用於廣泛檢測工業產品中的生物體的一步實時rtpcr試劑盒的製作方法
2023-10-05 06:40:44 2
專利名稱：用於廣泛檢測工業產品中的生物體的一步實時rt pcr試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於檢測存在於藥物、化妝品和非臨床樣本中的細菌和真菌-酵母的方法和試劑的領域。
更加特別地，本發明涉及用於24小時內廣泛檢測滅菌或非滅菌的工業產品中的活細菌和真菌-酵母的一步實時RT PCR試劑盒的樣本製備、引物組、探針組以及方法。
背景技術：
使用特定的多核苷酸序列或肽核酸作為引物和/或探針來識別汙染物和感染試劑已經成為問題諸多的生長需求分析、可見(菌落)生長特徵、顯微形態學、染色反應和生化特性的重要替代。在大多數情況下，這些方法過於漫長，以致不能真正用於工業控制。
例如，1984年7月19日公開的PCT申請WO84/02721中描述了在雜交過程中使用與目標核酸序列互補的核酸探針來檢測目標核酸序列，這些目標序列由核糖體RNA、轉運RNA或其他RNA組成。雖然這些方法具有比已知的DNA雜交分析更高的靈敏度和特異性，但是雜交過程需要使用互補探針，這通常依賴於對試驗生物體的培養，因此，不適合於快速分析。
這些探針在用逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT PCR)擴增的RNA雜交中是有用的。RT-PCR是一種有效的核糖核酸擴增方法，可以被用於檢測少量來自體外培養困難或費時的細菌和/或真菌-酵母的核糖核酸靶點。RT PCR要求具有用於檢測的活樣本。在其最簡單的形式中，RT PCR是酶促合成特定cDNA序列的體外方法。使用一種與RNA鏈雜交並且位於目標cDNA的有意義區域的寡核苷酸引物，通過逆轉錄酶合成多種cDNA。重複一系列循環包括模板變性、引物退火和通過DNA聚合酶延伸被退火的引物，使得特定的片段指數性積累，該片段的末端由引物的5』端限定。PCR以10-12的倍數選擇性地富集特定的DNA序列。PCR方法在Saiki等，1985，Science 2301350中被描述，是美國專利4,683,195、4,683,202和4,800,159的申請主題(這些參考文獻在此引入作為參考)。這種方法被用於檢測與鐮刀狀細胞貧血症相關的β-球蛋白基因(Saiki等，1985，同上文)和人免疫缺陷病毒(HIV)RNA(Byrne等，1988，Nuc.Acids Res.164165)中存在的異常序列。
為了成功地去除滅菌或非滅菌的工業產品中由細菌或真菌-酵母引起的汙染，需要快速和精確的檢測。通常通過純培養物分離，接著通過藉助樣本來源、生長需求、可見(菌落)生長特徵、顯微形態學、染色反應和生物化學特性的知識的鑑別過程來檢測細菌和真菌-酵母。
顯然，對於目前所使用的方法來說，檢測工業樣本中的細菌和真菌-酵母時具有與培養方法相同靈敏度，並且少於24小時的快速診斷方法是一個顯著進步。
發明概述本發明涉及用於少於24小時內快速檢測滅菌和非滅菌的產品中的細菌和真菌-酵母的方法和試劑。
在優選實施方案中，來自RNA的一步逆轉錄酶聚合酶鏈式反應的目標區域以及得到的被擴增DNA用探針處理，該探針能夠與被擴增的細菌或真菌-酵母DNA雜交，但是不與其他生物體(哺乳動物、植物、昆蟲……)或病毒的DNA雜交。
Tth DNA聚合酶是一種熱穩定性酶，具有RNA-依賴的逆轉錄酶活性和DNA-依賴的聚合酶活性，可以在單一試管反應中進行RT和PCR，從而可以較快地分析細菌、真菌-酵母的RNA的存在。
採用一步實時逆轉錄酶聚合酶鏈式反應，無論在RT和PCR之間開啟試管以及來自由於先前在實驗室中進行的在先擴增反應而存在的可能PCR產物環境汙染物造成假陽性，本發明使得用戶能夠實施快速RT-PCR，同時通過監控實時聚合酶鏈式反應擴增中的螢光來檢測和定量細菌和/或真菌-酵母的RNA的存在。
發明詳述因此，本發明的方法能夠比現有技術中的檢測方法更加快速地確定細菌和/或真菌-酵母的存在。
採用一步實時逆轉錄酶聚合酶鏈式反應，無論在RT和PCR之間開啟試管以及來自由於先前在實驗室中進行的在先擴增反應而存在的可能PCR產物環境汙染物造成假陽性，本發明使得用戶能夠實施快速RT-PCR，同時通過監控實時聚合酶鏈式反應擴增中的螢光來檢測和定量細菌和/或真菌-酵母的RNA的存在。
基本的RT PCR操作按如下實施。
提供需要被測試或者懷疑含有特定有意義的核酸序列的樣本，「目標序列」。含有在樣本中的核酸首先被反轉錄為cDNA(使用酶如Tth DNA聚合酶作為被純化的酶以及寡核苷酸或PNA)，然後採用本領域技術人員知曉的物理方法使cDNA變性。用於鏈分離的優選物理方法包括加熱核酸直到其完全(＞99％)變性。採用熱穩定性DNA聚合酶擴增RNA目標的方法被描述在1990年12月21日申請的PCT/US90/07641中，其在此引入作為參考。
然後，在雜交條件下，在同一試管中，用所選擇的寡核苷酸引物溫育被變性的DNA鏈，該雜交條件使得引物能夠結合到單一的DNA鏈上。如本領域所知，選擇引物，以至於它們在雙鏈序列上的相對位置使得由一條引物合成的延伸產物從其補體上分離時可以作為另一條引物延伸的模板，從而獲得特定長度的複製鏈。
引物必須具有足夠長度。以在存在聚合試劑時能夠起始延伸產物的合成。引物的準確長度取決於多種因素，包括溫度、引物來源以及所用的方法。
用於本發明的優選寡核苷酸引物從如下選擇Seq ID No 1 TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA [正向引物]Seq ID No 2 TGCGGGACTTAACCCAACA [反向引物]Seq ID No 3 AGAGTTTGATCATGGCTCAGA [正向引物]Seq ID No 4 TTACCCCACCTACTAGCTAAT [反向引物]Seq ID No 5 GYGGAGCATGTGGYTTAATTCG [正向引物]Seq ID No 6 TTGCGCTCGTTRCGGGACTT[反向引物]Seq ID No 7 GGGAAACTCACCAGGTCCA [正向引物]
Seq ID No 8 CGTTATCGCAATTAAGCAGACA [反向引物]Seq ID No 9 GGTAACGGGGAATWAGGGTTC [正向引物]Seq ID No 10 TTGGGTAATTTGCGCGCCTG [反向引物]通用密碼子Y＝(C/T)，R＝(A/G)，W＝(A/T)然後，在由適當的鹽、金屬陽離子和pH緩衝體系組成的反應液中，通過聚合試劑催化寡核苷酸引物的模板依賴的延伸(存在足量的四種脫氧核糖核苷三磷酸鹽(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)或其類似物)。
合成產物是由模板鏈和引物延伸鏈組成的雙鏈分子，包括目標序列。這些產物輪流作為另一輪複製的模板。在第二輪複製中，第一個循環的引物延伸鏈與其互補引物退火；合成「短」產物，通過引物序列或其補體被結合到5』端和3』端上。重複變性、引物退火和延伸的循環，導致由引物限定的目標區域指數性聚集。進行足夠的循環來獲得期望含量的含有目標的核酸區域的多核苷酸。期望的含量是變化的，由產物多核苷酸所起的功能來決定。
以一步同時加入所有試劑的方式來實施PCR方法。
在優選方法中，以採用具有熱穩定性酶如Tth的自動操作來進行RTPCR反應。
所用的機器的類型可以從Roche Diagnostics(LigthCycler)、Cepheid(Smart Cycler，GeneXpert)、BioRad(Icycler)、CorbettResearch(Rotor-Gene)……購買得到以及被開發用於實時PCR分析和商業使用的最合適設備。
本領域的那些技術人員也將會意識到來自於預前存在用於緩衝液的水中的細菌的核酸引起的汙染並導致非特異性擴增的問題。減少這些問題的方法是採用適當的過濾系統來去除大於100bp的DNA鏈片段。使用前，所有用於RT PCR反應的試劑必須被處理過。
在PCR擴增過程中，通過用探針多核苷酸雜交來直接檢測目標多核苷酸，在嚴緊條件到低嚴緊條件和洗滌條件下，探針核苷酸與目標序列形成穩定的雜合物。
探針通常用非放射性標記體系標記，例如螢光素和衍生的體系。
因此，在一個實施方案中，本發明涉及用於確定在懷疑含有所述細菌和/或真菌的樣本中是否存在細菌或真菌-酵母核糖核酸(RNA)的方法和試劑盒，其中所述多核苷酸含有所選擇的目標區域，所述方法包括(a)在用DNA酶溫育後，在膜和/或DEAE樹脂上進行離心過濾，從多達1000ml的樣本中提取細菌或真菌-酵母核糖核酸(RNA)。
(b)在允許多核苷酸雜交到核糖核苷酸目標區域和所述聚合酶或如同Tth的酶用於cDNA合成的逆轉錄酶活性的條件下，用具有RNA依賴的逆轉錄酶活性和DNA依賴的聚合酶活性的熱穩定性酶，使得在單一試管反應中進行RT和PCR，例如Tth DNA聚合酶或類似於Tth DNA聚合酶的酶，以及具有選自如下的核酸序列的多核苷酸序列來溫育細菌或真菌-酵母核糖核酸(RNA)Seq ID No 2 TGCGGGACTTAACCCAACA [反向引物]Seq ID No 4 TTACCCCACCTACTAGCTAAT [反向引物]Seq ID No 6 TTGCGCTCGTTRCGGGACTT [反向引物]Seq ID No 8 CGTTATCGCAATTAAGCAGACA[反向引物]Seq ID No 10 TTGGGTAATTTGCGCGCCTG [反向引物]以及(c)用所述聚合酶例如Tth DNA聚合酶以及具有選自如下核苷酸序列的多核苷酸引物和探針，通過聚合酶鏈式反應擴增cDNA到可檢測水平Seq ID No 1 TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA[正向引物]Seq ID No 2 TGCGGGACTTAACCCAACA [反向引物]Seq ID No 3 AGAGTTTGATCATGGCTCAGA [正向引物]Seq ID No 4 TTACCCCACCTACTAGCTAAT [反向引物]Seq ID No 5 GYGGAGCATGTGGYTTAATTCG[正向引物]Seq ID No 6 TTGCGCTCGTTRCGGGACTT [反向引物]Seq ID No 7 GGGAAACTCACCAGGTCCA [正向引物]Seq ID No 8 CGTTATCGCAATTAAGCAGACA[反向引物]Seq ID No 9 GGTAACGGGGAATWAGGGTTC [正向引物]Seq ID No 10 TTGGGTAATTTGCGCGCCTG [反向引物]Seq ID No 11 TGCATGGYTGTCGTCAGCTCGTG [正向探針]Seq ID No 12 GAGTGGCGGACGGGTGAGTAA [正向探針]
Seq ID No 13 ACAGGTGGTGCATGGTTGTC [正向探針]Seq ID No 14 TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT[正向探針]Seq ID No 15 ACAGGTGCTGCATGGCTGTC [正向探針]Seq ID No 16 TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT[正向探針]Seq ID No 17 AGGATTGACAGATTGAGAGCTCTT [正向探針]Seq ID No 18 CGGAGAGGGAGCCTGAGAA [正向探針]Seq ID No 19 CGGCTACCACATCCAAGGAA [正向探針]通過Tth或者類似於Tth的酶的逆轉錄酶活性來合成cDNA目標序列，並且藉助一步實時RT-PCR，在同一試管中通過DNA聚合酶的DNA依賴的聚合酶活性擴增該目標序列。
更加特別地，用於檢測細菌的組合物包括由如下序列組成的多核苷酸引物和探針Seq ID No 1 TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA[正向引物]Seq ID No 2 TGCGGGACTTAACCCAACA [反向引物]Seq ID No 11 TGCATGGYTGTCGTCAGCTCGTG [正向探針]可替代地，用於檢測細菌的組合物包括由如下序列組成的多核苷酸引物和探針Seq ID No 3 AGAGTTTGATCATGGCTCAGA [正向引物]Seq ID No 4 TTACCCCACCTACTAGCTAAT [反向引物]Seq ID No 12 GAGTGGCGGACGGGTGAGTAA [正向探針]還使用包含如下組成的多核苷酸引物和探針的檢測細菌的組合物來實施本發明Seq ID No 5 GYGGAGCATGTGGYTTAATTCG[正向引物]Seq ID No 6 TTGCGCTCGTTRCGGGACTT [反向引物]Seq ID No 13 ACAGGTGGTGCATGGTTGTC [正向探針]Seq ID No 14 TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT[正向探針]Seq ID No 15 ACAGGTGCTGCATGGCTGTC [正向探針]Seq ID No 16 TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT[正向探針]本發明還涉及所述方法和試劑盒，其中用於檢測真菌-酵母的組合物包含由如下序列組成的多核苷酸引物和探針
Seq ID No 7 GGGAAACTCACCAGGTCCA [正向引物]Seq ID No 8 CGTTATCGCAATTAAGCAGACA [反向引物]Seq ID No 17 AGGATTGACAGATTGAGAGCTCTT [正向探針]可替代地，用於檢測真菌-酵母的組合物包含由如下序列組成的多核苷酸引物和探針Seq ID No 9 GGTAACGGGGAATWAGGGTTC[正向引物]Seq ID No 10 TTGGGTAATTTGCGCGCCTG [反向引物]Seq ID No 18 CGGAGAGGGAGCCTGAGAA [正向探針]Seq ID No 19 CGGCTACCACATCCAAGGAA [正向探針]用於檢測所有細菌和/或真菌-酵母的引物和探針的優選組合由如下序列組成Seq ID No 1+Seq ID No 2+Seq ID No 11或Seq ID No 3+Seq ID No 4+Seq ID No 12或Seq ID No 5+Seq ID No 6+Seq ID No 13+Seq ID No 14+SeqID No 15+Seq ID No 16或Seq ID No 7+Seq ID No 8+Seq ID No 17或Seq ID No 9+Seq ID No 10+Seq ID No 18+Seq ID No 19或Seq ID No 1+Seq ID No 2+Seq ID No 11+Seq ID No 7+Seq IDNo 8+Seq ID No 17或Seq ID No 3+Seq ID No 4+Seq ID No 12+Seq ID No 7+Seq IDNo 8+Seq ID No 17或Seq ID No 5+Seq ID No 6+Seq ID No 13+Seq ID No 14+SeqID No 15+Seq ID No 16+Seq ID No 9+Seq ID No 10+Seq IDNo 18+Seq ID No 19
如上所述，多核苷酸引物和探針可以是天然核酸或與核酸(DNA和RNA)雜交的肽核酸(PNA)。
RNA還可以被定量，並與來自例如大腸桿菌和假絲酵母屬的被定量的外鏈RNA比較。
為了提高特異性，提供如下探針核酸鹼基對數據。用於本發明的優選寡核苷酸探針選自如下構成的組Seq ID No 11 TGCATGGYTGTCGTCAGCTCGTG[正向探針]Seq ID No 12 GAGTGGCGGACGGGTGAGTAA [正向探針]Seq ID No 13 ACAGGTGGTGCATGGTTGTC [正向探針]Seq ID No 14 TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT [正向探針]Seq ID No 15 ACAGGTGCTGCATGGCTGTC [正向探針]Seq ID No 16 TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT [正向探針]Seq ID No 17 AGGATTGACAGATTGAGAGCTCTT [正向探針]Seq ID No 18 CGGAGAGGGAGCCTGAGAA[正向探針]Seq ID No 19 CGGCTACCACATCCAAGGAA [正向探針]由於在一步RT-PCR中，探針不會結合到RNA序列中逆轉錄酶合成cDNA的條帶上，因此，反向探針是不合適的。
本發明的優選寡核苷酸引物和探針的序列基於rRNA基因。用於檢測來自各種微生物的核酸的寡核苷酸rRNA基因已經在科技文獻中被描述。例如，通用的細菌探針在Wilson等，1990，J.ClinicalMicrobiology 281942-1946和Chem等，1989，FEMS MicrobiologyLetters 5719-24中被描述。
屬間和種間特異性探針的例子已經被描述在Barry等，1990，Biotechnology 8233-236，Atlas和Bej，「PCR操作方法和應用的指導」(PCR protocolsA guide to method and application)，第399-406頁和基因探針(Gen-probe)國際專利申請WO88/03957(這些文獻在此引入作為參考)。本申請要求保護的發明在所檢測的目標範圍(所有細菌-真菌-酵母)和應用重點(非臨床)方面區別於這些發明。
使用一組rRNA探針，包括通用細菌探針、革蘭氏陽性和革蘭氏陰性探針和種間和組間特異性探針，產生了臨床上有用的信息，而不是單一的通用細菌探針；由於不同的病理學、藥物和抗體治療方法被推薦用於各種細菌-真菌-酵母感染。
在這些在先專利中，通用的細菌探針僅被用於陽性對照。用於細菌-真菌-酵母的通用引物被用於擴增產物克隆和測序後的鑑定或者DNA晶片上的雜交。在本發明之前，還沒有描述過將rRNA目標用於滅菌對照來檢測滅菌或非滅菌工業產品中的活細菌和真菌-酵母。
用於細菌和真菌-酵母的一步RT PCR檢測的優選通用成對引物包括選自如下構成的組的探測核鹼基序列(probing nucleobasesequence)Seq ID No 1 TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA[正向引物]Seq ID No 2 TGCGGGACTTAACCCAACA [反向引物]Seq ID No 3 AGAGTTTGATCATGGCTCAGA [正向引物]Seq ID No 4 TTACCCCACCTACTAGCTAAT [反向引物]Seq ID No 5 GYGGAGCATGTGGYTTAATTCG[正向引物]Seq ID No 6 TTGCGCTCGTTRCGGGACTT [反向引物]Seq ID No 7 GGGAAACTCACCAGGTCCA [正向引物]Seq ID No 8 CGTTATCGCAATTAAGCAGACA[反向引物]Seq ID No 9 GGTAACGGGGAATWAGGGTTC [正向引物]Seq ID No 10 TTGGGTAATTTGCGCGCCTG [反向引物]用於檢測細菌和真菌-酵母的優選通用探針包含選自如下構成的組的探測核鹼基序列Seq ID No 11 TGCATGGYTGTCGTCAGCTCGTG [正向探針]Seq ID No 12 GAGTGGCGGACGGGTGAGTAA [正向探針]Seq ID No 13 ACAGGTGGTGCATGGTTGTC [正向探針]Seq ID No 14 TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT[正向探針]Seq ID No 15 ACAGGTGCTGCATGGCTGTC [正向探針]Seq ID No 16 TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT[正向探針]Seq ID No 17 AGGATTGACAGATTGAGAGCTCTT [正向探針]Seq ID No 18 CGGAGAGGGAGCCTGAGAA [正向探針]Seq ID No 19 CGGCTACCACATCCAAGGAA [正向探針]
本發明的探針和引物組、方法和試劑盒特別適合用於單一的或多元的一步RT PCR分析，其中樣本中的所有細菌和/或真菌-酵母活著被檢測並被定量。可以直接測定細菌和/或真菌-酵母的菌落形成單位(CFU)的總數。
如下的實施例用於說明本發明的各種方法和組合物的目的。
實施例1用於通過簡單過濾(可過濾液體)分析樣本的優選方法。
在用DNA酶溫育後，通過離心過濾，從多達1000mL的樣本中提取細菌或真菌-酵母核糖核酸的特異性。
1-通過以2000g離心(旋轉馬達)或真空泵，使液體樣本(多達1000mL)通過聚碳酸酯膜(達0,45μm)或PVDF膜(達0,45μm)或PES膜(達0,45μm)酶促溶解2-將濾膜轉移到含有1mL酶促溶解緩衝液的50mL滅菌試管中，然後在35℃±2℃下溫育1小時。
3-以2000g離心液體(溶解緩衝液)5分鐘。
或者機械溶解2-在600μL的培養液中復甦細菌和/或真菌-酵母。在37℃±1℃下溫育1小時。
3-加入xmg酸洗玻璃珠(直徑為100-500μm)和xμL溶解緩衝液。在Mixer Mills MM300(Retsch)中以最大速度破壞細胞90分鐘。
4-用商業試劑盒處理溶解產物來進行RNA純化。本發明的優選RNA提取試劑盒是工作檯MagNaPure LCTM(Roche Diagnostics)上的「MagNaPure LC RNA分離試劑盒II」。洗脫體積達100μL。在純化過程中用DNA酶溫育。
5-2μL(達5μL)的純化RNA提取物被用於一步實時RT-PCR(LightCyclerTM)，採用如Tth的酶和如下具有Taqman探針的程序I反轉錄61℃/20分鐘(20℃/秒)II變性 95℃/30秒(20℃/秒)
IIIPCR(35個循環) 95℃/5秒(20℃/秒60℃/30秒(20℃/秒)在60秒後，測定發射的螢光。
6-2μL(達5μL)的純化RNA提取物被用於一步實時RT-PCR(LightCyclerTM)，採用如Tth的酶和如下具有雜交探針(HybridizationProbe)的程序I反轉錄 61℃/20分鐘(20℃/秒)II變性95℃/30秒(20℃/秒)IIIPCR(35個循環) 95℃/2秒(20℃/秒58℃/8秒(20℃/秒)72℃/16秒(20℃/秒)在8秒後，測定發射的螢光。
實施例2用於通過離心分析樣本的優選方法(非可過濾液體)。通過離心，從多達1000mL的樣本中提取細菌或真菌-酵母核糖核酸的特異性。酶促溶解1-以11000g離心樣本5分鐘，棄去上清液。
2-將沉澱重懸在xμL溶解緩衝液中。搖晃並在37℃±1℃下溫育1小時。
3-加入xμL溶解緩衝液。搖晃並在50℃±2℃下溫育30分鐘。
或者機械溶解1-以11000g離心樣本5分鐘，棄去上清液。
2-將沉澱重懸在xμL溶解緩衝液中。
3-加入xmg酸洗玻璃珠(直徑為100-500μm)和xμL溶解緩衝液。在Mixer Mills MM300(Retsch)中以最大速度破壞細胞90分鐘。
4-用商業試劑盒處理溶解產物來進行RNA純化。本發明的優選RNA提取試劑盒是工作檯MagNaPure LCTM(Roche Diagnostics)上的「MagNaPure LC RNA分離試劑盒II」。洗脫體積達100μL。在純化過程中用DNA酶溫育。
5-2μL(達5μL)的純化RNA提取物被用於一步實時RT-PCR(LightCyclerTM)，採用如Tth的酶和如下具有Taqman探針的程序I反轉錄 61℃/20分鐘(20℃/秒)II變性95℃/30秒(20℃/秒)IIIPCR(35個循環) 95℃/5秒(20℃/秒60℃/30秒(20℃/秒)在60秒後，測定發射的螢光。
6-2μL(達5μL)的純化RNA提取物被用於一步實時RT-PCR(LightCyclerTM)，採用如Tth的酶和如下具有雜交探針(HybridizationProbe)的程序I反轉錄 61℃/20分鐘(20℃/秒)II變性95℃/30秒(20℃/秒)IIIPCR(35個循環) 95℃/2秒(20℃/秒58℃/8秒(20℃/秒)72℃/16秒(20℃/秒)在8秒後，測定發射的螢光。
實施例3用於通過直接溶解並在DiEthylAminoEthyl纖維素DEAE膜上回收RNA來分析樣本的優選方法(非可過濾液體)。在用DNA酶溫育後，通過在DEAE膜上離心溶解產物，從多達1000mL的樣本中提取細菌或真菌-酵母核糖核酸的特異性。
酶促溶解1-在樣本中加入xmL溶解緩衝液。搖晃並在35℃±2℃下溫育1小時。
2-加入xmL溶解緩衝液。搖晃並在50℃±2℃下溫育30分鐘。
或者機械溶解1-加入xmg酸洗玻璃珠(直徑為100-500μm)和xμL溶解緩衝液。
2-在Mixer Mills MM300(Retsch)中以最大速度破壞細胞90分鐘。
3-在完全溶解後，將溶解產物加到預過濾膜(聚丙烯10μm)上來截留大小超過10μm的顆粒。被過濾的溶液含有核酸。
4-將溶解產物加到預洗滌的DEAE膜上來截留所有核酸。離心並洗滌膜。
5-通過離心或使用真空泵，加入鹽(達1mL)來在滅菌的乾淨試管中回收核酸。
6-用商業試劑盒處理溶解產物來進行RNA純化。本發明的優選RNA提取試劑盒是工作檯MagNaPure LCTM(Roche Diagnostics)上的「MagNaPure LC RNA分離試劑盒II」。洗脫體積達100μL。在純化過程中用DNA酶溫育。
7-2μL(達5μL)的純化RNA提取物被用於一步實時RT-PCR(LightCyclerTM)，採用如Tth的酶和如下具有Taqman探針的程序I反轉錄 61℃/20分鐘(20℃/秒)II變性 95℃/30秒(20℃/秒)IIIPCR(35個循環) 95℃/5秒(20℃/秒60℃/30秒(20℃/秒)在60秒後，測定發射的螢光。
8-2μL(達5μL)的純化RNA提取物被用於一步實時RT-PCR(LightCyclerTM)，採用如Tth的酶和如下具有雜交探針(HybridizationProbe)的程序I反轉錄 61℃/20分鐘(20℃/秒)II變性 95℃/30秒(20℃/秒)IIIPCR(35個循環) 95℃/2秒(20℃/秒58℃/8秒(20℃/秒)72℃/16秒(20℃/秒)在8秒後，測定發射的螢光。
序列表110吉諾生命公司120用於廣泛檢測工業產品中的生物體的一步實時RT PCR試劑盒130D20782150US 60/425,3271512002-11-1216019170PatentIn version 3.2210121122212DNA213人工的220
221來源222(1)..(22)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″4001tggagcatgt ggtttaattc ga22210221119212DNA213人工的220
221來源222(1)..(19)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″4002tgcgggactt aacccaaca19210321121212DNA213人工的220
221來源222(1)..(21)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″4003
agagtttgat catggctcag a21210421121212DNA213人工的220
221來源222(1)..(21)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″4004ttaccccacc tactagctaa t21210521122212DNA213人工的220
221來源222(1)..(22)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″4005gyggagcatg tggyttaatt cg22210621120212DNA213人工的220
221來源222(1)..(20)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″4006ttgcgctcgt trcgggactt20210721119212DNA213人工的220
221來源222(1)..(19)
223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″4007gggaaactca ccaggtcca19210821122212DNA213人工的220
221來源222(1)..(22)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″4008cgttatcgca attaagcaga ca22210921121212DNA213人工的220
221來源222(1)..(21)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″4009ggtaacgggg aatwagggtt c212101021120212DNA213人工的220
221來源222(1)..(20)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″40010ttgggtaatt tgcgcgcctg202101121123212DNA213人工的
220
221來源222(1)..(23)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″40011tgcatggytg tcgtcagctc gtg232101221121212DNA213人工的220
221來源222(1)..(21)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″40012gagtggcgga cgggtgagta a212101321120212DNA213人工的220
221來源222(1)..(20)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″40013acaggtggtg catggttgtc202101421122212DNA213人工的220
221來源222(1)..(22)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″40014tcagctcgtg tcgtgagatg tt22
2101521120212DNA213人工的220
221來源222(1)..(20)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″40015acaggtgctg catggctgtc202101621122212DNA213人工的220
221來源222(1)..(22)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″40016tcagctcgtg ttgtgaaatg tt222101721124212DNA213人工的220
221來源222(1)..(24)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″40017aggattgaca gattgagagc tctt242101821119212DNA213人工的220
221來源222(1)..(19)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″40018
cggagaggga gcctgagaa192101921120212DNA213人工的220
221來源222(1)..(20)223/注釋＝″人工序列的描述寡核苷酸引物″40019cggctaccac atccaaggaa20
權利要求
1.用於檢測在懷疑含有所述細菌和/或真菌的樣本中存在的細菌或真菌-酵母核糖核酸(RNA)的方法和試劑盒，其中所述多核苷酸包含所選擇的目標區域，所述方法包括(a)在用DNA酶溫育後，在膜和/或DEAE樹脂上進行離心過濾，從多達1000ml的樣本中提取細菌或真菌-酵母核糖核酸(RNA)，(b)在允許多核苷酸雜交到核糖核苷酸目標區域和所述聚合酶和用於cDNA合成的所述的DNA聚合酶的逆轉錄酶活性的條件下，用具有RNA依賴的逆轉錄酶活性和DNA依賴的聚合酶活性的熱穩定性酶，使得在單一試管反應中進行RT和PCR，例如Tth DNA聚合酶，以及具有選自如下的核苷酸序列的多核苷酸引物來溫育細菌或真菌-酵母核糖核酸(RNA)Seq ID No 2TGCGGGACTTAACCCAACA [反向引物]Seq ID No 4TTACCCCACCTACTAGCTAAT[反向引物]Seq ID No 6TTGCGCTCGTTRCGGGACTT [反向引物]Seq ID No 8CGTTATCGCAATTAAGCAGACA [反向引物]Seq ID No 10 TTGGGTAATTTGCGCGCCTG [反向引物]以及(c)用所述DNA聚合酶以及具有選自如下核苷酸序列的多核苷酸引物和探針，通過聚合酶鏈式反應擴增cDNA到可檢測水平Seq ID No 1TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA[正向引物]Seq ID No 2TGCGGGACTTAACCCAACA [反向引物]Seq ID No 3AGAGTTTGATCATGGCTCAGA [正向引物]Seq ID No 4TTACCCCACCTACTAGCTAAT [反向引物]Seq ID No 5GYGGAGCATGTGGYTTAATTCG[正向引物]Seq ID No 6TTGCGCTCGTTRCGGGACTT [反向引物]Seq ID No 7GGGAAACTCACCAGGTCCA [正向引物]Seq ID No 8CGTTATCGCAATTAAGCAGACA[反向引物]Seq ID No 9GGTAACGGGGAATWAGGGTTC [正向引物]Seq ID No 10 TTGGGTAATTTGCGCGCCTG [反向引物]Seq ID No 11TGCATGGYTGTCGTCAGCTCGTG [正向探針]Seq ID No 12GAGTGGCGGACGGGTGAGTAA [正向探針]Seq ID No 13ACAGGTGGTGCATGGTTGTC [正向探針]Seq ID No 14TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT[正向探針]Seq ID No 15ACAGGTGCTGCATGGCTGTC [正向探針]Seq ID No 16TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT[正向探針]Seq ID No 17AGGATTGACAGATTGAGAGCTCTT [正向探針]Seq ID No 18CGGAGAGGGAGCCTGAGAA [正向探針]Seq ID No 19CGGCTACCACATCCAAGGAA [正向探針]。
2.根據權利要求1所述的方法和試劑盒，其中通過如同Tth聚合酶的酶的逆轉錄酶活性來合成的cDNA目標序列，通過一步實時RT-PCR，在同一試管中通過DNA聚合酶的DNA依賴的聚合酶活性來擴增。
3.根據權利要求1和2所述的方法和試劑盒，其中用於檢測細菌的組合物包括由如下序列組成的多核苷酸引物和探針Seq ID No 1TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA [正向引物]Seq ID No 2TGCGGGACTTAACCCAACA [反向引物]Seq ID No 11 TGCATGGYTGTCGTCAGCTCGTG [正向探針]。
4.根據權利要求1和2所述的方法和試劑盒，其中用於檢測細菌的組合物包括由如下序列組成的多核苷酸引物和探針Seq ID No 3AGAGTTTGATCATGGCTCAGA [正向引物]Seq ID No 4TTACCCCACCTACTAGCTAAT [反向引物]Seq ID No 12 GAGTGGCGGACGGGTGAGTAA [正向探針]。
5.根據權利要求1和2所述的方法和試劑盒，其中用於檢測細菌的組合物包含由如下序列組成的多核苷酸引物和探針Seq ID No 5GYGGAGCATGTGGYTTAATTCG [正向引物]Seq ID No 6TTGCGCTCGTTRCGGGACTT[反向引物]Seq ID No 13 ACAGGTGGTGCATGGTTGTC[正向探針]。Seq ID No 14TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT[正向探針]Seq ID No 15ACAGGTGCTGCATGGCTGTC [正向探針]Seq ID No 16TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT[正向探針]。
6.根據權利要求1和2所述的方法和試劑盒，其中用於檢測真菌-酵母的組合物包含由如下序列組成的多核苷酸引物和探針Seq ID No 7GGGAAACTCACCAGGTCCA[正向引物]Seq ID No 8CGTTATCGCAATTAAGCAGACA [反向引物]Seq ID No 17 AGGATTGACAGATTGAGAGCTCTT [正向探針]。
7.根據權利要求1和2所述的方法和試劑盒，其中用於檢測真菌-酵母的組合物包含由如下序列組成的多核苷酸引物和探針Seq ID No 9GGTAACGGGGAATWAGGGTTC [正向引物]Seq ID No 10 TTGGGTAATTTGCGCGCCTG [反向引物]Seq ID No 18 CGGAGAGGGAGCCTGAGAA[正向探針]Seq ID No 19 CGGCTACCACATCCAAGGAA [正向探針]
8.根據權利要求1-6的任何一項所述的方法和試劑盒，其中用於檢測所有細菌和/或真菌-酵母的引物和探針的優選組合由如下序列組成Seq ID No 1+Seq ID No 2+Seq ID No 11或Seq ID No 3+Seq ID No 4+Seq ID No 12或Seq ID No 5+Seq ID No 6+Seq ID No 13+Seq ID No 14+SeqID No 15+Seq ID No 16或Seq ID No 7+Seq ID No 8+Seq ID No 17或Seq ID No 9+Seq ID No 10+Seq ID No 18+Seq ID No 19或Seq ID No 1+Seq ID No 2+Seq ID No 11+Seq ID No 7+Seq IDNo 8+Seq ID No 17或Seq ID No 3+Seq ID No 4+Seq ID No 12+Seq ID No 7+Seq IDNo 8+Seq ID No 17或Seq ID No 5+Seq ID No 6+Seq ID No 13+Seq ID No 14+SeqID No 15+Seq ID No 16+Seq ID No 9+Seq ID No 10+Seq IDNo 18+Seq ID No 19。
9.根據權利要求1-8任一項所述的方法和試劑盒，其中多核苷酸引物和探針可以是天然核酸或與核酸(DNA和RNA)雜交的肽核酸(PNA)。
10.根據權利要求1-9的任何一項所述的方法和試劑盒，還定量這種RNA來與來自例如大腸桿菌和假絲酵母屬的被定量的外鏈標準RNA比較。
全文摘要
本發明涉及一種用於一步實時逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT－PCR)的新的樣本製備、探針、成對引物組，用於廣泛檢測藥物、化妝品和非臨床樣本中的活細菌和/或真菌－酵母的方法和試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1711357SQ200380103046
公開日2005年12月21日 申請日期2003年11月3日 優先權日2002年11月12日
發明者F·肖布龍, A·C·馬丁－明維利, S·格魯龍 申請人:吉諾生命公司