬為50 μ m,後端寬為30 μ m ;結構設計由由流體力學決定，線蟲單卵捕獲器後端傾斜角度為110°。
本發明還提供了一種基於所述微流控晶片的秀麗隱杆線蟲單卵捕獲及長期培養方法，線蟲進樣及培養方法為利用蠕動泵驅動的方式，將蟲卵懸浮液引入線蟲培養室；在流體力學的作用下，每個線蟲培養室可捕獲單個卵；在持續灌入培養液的條件下，卵孵化成幼蟲並長大，線蟲培養室的尺寸可使其在整個生命過程中自由遊動。
本發明有以下優點
(I)本發明採用通道設計，操作簡單，且易於實現物質交換，有利於線蟲的長期培養。
(2)採用通道灌流的方式進行食物添加及廢液排出，操作簡單，效率高，有利於線蟲的長期培養。
(3)培養室同樣作為線蟲單卵捕獲器，且捕獲方式對蟲卵無損傷，方法簡單，通量聞。
(4)單個培養室中培養單個線蟲的設計使得每隻蟲的壽命、運動行為及生理特徵得到實時及長期追蹤，可滿足生物研究的需要。
圖I晶片設計圖，從上到下依次為液路層、空白PDMS層；其中I為線蟲卵及藥品入口，2為廢液口 ；
圖2單個線蟲培養室放大圖，其中虛線框中3為線蟲單卵捕獲器，箭頭指示液流方丨口」；
圖3線蟲單卵捕獲多單元示意圖4線蟲單卵捕獲放大圖5捕獲後第I天晶片上線蟲(野生型N2)的生長(LI期)；
圖6捕獲後第3天晶片上線蟲(野生型N2)的生長(L3期)；
圖7捕獲後第5天晶片上線蟲(野生型N2)的生長(L4期)；
圖8捕獲後第7天晶片上線蟲(野生型N2)的生長(Adult期，並產卵)。
具體實施方式
下面的實施例將對本發明予以進一步的說明，但並不因此而限制本發明。
實驗室自行設計並製作的微流控晶片製備用於秀麗隱杆線蟲單卵捕獲及長期培養的微流控晶片材料為PDMS聚合物，等離子體不可逆封接，該晶片由兩層，上層為液路層， 下層為用於封接的空白PDMS。
液路層由100 200個線蟲分析功能單元組成，所有功能單元串聯連接；每個線蟲培養室為橢圓形，長軸為2mm，短軸為1mm，高度為80 μ m，(圖2)可捕獲單個卵，其中線蟲單卵捕獲器3(圖2)位於線蟲培養室的中心軸上，其尺寸由線蟲卵的大小和流體力學特徵所決定；線蟲卵及藥品入口 I (圖I)通過進樣通道與線蟲培養室連接，多個培養室由一條主通道連接起來，最後連接到廢液池2 (圖I)。
使用前事先灌好線蟲培養液K Medium。秀麗隱杆線蟲野生型蟲株N2在瓊脂板上培養至大蟲後,進行bleach操作將大量卵取出，並使加入到KMedium中形成蟲卵懸浮液。
實施例I
利用實驗室自行設計並製作的微流控晶片系統，構型如圖1、2所示，利用蠕動泵將線蟲卵懸浮液進樣到培養室中。晶片共100 200個單元，各個單元相互獨立，進樣互不幹擾，可達到單個培養室都只有單個卵。
實施例2
利用實驗室自行設計並製作的微流控晶片系統，將線蟲野生型N2擬合至成蟲期後進行bleach操作得到大量卵，將卵分散在K Medium中引入晶片中，單個線蟲卵被捕獲在單個培養室中，如圖3和圖4所示。捕獲後第I天，卵在K Medium培養基中孵化成LI期幼蟲，見圖5。經過培養，在第3天長到L3期，第5天長到L4期，第7天長成成蟲並產卵。線蟲在晶片上生長、運動、產卵等生理行為正常，顯示該晶片微環境適於線蟲長期培養，驗證了該平臺可行性。
權利要求
1.一種微流控晶片，其特徵在於該微流控晶片由上、下兩層組成，上層為液路層，下層為空白PDMS層； 其中，液路層由100 200個線蟲分析功能單元組成，所有功能単元串聯連接；每個分析功能單元由線蟲卵及藥品入口、線蟲培養室組成，每個線蟲培養室中含有ー個線蟲單卵捕獲器； 其中，線蟲單卵捕獲器位於線蟲培養室的中心軸上；線蟲卵及藥品入口通過進樣通道與線蟲培養室連接，多個培養室由一條主通道連接起來，最後連接到廢液池。
2.按照權利要求I所述的微流控晶片，其特徵在於所述線蟲培養室為橢圓形，長軸為2mm,短軸為1mm，高度為80 μ m。
3.按照權利要求I所述的微流控晶片，其特徵在於所述線蟲單卵捕獲器的尺寸由線蟲卵的大小和流體力學特徵所決定。
4.按照權利要求3所述的微流控晶片，其特徵在於所述線蟲單卵捕獲器前端寬為50 μ m,後端寬為30 μ m ;結構設計由流體力學決定，線蟲單卵捕獲器後端傾斜角度為110。。
5.按照權利要求I所述的微流控晶片，其特徵在於所述微流控晶片的材料均為PDMS聚合物，採用PDMS軟刻蝕及等離子體不可逆封接技術構建。
6.ー種基於權利要求I所述的微流控晶片的秀麗隱杆線蟲單卵捕獲及培養方法，其特徵在於線蟲進樣及培養方法為利用蠕動泵驅動的方式，將蟲卵懸浮液引入線蟲培養室；在流體力學的作用下，每個線蟲培養室可捕獲單個卵；在持續灌入培養液的條件下，卵孵化成幼蟲並長大，線蟲培養室的尺寸可使其在整個生命過程中自由遊動。
全文摘要
一種基於微流控晶片的秀麗隱杆線蟲單卵捕獲及培養方法，該晶片由兩層PDMS組成，上層為液路層，用於線蟲單卵捕獲、長期培養及觀測；下層為空白PDMS，與上層PDMS封接。該晶片利用微結構捕獲線蟲單個卵，並可在單個培養室中對其進行單獨培養。所述的微流控晶片平臺的線蟲單卵捕獲方法操作簡單，並易於在線蟲整個壽命周期內對其進行長期培養；該晶片可以實現營養物質的交換及代謝廢物的排出，有利於線蟲的長期培養，並可對單個線蟲進行行為及成像的長期觀察。
文檔編號B01L3/00GK102972351SQ201210439440
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月6日 優先權日2012年11月6日
發明者秦建華, 溫慧 申請人:中國科學院大連化學物理研究所