抗fgfr2的抗體及其用途

2023-05-28 00:08:01 2

抗fgfr2的抗體及其用途
【專利摘要】本發明提供了抗體或其抗原結合抗體片段或其變體，其在結合至過表達FGFR2的細胞和表達突變的FGFR2的細胞中的FGFR2之後，降低FGFR2的細胞表面表達。本發明還提供了基於抗體的用於FGFR2相關的疾病或病症例如癌症的療法。本發明的抗體還可用於診斷領域。本發明還提供了編碼前述抗體的核酸序列、含有所述核酸序列的載體、藥物組合物和具有使用說明書的試劑盒。
【專利說明】抗FGFR2的抗體及其用途

【技術領域】
[0001] 本發明提供特異性針對成纖維細胞生長因子受體2(FGFR2)的重組抗原結合區域 和抗體以及含有這類抗原結合區域的功能片段。
[0002] 因此，所述抗體可用於治療與FGFR2的表達相關的腫瘤和其他障礙和病症。本發 明還提供了編碼前述抗體的核酸序列、含有所述核酸序列的載體、藥物組合物和具有使用 說明書的試劑盒。

【背景技術】
[0003] 基於抗體的療法被證明可非常有效的治療多種癌症，包括實體瘤。例如， HERCEPTIN?已經被成功用於治療乳腺癌，MTUXAN敎在B細胞相關的癌症類 型中有效。開發成功的基於抗體的療法的關鍵是分離抗優先在腫瘤細胞上表達的細胞表面 蛋白的抗體。
[0004] 成纖維細胞生長因子受體是酪氨酸受體激酶（RTK)，在哺乳動物中已知其中的四 種（FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4)。鑑定了 22種作為配體的人成纖維細胞生長因子（FGF) (Eswarakumar and Schlessinger, Cytokine&Growth Factor Reviews2005, 16:139-149 ； Shimada et al. , Proc Natl Acad Sci USA2001, 98:6500-6505)。FGFR 由 3 個細胞外的免疫 球蛋白（Ig)樣結構域（D1-D3,其中結構域2和3為配體結合所必需），單個跨膜結構域和 含有催化蛋白酪氨酸激酶核心的細胞質結構域組成（參見圖1的圖示）。細胞外部分另 外包含酸性盒（AB)和肝素結合位點（HBS)(參見圖1)。RTK的FGFR家族的重要標誌是 存在多種可變剪接的變體。全長FGFR2稱作FGFR2a，而缺少D1的同種型（isotype)稱 作FGFR20 (圖1)。結構域3中的可變剪接導致2種不同的變體，即含有外顯子7和8的 FGFE2IIIb，和含有外顯子7和9的FGFR2IIIC (圖1)。後者的剪接影響配體結合，導致特 異性模式。FGFR2IIIC主要由間充質細胞表達，FGFR2IIIb主要由上皮細胞表達。FGF7也 被稱作角化細胞生長因子（KGF)，僅結合FGFR2IIIb，因此FGFR2IIIb也被稱作KGFR。FGF 與其受體結合後，隨後發生FGFR的二聚化作用和磷酸化作用以及經由FRS-GRB2停靠蛋白 複合體的下遊信號傳導至RAS-MPK信號傳導級聯和PI3K-AKT信號傳導級聯。所述第一個 信號傳導級聯參與細胞生長和分化，後者參與細胞存活和命運決定（Katoh and Katoh，Int J 0ncol2006, 29:163-168)。
[0005] 所有四種受體（FGFR1-FGFR4)及其剪接變體通過不同的FGF進行的協調信號傳導 是胚胎發育過程中適當的器官發生所必需的（Ornitz et al·，Genome Biol2001，2:3005)。 在FGFR2的情形中，缺少所有FGFR2變體可導致胎盤和肢芽形成方面的缺陷，因而在E10. 5 導致死亡。特異性敲除FGFR2IIIb還導致死亡（在P0)，這與肺、垂體前葉、甲狀腺、牙齒和 四肢的發育不全相關，而破壞FGFR2IIIC變體是能存活的，同時顯示出骨化延遲、成比例的 矮小和頡底的骨連結（Eswarakumar and Schlessinger, 2005)。人的FGFR2的種系活化突 變在胚胎發生過程中導致嚴重的畸形，例如阿佩爾症候群或斐弗症候群中的冠狀顱縫早閉 和盧頁縫早閉（Robin et al.，in Gene Reviews, NCBI Bookshelf Washington, edts. Pagon et al.，1993)。在成年人中，FGFR2信號傳導參與傷口癒合、上皮修復以及皮膚和黏膜的細胞 保護作用（Braun et al.，Phil Trans R Soc Lond B2004, 359:753-757)，以及損傷肝臟的再 生（Steiling et al.，0ncogene2003, 22:4380-4388 ; Biihm, dissertation, Swiss Federal Institute of Technology Zurich, 2009)。FGFR2信號傳導在梗死形成後心外膜衍生細胞 (ETOC)向心臟中遷移的過程中的作用尚在討論中，這是因為在胚胎發生過程中，FGF10/ FGFR2信號傳導是EPDC在緻密心肌膜中遷移所必需的，該過程是完整的心臟發育所必需 的（Vega-Herncindez et al·，Development2011:3331-3340 ;Winter and De Groot, Cell Mol Life Sci2007, 64:692-703)。
[0006] 相反，通過FGFR2進行的種系非依賴性信號傳導參與不同病症，例如痤 瘡（Katoh，J of Invest Dermatol2009, 129:1861-1867)、銀屑病（Finch et al.，Am J Pathol 1997，151:1619-1628;Xu et al.，J Invest Dermatol2011:131:1521-1529)、 牙周炎（Li et al.，JPeridontal Res2005,40:128-138)、曬斑（solar lentigine) (Lin et al·，Journal Dermatol Sci2010，59:91-97)、腸病（Brauchle et al.，JPatholl996，149:521_529)、子宮內膜異位（Taniguchietal.，Fertil Steril2008, 89:478-480)、膽脂瘤（Yamamoto-Fukuda et al·，Eur Arch Otorhinolaryngol ( 2008)265:1173 - 1178 ;d，Alessandro et al·，0tol Neurotol. 2010S印；31 (7) :1163-9)、膽 脂瘤型慢性中耳炎（Yamamoto-Fukuda et al·，0tol Neurotol. 2010Jul ;31 (5) :745-51)、動 脈粥樣硬化（Che et al·，Am J Physiol Heart Circ Physiol300:H154 - H161, 2011)和癌症 (參見下文）。
[0007] 已公開了數篇研究，強調了 FGFR2表達與癌症患者的不良結果之間的較強關聯：
[0008] FGFR2和/或KGF的過表達與胃癌的擴張性生長和患者的更短存活時間 相關（Matsunobu et al·，Int J Cancer2006, 28:307-314;Toyokawa et al·，Oncol R印orts2009, 21:875-880)。因此在31-36. 5%的所有測試的胃癌樣品中檢測到FGFR2 的過表達（Matsunobu et al·，Int J Cancer2006, 28:307-314 ;Toyokawa et al·，Oncol R印orts2009, 21:875-880)。腺癌（所有胃癌的70%)進一步分為兩種不同的病理學類型， 即腸型胃癌和彌散型胃癌。有趣的是，前一種攻擊性較小的類型與活化的ErbB2致癌通路 相關，而後一種攻擊性更強的表型在FGFR2/PI3K通路中包含畸變（Yamashita et al.，Surg Today2011，41:24-38)。大約60%的胃腺癌屬於彌散型，其餘40%屬於腸型（Werner et al·，J Cancer Res Clin 0ncol2001, 127:207-216)。FGFR2 過表達存在於 53% 的彌散型胃癌 樣品中（Yamashita et al· , Surg Today2011, 41:24-38)。綜合所有數據，HER2 和 FGFR2 過 表達似乎發生在2種不同的患者群體中。可能地，FGFR2的表達部分地是由於基因擴增引 起的，這是因為FGFR2的擴增可存在於大約7-10%的原發性胃癌中（Kunii et al.Cancer Res2008, 68:23-40-2348)。此外，FGFR2不僅只是在轉移癌中存在，而且甚至在轉移癌中比 在原發性腫瘤中更強（Yamashita et al·，Surg Today2011, 41:24-38)。
[0009] 在乳腺癌中，FGFR2IIIb表達存在於57%的腫瘤樣品中，但幾乎不存在於健康 組織中（Tamaruetal. 2004, 84:1460-1471)。KGF(FGF7)存在於 45 % 的樣品中，通常與 FGFR2IIIb同時存在。當與既不表達FGF7也不表達FGFR2IIIb的原發性乳腺癌相比時， FGF7和其唯一的受體FGFR2IIIb的共表達與原發性腫瘤中的凋亡細胞數目顯著減少相 關（Tamaru et al. 2004, 84:1460-1471)。與在胃癌中相同，在乳腺癌中基因擴增也存在 於：4%的三陰性乳腺癌（TNBC)中（Turner et al.0ncogene2010, 29:2013-2023)。在乳腺 癌中鑑定出一些小核多態性（SNP)，SNP與增加的乳腺癌風險相關（Hunter et al. Nature Genetics2007,6:870-874)。如果SNP位於內含子2中，則導致FGFR2的轉錄上調（Katoh Expert Reviews2010, 10:1375-1379)。有趣的是，FGFR1優先在ER陽性的乳腺癌中上調，而 FGFR2 優先在 ER 陰性的乳腺癌中上調（Katoh, Expert Reviews2010, 10:1375-1379)。
[0010] 在胰腺癌中，FGFR2IIlb和/或FGF7的過表達與靜脈浸潤強相關（Cho et al.，Am J Pathol 170:1964-1974)，藉此FGFR2和FGF7的共表達存在於腫瘤細胞中， 但是甚至更加大量的存在於與腫瘤細胞相鄰的間充質細胞中（Ishiwata et al.，Am J Patholl998, 153:213-222)。
[0011] 在上皮卵巢癌中，與正常組織相比，80%的測試情形中存在FGFR2的上調，70%的 測試情形中 FGF7 存在於腹水中（Steele et al·，0ncogene20:5878-5887)。
[0012] FGFR2蛋白存在於所有測試的浸潤性宮頸癌中，在腫瘤的浸潤性前端強烈表達 (Kawase et al. , Int J 0ncol2010, 36:331-340) 〇
[0013] 在肺腺癌中，FGF7和FGFR2的共表達存在於51. 6%的測試的情形中，與較低 的分化等級、更高的增殖率、淋巴結轉移和更短的5年存活率相關（Yamayoshi et al.，J Pathol2004, 204:110-118)。
[0014] 在子宮內膜癌中，FGFR2的最頻繁的活化突變存在於大約16%的子宮內膜癌中 (Pollock et al·，0ncogene2007, 26:7158-7162)。
[0015] 在食管癌（EC)中，癌細胞中的FGF7和FGFR2的共表達存在於26%的患者中，這與 更短的存活趨勢相關（Yoshino et al·，Int J 0ncol2007, 31:721-728)。
[0016] 在肝細胞癌中，FGFR2表達在低分化的腫瘤中被上調了 4. 7倍。該表達與門靜脈 浸潤的發生和更短的無疾病生存時間相關（Harimoto et al·，0ncology2010, 78:361-368)。
[0017] 一些具有體外和體內的實驗數據的出版物證實異常的FGFR2信號傳導和腫瘤進 展之間的因果關係：
[0018] 敲低和/或抑制胃（Takeda et al· , Clin Cancer Res2007 ;13:3051-3057 ;Kunii et al· , Cancer Res2008 ;68:2340-2348)、乳腺（Turner et al· 0ncogene2010, 29:2013-2023)、 卵巢（Cole et al· , Cancer Biol Ther2010, 10:495-504)和頭頸鱗狀上皮細胞（Marshall et al., Clin Cancer Res2011, 17:5016-5025)的癌細胞中的FGFR2,導致腫瘤細胞的增殖 降低和/或凋亡增加。同樣，在腫瘤異種移植物中，在過表達FGFR2的腫瘤細胞系中敲 低 FGFR2 和抑制 FGFR2,顯示對胃（Takeda et al·，Clin Cancer Res2007 ;13:3051-3057) 和卵巢（Cole et al·，Cancer Biol Ther2010, 10:495-504)癌細胞系的生長抑制。此 夕卜，僅激活FGFR2的FGF7可在體外和在體內增加胃（Shin et al·，J Cancer Res Clin 0ncol2002, 128:596 - 602)、乳腺（Zhang et al·，Anticancer Resl998, 18:2541-2546)和卵 巢（Cole et al.，Cancer Biol Ther2010, 10:495-504)癌細胞系的增殖。此外，在含有具有 激活突變的FGFR2的子宮內膜癌細胞系中敲低FGFR2還導致細胞周期停止並誘導細胞死亡 (Byron et al. , Cancer Res2008, 68:6902-6907) 〇
[0019] FGFR2 信號傳導在體外促進胃（Shin et al· , J Cancer Res Clin 0ncol2002, 128:596 - 602)、乳腺（Zhang et al·，Anticancer Resl998, 18:2541-2546) 和膜腺癌細胞系（Nomura et al·，Br J Cancer2008, 99:305-313 ;Niu et al·，J Biol Chem2007, 282:6601-6011)的遷移和侵入。
[0020] 在食管癌中，FGFR2是腫瘤相關的成纖維細胞中上調最高的基因。分離的腫瘤 相關的成纖維細胞釋放出促進食管癌細胞增殖的可溶性因子（Zhang et al.，hum Cancer Biol2009, 15:4017-4022)，表明由間充質細胞表達的FGFR2也可促進腫瘤進展。
[0021] 僅報導了有限量的抗FGFR2的抗體。Fortin et al. (J. Neurosci. 2005, 25:7470-7479)描述 了封閉性的抗 FGFR2 的抗體。Wei et al. (Hybridoma2006, 25:115-124)展示了僅特異性針對FGFR2IIIb的可抑制FGF誘導的 細胞增殖的抗體。在W02007/144893中，公開了結合FGFR2和FGFR3的抑制性抗體。在 W02010/054265 和 Zhao et al· (Clin Cancer Res. 2010, 16:5750-5758)中，公開了抑制 FGF 結合的抗體。Bai et al· (Cancer Res. 2010, 70:7630-7639)描述了特異性針對 FGFR2IIIb 的抗體。R&D Systems出售在FGFR2測定法中中和活性的抗FGFR2的抗體。
[0022] 總之，已知一些FGFR2剪接變體。此外，已知FGFR2相關的疾病是由於FGFR2的異 常表達例如過表達或擴增引起的，或是由於多種突變的FGFR2蛋白引起的。但是，仍然缺乏 可以解決多種不同的FGFR2相關疾病的療法。


【發明內容】

[0023] 本發明涉及提供抗體或其抗原結合抗體片段或其變體，其在結合至過表達FGFR2 的細胞和表達突變的FGFR2的細胞中的FGFR2之後，降低FGFR2的細胞表面表達。本發明 還提供了基於抗體的療法，所述療法用於FGFR2相關的疾病或病症，例如癌症，特別是用於 表達FGFR2的腫瘤，例如胃癌、乳腺癌、胰腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、前列腺癌、卵巢癌、宮 頸癌、肺癌、非小細胞肺癌（NSCLC)、子宮內膜癌、食管癌、頭頸癌、肝細胞癌、黑色素瘤和膀 胱癌。
[0024] 本發明還涉及編碼本發明的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸，表達本發明的抗 體或其抗原結合片段的細胞，用於產生本發明的抗體或其抗原結合片段的方法，用於使用 本發明的抗體或其抗原結合片段抑制發育異常的細胞的生長的方法，用於使用本發明的抗 體或其抗原結合片段治療和檢測癌症的方法。
[0025] 本發明描述了抗體，其與現存的FGFR2抗體的區別在於它們在與過表達FGFR2的 細胞和表達突變的FGFR2的細胞中的FGFR2結合之後，降低FGFR2的細胞表面表達。本發 明的實施方案是結合FGFR2的細胞外N末端表位CRPSFSLVEDTTLEPE 15) (SEQ ID N0:63)的 抗體或其抗原結合片段。本發明的抗體或其抗原結合片段a)在短時間內激活FGFR2，b)誘 導FGFR2的內化，c)導致有效的降解，d)使表達FGFR2的癌細胞或腫瘤細胞脫敏以及e)最 終導致這些抗體在體內腫瘤實驗中的抗腫瘤活性。本發明的這些和其他目的在本文中更加 詳細地描述。
[0026] 本發明的抗體可以與已知藥物共同給藥，在一些實例中所述抗體自身可以被修 飾。例如，抗體可綴合至細胞毒性試劑、免疫毒素、毒性基團或放射性同位素，以有可能進一 步增加效能。
[0027] 本發明還提供了構成用於診斷惡性或發育不良病症的工具的抗體，在所述病症 中，FGFR2表達與正常組織相比有所提高，或者FGFR2從所述細胞表面脫落並且變得可以在 血清中檢測到。提供了綴合至可檢測的標記物的抗FGFR2的抗體。優選的標記物為放射性 標記、酶、生色團或螢光劑。
[0028] 本發明還涉及編碼本發明的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸，表達本發明的抗 體或其抗原結合片段的細胞，用於產生本發明的抗體或其抗原結合片段的方法，用於使用 本發明的抗體或其抗原結合片段抑制發育不良的細胞的生長的方法，和使用本發明的抗體 或其抗原結合片段用於治療和檢測癌症的方法。
[0029] 本發明還涉及分離的核酸序列，每個所述分離的核酸序列可編碼上述的特異性針 對FGFR2的表位的抗體或其抗原結合片段。本發明的核酸適用於重組生產抗體或抗原結合 抗體片段。因此，本發明還涉及含有本發明的核酸序列的載體和宿主細胞。
[0030] 本發明的組合物可用於治療性或預防性的應用。因此，本發明包括藥物組合物，所 述藥物組合物包含本發明的抗體或其抗原結合片段和可藥用的載體或賦形劑。在相關方面 中，本發明提供了用於治療與不希望存在的表達FGFR2的細胞相關的疾病或病症的方法。 在優選的實施方案中，前述的疾病為癌症。這類方法包括給予有需求的受試者有效量的所 述藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含本文記載的或考慮到的本發明的抗體。
[0031] 本發明還提供了用於使用抗體文庫以分離特異性結合FGFR2的一個或多個這類 文庫的成員的說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1 :FGFR2結構的示意圖。比較性地示出了 a (SEQIDN0:61)和β (SEQIDN0:62) 剪接變體。所述圖示出了 3個Ig樣結構域（D1、D2和D3)、跨膜結構域（TM)和細胞內激酶 結構域。標明了肝素結合位點（HBS)、酸性盒（AB)和可變的Illb/IIIc部分結構域。氨基 末端由N標記，羰基末端由C標記。本發明的抗體的結合表位用條紋表示。
[0033] 圖2 :與10μ g/ml的抗FGFR2的抗體短時間（15min)孵育後，MFM223中磷酸化 FGFR2(P-FGFR2)水平的誘導。Y為"未處理的對照細胞的％"。如圖所示，與未處理的對照 細胞相比，抗體 M048-D01-hIgGl 和 M047-D08-hIgGl 使 P-FGFR2 的 ELISA 信號增加了 4 倍。 與之相反，在短時間孵育後所述對照IgG抗體和可商購自R&D的抗FGFR2的抗體（MAB665、 MAB684、MAB6843)都未表現出任何對P-FGFR2水平的顯著效應。這些結果揭示了在短時間 孵育後本發明中描述的抗FGFR2的抗體對FGFR2的對抗效應。
[0034] 圖3 :與10 μ g/ml的抗FGFR2的抗體長時間（24小時）孵育後，MFM223細胞對 FGF7 (25ng/ml，15min)介導的對P-FGFR2水平的誘導脫敏。Y為"未處理的對照細胞的％ "。 如圖所示，抗體M048-D01-hIgGl和M047-D08-hIgGl非常顯著地降低了 FGF7刺激後可達到 的P-FGFR2的水平。在不用抗體處理方法處理的細胞中以及在用同種型對照IgG處理的細 胞中，使用FGF7的刺激導致P-FGFR2水平增加約4倍。與之相反，在用抗FGFR2的抗體預 處理24小時的樣品中，FGF7僅將P-FGFR2水平誘導了 1. 37-1. 4倍。
[0035] 總之，這些結果表明延長細胞與本發明的抗FGFR2的抗體的孵育時間導致對使用 FGF7的刺激的脫敏作用。
[0036] 圖4 :與10 μ g/ml的抗FGFR2的抗體孵育4. 5小時後，具有FGFR2過表達（MFM223、 SNU16)或FGFR2突變（AN3-CA、MFE-296)的細胞系中FGFR2表面表達的下調（通過FACS 分析測量）。Y為"對照細胞的％ "。如圖所示，抗體M048-D01 -hI gG 1和M047-D08-hI gG 1 是僅有的在過表達FGFR2的細胞系（MFM223、SNU16)和具有FGFR2突變的細胞系（AN3-CA、 MFE-296)中降低FGFR2表面表達的抗體。抗體例如MAB684和MAB6843(R&D)僅在不過表 達FGFR2的細胞系中降低FGFR2表面表達。抗體例如GAL-FR21在具有FGFR2突變的細胞 系中不降低FGFR2表面表達。
[0037] 圖5 :在SNU16細胞中用抗FGFR2的抗體進行長時間（96小時）孵育後總 FGFR2水平的下調。Y為"對照細胞的％"。X為"抗體濃度[yg/ml]"。如圖所示，抗體 M048-D01-hIgGl (白色）和M047-D08-hIgGl (條紋）在96小時後以劑量依賴的方式顯著降 低了總FGFR2水平。未結合的對照抗體（黑色）未表現出任何效應。這些結果表明抗FGFR2 的抗體M048-D01-hIgGl和M047-D08-hIgGl不僅導致表面FGFR2水平的短期降低，還導致 總FGFR2水平的長期降低。
[0038] 圖6 :M048-D01-hIgGl和M047-D08-hIgGl在結合至表達內源性FGFR2的細胞後特 異性內化作用的時間進程的顯微評價。Y為"顆粒計數/細胞"。X為"時間[min]"。在乳 腺癌細胞系SUM52PE上研究了抗體（2. 5 μ g/ml)的內化作用。在乳腺癌細胞系SUM52PE上 研究抗體的內化作用。顆粒計數/細胞是以動態方式中測量。如圖所示，增加的顆粒計數/ 細胞表明，抗體M048-D01-hIgGl (黑色正方形和實線）和M047-D08-hIgGl (黑色三角形和 虛線）表現出快速的內化。同種型對照抗體（星型和虛線）未表現出任何內化。
[0039] 圖 7 :M048-D01-hIgGl (A, B)和 M047-D08-hIgGl (C, D)在 SUM52PE 細胞中的內 化作用表現出與Rab7 (A, C)的共染色，而未與Rabl 1 (B, D)共染色。GAL-FR21 (E, F)和 GAL-FR22 (G，H)在SUM52PE細胞中的內化作用表現出與Rab 11 (F，H)的共染色，而未與 Rab7(E，G)共染色。
[0040] 圖8 :與PBS(實心圓，實線）和對照IgG的處理（實心三角，實線）相比，在用2mg/ kg M017-B02-hIgGl (空心三角，實線）進行的腹膜內處理的情況下皮下SNU-16異種移植 物的生長。標繪了平均值+標準偏差。X為"腫瘤接種後的時間[天]"。Y為"腫瘤面積 [mm 2] "。用M017-B02-hIgGl進行的處理導致非常顯著的腫瘤生長抑制。
[0041] 圖9 :與PBS(實心圓，實線）和對照IgG的處理（實心三角，實線）相比，在用2mg/ kg M021-H02-hIgGl (空心三角，實線）進行的腹膜內處理的情況下皮下SNU-16異種移植 物的生長。標繪了平均值+標準偏差。X為"腫瘤接種後的時間[天]"。Y為"腫瘤面積 [mm 2] "。用M021-H02-hIgGl進行的處理導致非常顯著的腫瘤生長抑制。
[0042] 圖10:與PBS(實心圓，實線）和對照IgG的處理（實心三角，實線）相比，在用 2mg/kg M048-D01-hIgGl (空心三角，實線）進行的腹膜內處理的情況下皮下SNU-16異種移 植物的生長。標繪了平均值+標準偏差。X為"腫瘤接種後的時間[天]"。Y為"腫瘤面積 [mm 2] "。用M048-D01-hIgGl進行的處理導致非常顯著的腫瘤生長抑制。
[0043] 圖11 :與PBS(實心圓，實線）和對照IgG的處理（實心三角，實線）相比，在用 2mg/kg M054-A05-hIgGl (空心三角，實線）進行的腹膜內處理的情況下皮下SNU-16異種移 植物的生長。標繪了平均值+標準偏差。X為"腫瘤接種後的時間[天]"。Y為"腫瘤面積 [mm 2] "。用M054-A05-hIgGl進行的處理導致非常顯著的腫瘤生長抑制。
[0044] 圖12:與PBS(實心圓，實線）相比，在用2mg/kgM054-D03-hIgGl (空心三角，實 線）進行的腹膜內處理的情況下皮下SNU-16異種移植物的生長。標繪了平均值+標準偏 差。X為"腫瘤接種後的時間[天]"。Y為"腫瘤面積[mm 2]"。用M054-D03-hIgGl進行的 處理導致非常顯著的腫瘤生長抑制。
[0045] 圖13:與PBS(實心圓，實線）相比，在用2mg/kgM047-D08-hIgGl (空心三角，實 線）進行的腹膜內處理的情況下皮下SNU-16異種移植物的生長。標繪了平均值+標準偏 差。X為"腫瘤接種後的時間[天]"。Y為"腫瘤面積[mm 2]"。用M047-D08-hIgGl處理導 致非常顯著的腫瘤生長抑制。
[0046] 圖14 :在腫瘤細胞接種後的第13天--腫瘤變得壞死前的最後時間點，皮下4T1 腫瘤的腫瘤面積的點圖。在該時間點，小鼠接受單獨使用PBS的治療（A)，每周2次靜脈注 射的5mg/kg的M048_D01_hIgGl的治療⑶，口服的100mg/kg拉帕替尼（lapatinib)的 治療（C)，或每周2次靜脈注射的5mg/kg的M048-D01-hIgGl和口服的100mg/kg拉帕替 尼的治療（D)。Y為第13天的腫瘤面積[mm 2]，虛線表示平均值，實線表示中值。單獨使用 M048-D01-hIgGl的治療導致腫瘤面積顯著減小，而單獨使用拉帕替尼未顯著影響腫瘤面 積。M048-D01-hIgGl與拉帕替尼的組合導致顯著增加的抗腫瘤活性。
[0047] 圖15 :在腫瘤細胞接種後的第13天--腫瘤變得壞死前的最後時間點，皮下4T1 腫瘤的腫瘤面積的點圖。在該時間點，小鼠接受單獨使用PBS的治療（A)，每周2次靜脈注 射的5mg/kg的M048-D01-hIgGl的治療（B)，每周1次靜脈注射的24mg/kg紫杉酚的治療 (C)，或每周2次靜脈注射的5mg/kg的M048-D01-hIgGl並且每周1次靜脈注射的24mg/kg 紫杉酚的治療（D)。Y為第13天的腫瘤面積[mm2]，虛線表示平均值，實線表示中值。單獨 使用M048-D01-hIgGl的治療導致腫瘤面積顯著減小，而單獨使用紫杉酚未顯著影響腫瘤 面積。M048-D01-hIgGl與紫杉酚的組合導致顯著增加的抗腫瘤活性。
[0048] 圖16 :與PBS (空心菱形，實線）相比，在使用5mg/kg(實心三角，實線）、2mg/ kg(實心圓，短劃線）和lmg/kg(實心正方形，虛線）的M048-D01-hIgGl的腹膜內治療的 情況下，皮下的來源自患者的GC10-0608異種移植物的生長。標繪了平均值土平均值的標 準誤差。X為"在治療情況下的時間[天]"。Y為"腫瘤體積[_ 3]"。使用所有三種劑量的 M048-D01-hIgGl進行的治療均導致顯著的腫瘤生長抑制。
[0049] 圖17 :與PBS (空心菱形，實線）相比，在使用5mg/kg(實心三角，實線）、2mg/ kg(實心圓，短劃線）和lmg/kg (實心正方形，虛線）的M048-D01-hIgGl的腹膜內治療的情 況下，皮下的來源自患者的GC12-0811異種移植物的生長。標繪了平均值土平均值的標準 誤差。X為"在治療情況下的時間[天]"。Y為"腫瘤體積[mm 3] "。使用劑量為5和lmg/ kg的M048-D01-hIgGl進行的治療導致顯著的腫瘤生長抑制。
[0050] 圖18 :與對照抗體相比，使用抗FGFR2的抗體M048-D01-hIgGl和M047-D08-hIgGl 長期處理SNU16異種移植物後（2mg/kg，每周2次，腹膜內，最後給藥後24h取得樣品），總 FGFRE2 [總FGFRE2]和磷酸化FGFR2 [P-FGFR2]的下調。如圖所示，與使用對照IgGl進行的 處理相比，使用M048-D01-hIgGl和M047-D08-hIgGl進行的處理後總FGFR2 [總FGFRE2]和 磷酸化FGFR2[P-FGFR2]顯著降低。激動蛋白充當上樣對照。
[0051] 圖19:本發明的序列。

【具體實施方式】
[0052] 本發明是基於新抗體的發現：所述抗體對FGFR2具有特異性的親和力的並且可給 予受試者治療益處。本發明抗體可為人的、人源化的或嵌合的，可用於許多本文更加充分描 述的情況中。
[0053] 定義
[0054] 除非另有說明，本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬的【技術領域】 的普通技術人員通常理解的含義。然而，以下參考文獻可為本發明所屬的【技術領域】的 技術人員提供本發明中使用的許多術語的一般性定義，並且只要這類定義合乎本領域 中通常理解的含義，以下參考文獻就可被引用和使用。這類參考文獻包括但不限於 Singleton et ah, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2d ed. 1994) ；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed. , 1988) ；Hale&Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)；和 Lackie et al. , The Dictionary of Cell&Molecular Biology(3d ed. 1999)；和 Cellular and Molecular Immunology,Eds. Abbas, Lichtman and Pober, 2nd Edition, W. B. Saunders Company。可查閱任何其他的本領 域普通技術人員可獲得的提供本文使用的具有本領域中通常理解的含義的術語定義的技 術來源。為了本發明的目的，進一步定義以下術語。其他術語在說明書中的其他地方定義。 當用於本文和所附權利要求書中時，單數形式"一，"、"一個"和"所述"包括複數指代對象， 除非上下文明確地另有指示。因此，例如，提及"一個基因"是提及一個或多個基因並包括 本領域技術人員已知的其等同物，等等。
[0055] "人"抗體或其抗原結合片段在本文中被定義為是非嵌合的（例如，非"人源化 的"）並且不來自（無論是整體還是部分）非人物種。人抗體或其抗原結合片段可源自人， 或者可以為合成的人抗體。本文中"合成的人抗體"被定義為具有（全部或部分地）以計 算機方法衍生自合成序列的序列的抗體,所述合成序列是基於對已知人抗體序列的分析。 人抗體序列或其片段的計算機設計可通過以下方式實現：分析人抗體或抗體片段序列的 資料庫和利用由此獲得的數據設計多肽序列。人抗體或其抗原結合片段的另一個實例是 從人來源的抗體序列的文庫（例如，基於採自人天然來源的抗體的這種文庫）中分離的核 酸所編碼的人抗體或抗原結合片段。人抗體的實例包括記載於Sikierlind etal.，Nat. Biotechnol. 2000, 18(8) :853-856 中的抗體。
[0056] "人源化抗體"或其人源化抗原結合片段在本文中被定義為這樣的抗體或抗體片 段：（i)來源於非人來源（例如，攜帶異源免疫系統的轉基因小鼠），該抗體基於人種系序 列；（ii)其中非人抗體框架區的胺基酸被通過基因工程部分地調換為人胺基酸序列；或者 (iii) CDR移植的，其中可變區的CDR來自非人來源，而可變區的一個或多個框架為人來源 的，並且恆定區（如果有的話）是人來源的。
[0057] "嵌合抗體"或其抗原結合片段在本文中被定義為其中可變區來源於非人來源並 且一些或全部恆定區來源於人來源的抗體或其抗原結合片段。
[0058] 本文使用的術語"單克隆抗體"是指獲自基本上同質的抗體群體的抗體，S卩，所述 包含單一抗體的群體除了可能以極少量存在的可能突變（例如天然突變）之外是相同的。 因此，所述術語"單克隆"表明所述抗體的性質，即不是不相關（discrete)抗體的混合物。 與通常包括針對不同決定簇（表位）的不同抗體的多克隆抗體製劑相反，單克隆抗體製劑 的每個單克隆抗體均針對抗原上的單獨一個決定簇。除了其特異性之外，單克隆抗體製劑 的優點在於它們通常不會被其他免疫球蛋白汙染。所述術語"單克隆"不應被理解為需要 通過任何特定的方法產生所述抗體。所述術語單克隆抗體具體地包括嵌合抗體、人源化抗 體和人抗體。
[0059] 用於本文時，抗體"特異性結合至…"、是"特異性針對"或"特異性識別"目的抗原 例如腫瘤相關的多肽抗原靶（本文中，FGFR2)，即以足夠的親和力結合所述抗原以使得所 述抗體可用作治療性試劑靶向表達所述抗原的細胞或組織，並且與其他蛋白質無顯著交叉 反應或者與除了上文提到的抗原靶的同源體（ortholog)和變體（例如突變形式、剪接變 體，或蛋白水解作用截短的形式）以外的蛋白質無顯著交叉反應。本文使用的術語"特異性 識別"或"特異性結合至"或"特異性針對"特定多肽或特定多肽靶標上的表位，可以通過例 如對抗原的單價K D低於約1(Γ4Μ，或者低於約1(Γ5Μ，或者低於約1(Γ6Μ，或者低於約1(Γ 7Μ，或 者低於約1〇_8Μ，或者低於約1(Γ9Μ，或者低於約ΙΟ^Μ，或者低於約1(Γ ηΜ，或者低於約1(Γ12Μ， 或更低的抗體或其抗原結合片段來展現。如果抗體能夠將抗原和一種或多種參考抗原區分 開，那麼這樣的抗體"特異性結合至"、"特異性針對"或"特異性識別"所述抗原。在其最一 般的形式中，"特異性結合"、"特異性結合至"、"特異性針對"或"特異性識別"是指按照例 如以下方法之一測定的抗體區分目的抗原和不相關抗原的能力。這類方法包括，但不限於 蛋白質印跡、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-測試以及肽掃描。例如，可進行標準ELISA測定。 可以通過標準顯色進行評分（例如，具有辣根過氧化物酶的二抗和具有過氧化氫的四甲基 聯苯胺）。通過例如在450nm下的光密度來將某些孔中的反應評分。典型背景（=陰性反 應）可以為〇. 10D ;典型陽性反應可以為10D。這意味著陽性/陰性的差異可以大於5倍、 10倍、50倍，優選大於100倍。通常，通過使用不止單獨一個參考抗原而是一組約3-5個不 相關的抗原（例如奶粉、BSA、轉鐵蛋白等）來確定結合特異性。
[0060] "結合親和力"是指分子的單個結合位點與其結合伴侶（binding partner)之間非 共價相互作用總和的強度。除非另有說明，用於本文時"結合親和力"是指固有的結合親和 力，其反映結合對（例如抗體和抗原）的成員之間1 :1的相互作用。離解常數"KD"通常用 於描述分子（例如抗體）與其結合伴侶（例如抗原）之間的親和力，即，配體結合特定蛋白 的緊密程度。配體-蛋白親和力受到所述兩個分子之間非共價分子間相互作用的影響。親 和力可通過本領域中已知的常規方法測量，包括本文描述的那些。在一個實施方案中，本發 明的"K D"或"KD值"是通過依照實施例7使用表面等離子共振測定法來測量，所述表面等 離子共振測定法使用Biacore T100儀器（GE Healthcare Biacore, Inc.)。簡言之，將抗體 通過間接捕獲試劑--抗人IgG Fc固定到CM5傳感器晶片上。如製造商所描述，使用來自 "人抗體捕獲試劑盒"（BR-1008-39，GE Healthcare Biacore, Inc.)的試劑。每個小室固定 大約5000共振單位（RU)單克隆小鼠抗人IgG (Fc)抗體。注射抗FGFR2的抗體以達到大約 200-600RU的捕獲水平。將多種濃度的人、鼠、大鼠、狗和其他物種衍生的含有胺基酸1-15 的FGFR2肽注射到固定的抗FGFR2的抗體上。進行線性參比室校正（in-line reference cell correction)及減去緩衝液樣品後，產生傳感圖。離解平衡常數（KD)是基於以下計算： 通過使用Biacore Evaluation Software以一級1 :1結合模型擬合傳感圖獲得的締合速率 常數GO和離解速率常數的比例。其他合適的設備為BIAC0RE(R)-2000、BIAC0RE(R)-300 0 (BIAcore, Inc.，Piscataway, NJ)或 ProteOn XPR36 儀器（Bio-Rad Laboratories, Inc.)。
[0061] 為了確定對於抗體或抗體片段的結合的關鍵性殘基，可使用例如肽的丙氨酸-掃 描進行表位精細定位。因此，結合表位的每個胺基酸被丙氨酸殘基置換，並且在基於ELISA 的測定法中測試本發明的典型抗體的結合。因此，如實施例6所描述，當通過將一個殘基變 為丙氨酸，所述抗體就會失去其ELISA信號的多於50%時，該殘基就被視為對於結合是關 鍵性的。
[0062] 用於本文時術語"抗體"意指免疫球蛋白分子，優選包含4條多肽鏈，通常通過二 硫鍵相互連接的2條重（H)鏈和2條輕（L)鏈。每條重鏈包含重鏈可變區（本文縮寫為 VH)和重鏈恆定區。所述重鏈恆定區可包括例如3個結構域CHI、CH2和CH3。每條輕鏈包 含輕鏈可變區（本文縮寫為VL)和輕鏈恆定區。所述輕鏈恆定區包含1個結構域（CL)。所 述VH和VL區可進一步細分為穿插在更保守的區域（稱為框架區（FR))的高變區（稱為互 補決定區（⑶R))。每個VH和VL通常包含3個⑶R和最多達4個FR，所述⑶R和FR從氨 基末端至羧基末端以例如以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
[0063] 用於本文時術語"互補決定區（⑶R，例如⑶R1XDR2和⑶R3)是指抗體可變區的氨 基酸殘基，互補決定區的存在對於抗原結合來說是必需的。每個可變區通常具有3個被鑑 別為⑶R1XDR2和⑶R3的⑶R區域。每個互補決定區可包含來自如Kabat所定義的"互補 決定區"的胺基酸殘基（例如，輕鏈可變區中的約殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)和89-97 (L3) 和重鏈可變區中的 31-35 (HI)、50_65(H2)和 95-102 (H3) ; (Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immulological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 1991))和/或來自"高變環"的那些殘基（例如，輕 鏈可變區中的約殘基26-32 (L1)、50-52(L2)和91-96 (L3)和重鏈可變區中的26-32(Η1)、 53-55 (H2)和 96-101 (H3) (Chothia and Lesk ;J Mol Biol 196:901-917 (1987))。在一些實例 中，互補決定區可包括來自根據Kabat定義的CDR區和來自高變環的胺基酸。
[0064] 根據其重鏈恆定區的胺基酸序列，完整的抗體可被分配到不同的"類"。存在五大 類完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些類中的若干還可進一步分為亞類（同種型），例 如1861、1862、1863、1864、184和1842。對應於不同類抗體的重鏈恆定區分別被稱為[0]、 [Μ、[ε]、[ Υ]和[μ]。不同類的免疫球蛋白的亞基結構和三維構型是公知的。本文使 用的抗體為通常已知的抗體和其功能片段。
[0065] 抗體/免疫球蛋白的"功能片段"或"抗原結合片段"在本文中被定義為保留抗原 結合區的抗體/免疫球蛋白的片段（例如IgG的可變區）。抗體的"抗原結合區"通常存在 於抗體的一個或多個高變區中，例如CDRl、-2和/或-3區；然而，可變"框架"區也可以在 抗原結合中起重要作用，例如通過提供CDR的支架。優選地，所述"抗原結合區"至少包括 可變輕鏈（VL)的胺基酸殘基4-103和可變重（VH)鏈的胺基酸殘基5-109,更優選VL的氨 基酸殘基3-107和VH的胺基酸殘基4-111，並且特別優選完整的VL和VH鏈（VL的胺基酸 第1-109位和VH的胺基酸第1-113位；編號根據W097/08320進行）。本發明中使用的優 選的免疫球蛋白類為IgG。
[0066] 本發明的"功能片段"或"抗原結合抗體片段"包括Fab、Fab'、F(ab'）2、和Fv 片段；雙體；單域抗體（Dab)、線性抗體；單鏈抗體分子（scFv);和由抗體片段形成的多 特異性的（例如雙或三_特異性的）抗體（C. A. K Borrebaeck, editor(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press ； R. Kontermann&S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual), Springer Verlag)。除了"多特異性的"或"多功能的"抗體以外的抗體被理解為 使其每個結合位點相同。可以將F (ab '）2或Fab改造以最小化或完全除去發生在CH1和CL 結構域之間的分子間二硫鍵相互作用。
[0067] 本發明中考慮到的抗體或抗原結合抗體片段的變體為其中保持了所述抗體或抗 原結合抗體片段對FGFR2的結合活性的分子。
[0068] 本發明中考慮到的結合蛋白為例如抗體模擬物，例如Affibodies、Adnectins、 Anticalins、DARPins、Avimers、Nanobodies (綜述：Gebauer M. et al.，Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009 ；13:245-255 ；Nuttall S.D.et al.,Curr. Opinion in Pharmacology2008 ； 8:608-617)。
[0069] 用於本文時術語"表位"包括能夠特異性結合至免疫球蛋白或T細胞受體的任何 蛋白質決定簇。表位決定簇通常由分子的化學活性表面基團（例如胺基酸或糖側鏈，或其 組合）組成，並且通常具有特定三維結構特徵以及特定的電荷特徵。如果通過本領域技術 人員公知的任何方法證明在競爭性結合測定法中一種抗體與第二種抗體競爭，則稱兩種抗 體"結合相同表位"。
[0070] "分離的"抗體是已經被鑑別並且從表達它的細胞的組分中分離的抗體。所述細 胞的汙染組分是會干擾所述抗體的診斷或治療用途的物質，可能包括酶、激素和其他蛋白 質性質或非蛋白質性質的溶質。在優選的實施方案中，所述抗體（1)被純化至通過羅氏蛋 白定量法（Lowry method)、UV-Vis光譜法或通過SDS-毛細管凝膠電泳（例如，在Caliper LabChip GXII、GX90或Biorad Bioanalyzer設備上）測定的，高於95重量％的抗體，並且 在更優選的實施方案中，高於99重量％ ; (2)被純化至足以獲得N末端或內部胺基酸序列 的至少15個胺基酸的程度；或者（3)被通過在還原或非還原條件下使用考馬斯藍或優選銀 染的SDS純化至同質。分離的天然抗體包括重組細胞內的原位抗體，因為所述抗體的天然 環境中的至少一種組分是不存在的。然而，通常情況下，分離的抗體是通過至少一個純化步 驟進行製備。
[0071] "抗體依賴性細胞介導的細胞毒性"或"ADCC"是指一種細胞毒性形式，其中結 合到在某些細胞毒性細胞（例如NK細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞）上存在的Fcy受 體（FcyRs)上的分泌Ig使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合至承載抗原的 靶細胞，隨後例如使用細胞毒素殺死所述靶細胞。為了評估目的抗體的ADCC活性，可 進行體外ADCC測定法，例如記載於美國專利No. 5, 500, 362或5, 821，337或美國專利 No. 6, 737, 056 (Presta)中的體外ADCC測定法。用於這類測定法的有用效應細胞包括PBMC 和NK細胞。
[0072] "補體依賴性細胞毒性"或"CDC"是指在補體的存在下靶細胞的裂解。典型的補 體途徑的活化是通過將補體系統的第一組分（Clq)與結合至其相應抗原的（適當亞類的） 抗體結合來起始。為了評估補體活化，可進行CDC測定法，例如記載於Gazzano-Santoro et &1.，11臟1111〇1]^七11〇(18202:163(1996)中的0)(：測定法。例如在美國專利唚.6，194,55181 和TO1999/51642中描述了具有改變的Fc區胺基酸序列的多肽變體（具有變體Fc區的多 肽）和具有增強或降低的Clq結合的多肽變體。
[0073] 術語免疫綴合物（可互換地稱為"抗體-藥物綴合物"或"ADC"）是指與一種或多 種細胞毒性試劑綴合的抗體，所述細胞毒性試劑例如化療劑、藥物、生長抑制劑、毒素（例 如細菌、真菌、植物或動物來源的蛋白質毒素、酶促活性毒素或其片段），或者放射性同位素 (即放射性綴合物）。免疫綴合物已經被用於在癌症的治療過程中局部遞送細胞毒性試劑， 所述細胞毒性試劑即殺傷或抑制細胞的生長或增殖的藥物（例如Liu et al.，Proc Natl. Acad. Sci. (1996)，93, 8618-8623)。免疫綴合物使得能夠將藥物部分靶向遞送至腫瘤和其 中的細胞內累積物，而全身性給予未綴合的藥物可導致對正常細胞和/或組織產生不可接 受的毒性水平。抗體-毒素綴合物中使用的毒素包括細菌毒素例如白喉毒素、植物毒素例 如蓖麻毒蛋白、小分子毒素例如格爾德黴素。所述毒素可通過一些機制--包括微管蛋白 結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制--發揮它們的細胞毒性效應。
[0074] 分別相對於參考多核苷酸或多肽序列的"序列同一性百分數（％) "，被分別定義 為（根據需要）比對序列以及引入缺口以實現最大序列同一性百分數之後，候選序列中分 別與參考多核苷酸或多肽序列中核酸或胺基酸殘基相同的核酸或胺基酸殘基的百分數。保 守置換不被認為是序列同一性的一部分。優選不帶缺口（un-gapped)的比對。目的是確 定胺基酸序列同一性百分數的比對可以以在本領域技術人員能力範圍內的多種方式實現， 例如，使用可公開獲得的計算機軟體例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟 件。本領域技術人員可確定用於比對序列的合適參數，包括在要比較的序列全長上實現最 大（maximal)對齊所需要的任何算法。
[0075] 術語'成熟的抗體'或'成熟的抗原結合片段'例如成熟的Fab變體包括展示出更 強的結合至--即親和力增加的結合至--給定抗原（例如FGFR2的細胞外結構域）的抗 體或抗體片段的衍生物。成熟是鑑定抗體或抗體片段的6個CDR中的少數導致該親和力增 加的突變的過程。成熟過程是用於將突變引入抗體的分子生物學方法和用於鑑定改善的結 合物的篩選方法的結合。
[0076] 本發明的抗體
[0077] 本發明涉及通過提供抗FGFR2的抗體來抑制FGFR2陽性的癌細胞生長和腫瘤性 疾病進展的方法。本發明提供了能夠在結合至過表達FGFR2的細胞和表達突變的FGFR2 的細胞中的FGFR2之後，減少FGFR2的表面表達的結合蛋白、抗體、其抗原結合抗體片 段和所述抗體和片段的變體，本發明的另一個實施方案提供了抗體、其抗原結合抗體片 段或其變體，其在過表達FGFR2的細胞以及表達突變的FGFR2的細胞中結合多種不同的 表達FGFR2的細胞系，所述細胞包括但不限於過表達FGFR2的SNU16 (ATCC-CRL-5974) 和 MFM223(ECACC-98050130)以及表達突變的 FGFR2 的 AN3-CA(DSMZ-ACC267)和 (MFE-296(ECACC-98031101)。
[0078] 為此目的，本發明的一個實施方案提供了分離的人抗體、人源化抗體或嵌合抗 體，或其抗原結合抗體片段，其特異性結合至存在於成熟的人FGFR2多肽的不同形式中的 FGFR2 表位（例如，參見對於 FGFR2a Illb 為 SEQ ID N0:61，對於 FGFR2P Illb 為 SEQ ID NO: 62)，所述成熟的人FGFR2多肽由表達FGFR2的癌細胞系/癌細胞呈遞，和/或被這些抗 體以高親和力結合。用於本文時，FGFR2的不同'形式'包括但不限於不同同種型、不同剪接 變體、不同糖型或經過不同的翻譯和翻譯後修飾的FGFR2多肽。FGFR2多肽在本文中被稱為 'FGFR2，。
[0079] 本發明的另一個實施方案提供了對於人給藥具有安全性的抗體、或其抗原結合抗 體片段、或其變體。
[0080] 本發明的另一個實施方案提供了結合人FGFR2並且與另一物種的FGFR2交叉反 應的抗體、或其抗原結合抗體片段、或其變體，所述另一物種的FGFR2包括但不限於鼠、大 鼠、獼猴（macaca mulatta)、兔、豬和狗FGFR2。優選地，所述其他物種為齧齒動物，例如小 鼠或大鼠。最優選地，所述抗體、或其抗原結合抗體片段、或其變體結合人FGFR2,並且與鼠 FGFR2交叉反應。
[0081] 本發明的另一個實施方案提供了結合至表達FGFR2的細胞之後被有效內化的抗 體、或其抗原結合抗體片段、或其變體。本發明的抗體可與已知藥物共給予，在一些實例中 所述抗體自身可被修飾。例如，抗體可綴合至細胞毒性試劑、免疫毒素、毒性基團或放射性 同位素以可能進一步增加效能。
[0082] 本發明的另一個實施方案提供了這樣的抗體、或其抗原結合抗體片段、或其變體， 其在短期內活化FGFR2並在內化後導致FGFR2降解，因此導致不同的表達FGFR2的癌細胞 或腫瘤細胞對FGF刺激的脫敏作用，最終抑制體內腫瘤生長。
[0083] 本發明的另一個實施方案提供了構成用於診斷惡性的或發育不良性的病症的工 具的抗體，在所述病症中與正常組織相比FGFR2表達提高，或者FGFR2從細胞表面脫落並在 血清中可檢測到。本發明提供了綴合至可檢測的標記物的抗FGFR2的抗體。優選的標記物 為放射性標記、酶、生色團或螢光劑。
[0084] 在一個方面，本發明提供了這樣的分離的抗體或其抗原結合片段，其含有結合細 胞表面表達的FGFR2的結合抗原區域，並在結合至FGFR2之後降低FGFR2在過表達FGFR2的 細胞和表達突變的FGFR2的細胞中的細胞表面表達。在一個實施方案中，本發明提供了這 樣的分離的抗體或其抗原結合片段，其含有特異性結合天然的細胞表面表達的FGFR2的抗 原結合區，並且在結合至FGFR2之後降低FGFR2在過表達FGFR2的細胞和表達突變的FGFR2 的細胞中的細胞表面表達。在一個實施方案中，所述分離的抗體或其抗原結合片段特異性 結合天然的細胞表面表達的FGFR2，並且在結合FGFR2之後降低FGFR2在至少兩種不同的過 表達FGFR2的細胞和至少兩種不同的表達突變的FGFR2的細胞中的細胞表面表達。
[0085] 在另一個實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段特異性結合天然的細胞表面表 達的FGFR2,並且（i)在結合FGFR2之後降低FGFR2在過表達FGFR2的細胞和表達突變的 FGFR2的細胞中的細胞表面表達和（ii)誘導FGFR2磷酸化。
[0086] 在另一個實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段特異性結合天然的細胞表面表 達的FGFR2,並且（i)在結合FGFR2之後降低FGFR2在過表達FGFR2的細胞和表達突變的 FGFR2的細胞中的細胞表面表達和（ii)誘導FGFR2磷酸化，其中所述抗體使表達FGFR2的 細胞對使用FGF7的刺激作用脫敏。
[0087] 在另一個實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段特異性結合天然的細胞表面表 達的FGFR2,並且（i)在結合FGFR2之後降低FGFR2在過表達FGFR2的細胞和表達突變的 FGFR2的細胞中的細胞表面表達和（ii)誘導FGFR2的內化作用，從而導致FGFR2降解。
[0088] 在另一個實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段特異性結合天然的細胞表面表 達的FGFR2,並且（i)在結合FGFR2之後降低FGFR2在過表達FGFR2的細胞和表達突變的 FGFR2的細胞中的細胞表面表達和（ii)在異種移植腫瘤實驗中降低腫瘤生長。
[0089] 在另一個實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段能夠降低在不同細胞系中的 FGFR2細胞表面表達，所述細胞系包括但不限於過表達FGFR2的SNU16(ATCC-CRL-5974) 和 MFM223(ECACC-98050130)以及表達突變的 FGFR2 的 AN3-CA(DSMZ-ACC267)和 MFE-296(ECACC-98031101)。
[0090] 在另一個實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段能夠在結合FGFR2之後降低在 過表達 FGFR2 的 SNU16(ATCC-CRL-5974)和 MFM223(ECACC-98050130)細胞以及表達突變的 FGFR2 的細胞系 AN3-CA(DSMZ-ACC267)和 MFE-296(ECACC-98031101)中的 FGFR2 細胞表面 表達。
[0091] 在優選的實施方案中，與未處理的或對照處理的細胞的FGFR2細胞表面表達相 t匕，所述細胞表面降低為至少10%、15%、20%、25%或30%。
[0092] 在另一個優選的實施方案中，與未處理的或對照處理的細胞的FGFR2細胞表面表 達相比，96小時後的所述細胞表面降低為至少10 %、15 %、20 %、25 %或30 %。
[0093] 在另一實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段特異性結合FGFR2的細 胞外的N末端表位CRPSFSLVEDTTLEPE 15) (SEQ ID N0:63)。在FGFR2的N末端表位 CRPSFSLVEDTTLEPE15)中對於所述抗體或其抗原結合片段的結合來說關鍵性殘基包括但不 限於 Argl、Pro2、Phe4、Ser5、Leu6 和 Glu8。
[0094] 在另一實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段與細胞外的N末端表位（SEQ ID N0:63)的結合是由至少一個選自殘基Argl、Pro2、Phe4、Ser5、Leu6和Glu8的表位殘基 介導的。
[0095] 在另一實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段與細胞外的N末端表位（SEQ ID N0:63)的結合是通過由胺基酸丙氨酸置換至少一個選自殘基Argl、Pro2、Phe4、Ser5、 Leu6和Glu8的表位殘基而降低。
[0096] 在另一實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段與細胞外的N末端表位（SEQ IDN0:63)的結合是由至少一個選自殘基Pro2、Leu6和Glu8的表位殘基介導的。
[0097] 在另一實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段與細胞外的N末端表位（SEQ IDN0:63)的結合是通過由胺基酸丙氨酸置換至少一個選自殘基Pr 〇2、Leu6和Glu8的表位 殘基而降低。
[0098] 在另一個實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段與細胞外的N末端表位 (SEQ IDN0:63)的結合是由至少一個選自殘基Pro2、Leu6和Glu8的表位殘基介導的，並且 與所述表位的結合不隨所述表位的位置5的序列變化而改變。
[0099] 在另一實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段與細胞外的N末端表位（SEQ IDN0:63)的結合是通過由胺基酸丙氨酸置換至少一個選自殘基Pr 〇2、Leu6和Glu8的表位 殘基而降低，並且與所述表位的結合不隨所述表位的位置5的序列變化而改變。
[0100] 在另一實施方案中，通過將FGFR2的N末端表位（iRPSFSLVEDTTLEPE15)中的至少一 個胺基酸殘基變為丙氨酸而使所述抗體或其抗原結合片段失去多於50%的其ELISA信號， (i)所述殘基選自Pro2、Leu6和Glu8,或（ii)所述殘基選自Argl、Pro2、Phe4和Ser5。
[0101] 在另一優選實施方案中，通過將FGFR2的N末端表位^RPSFSLVEDTTLEPE15)中的 至少一個胺基酸殘基變為丙氨酸而使所述分離的抗體或其抗原結合片段失去多於50%的 其ELISA信號，其中所述殘基選自（包括但不限於）a) Pro2、Leu6和Glu8,或b) Argl、Pro2、 Phe4和Ser5,如表7中所描述。
[0102] 在另一實施方案中，所述抗體或抗原結合片段與至少一個選自如下的抗體競爭性 結合 FGFR2 :"M048-D01"、"M047-D08"、"M017-B02"、"M021-H02"、"M054-A05"、"M054-D03"、 "TPP-1397"、"TPP-1398"、" T PP-1399"、"TPP-1400"、"TPP-1401"、"TPP-1402"、 "ΤΡΡ-1403"、"ΤΡΡ-1406"、"ΤΡΡ-1407"、"ΤΡΡ-1408"、"ΤΡΡ-1409"、"ΤΡΡ-1410"、"ΤΡΡ-1411"、 "TPP-1412"和"TPP-1415"。
[0103] 整個說明書中，提及了表9和表10中所描述的以下本發明的優選抗體： "MO17-Β02"、"Μ021-Η02"、"M047-D08"、"M048-D01"、"M054-A05"、"M054-D03"、"ΤΡΡ-1397"、 "TPP-1398"、"TPP-1399"、"TPP-1400"、"TPP-1401"、"TPP-1402"、"TPP-1403"、"TPP-1406"、 "ΤΡΡ-1407"、"ΤΡΡ-1408"、"ΤΡΡ-1409"、"ΤΡΡ-1410"、"ΤΡΡ-141Γ，、"ΤΡΡ-1412" 和 "ΤΡΡ-1415"。
[0104] Μ017-Β02代表包含對應於SEQ ID N0:3(DNA)/SEQ ID NO: 1 (蛋白質）的重鏈可變 區和對應於SEQIDN0:4(DNA)/SEQIDN0:2(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0105] M021-H02代表包含對應於SEQ ID NO: 13 (DNA)/SEQ ID NO: 11 (蛋白質）的重鏈可 變區和對應於SEQ ID NO: 14(DNA)/SEQ ID NO: 12(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0106] M047-D08代表包含對應於SEQ ID NO: 23 (DNA)/SEQ ID NO: 21 (蛋白質）的重鏈可 變區和對應於SEQ ID NO:24 (DNA)/SEQ ID NO:22(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0107] M048-D01代表包含對應於SEQ ID NO: 33 (DNA)/SEQ ID NO:31(蛋白質）的重鏈可 變區和對應於SEQ ID NO:34 (DNA)/SEQ ID NO:32(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0108] M054-D03代表包含對應於SEQ ID N0:43(DNA)/SEQ ID N0:41 (蛋白質）的重鏈可 變區和對應於SEQ IDN0:44(DNA)/SEQ IDN0:42(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0109] M054-A05代表包含對應於SEQ ID N0:53(DNA)/SEQ ID N0:51 (蛋白質）的重鏈可 變區和對應於SEQ ID NO:54 (DNA)/SEQ ID NO:52(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0110] ΤΡΡ-1397代表包含對應於SEQ ID N0:83(蛋白質）的重鏈可變區和對應於SEQ ID NO:84(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0111] TPP-1398代表包含對應於SEQ ID N0:93(蛋白質）的重鏈可變區和對應於SEQ ID NO:94(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0112] TPP-1399代表包含對應於SEQ IDN0:103(蛋白質）的重鏈可變區和對應於SEQ ID NO: 104(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0113] TPP-1400代表包含對應於SEQ IDN0:113(蛋白質）的重鏈可變區和對應於SEQ ID NO: 114(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0114] TPP-1401代表包含對應於SEQIDN0:123(蛋白質）的重鏈可變區和對應於SEQID N0:124(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0115] TPP-1402代表包含對應於SEQ IDN0:133(蛋白質）的重鏈可變區和對應於SEQ ID NO: 134(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0116] TPP-1403代表包含對應於SEQ ID N0:73(蛋白質）的重鏈可變區和對應於SEQ ID NO:74(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0117] TPP-1406代表包含對應於SEQ IDN0:153(蛋白質）的重鏈可變區和對應於SEQ ID NO: 154(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0118] TPP-1407代表包含對應於SEQIDN0:163(蛋白質）的重鏈可變區和對應於SEQID N0:164 (蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0119] TPP-1408代表包含對應於SEQ IDN0:173(蛋白質）的重鏈可變區和對應於SEQ ID NO: 174(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0120] TPP-1409代表包含對應於SEQIDN0:183(蛋白質）的重鏈可變區和對應於SEQID NO: 184(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0121] TPP-1410代表包含對應於SEQ IDN0:193(蛋白質）的重鏈可變區和對應於SEQ ID NO: 194(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0122] TPP-1411代表包含對應於SEQIDN0:203(蛋白質）的重鏈可變區和對應於SEQID NO:204(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0123] TPP-1412代表包含對應於SEQ IDN0:213(蛋白質）的重鏈可變區和對應於SEQ ID NO:214(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。
[0124] TPP-1415代表包含對應於SEQ ID N0:143(蛋白質）的重鏈可變區和對應於SEQ ID NO: 144(蛋白質）的輕鏈可變區的抗體。在另一個優選的實施方案中，所述抗體或抗 原結合片段包含這樣的重鏈CDR序列或輕鏈CDR序列：其分別與以下抗體的至少一個 (優選對應的）CDR 序列至少 50 %、55 %、60 %、70 %、80 %、90 或 95 % 相同："M048-D〇r'、 "M047-D08"、"M017-B02"、"M021-H02"、"M054-A05"、"M054-D03"、"TPP-1397"、"TPP-1398"、 "TPP-1399"、"TPP-1400"、"TPP-1401"、"TPP-1402"、"TPP-1403"、"TPP-1406"、"TPP-1407"、 "ΤΡΡ-1408，，、"ΤΡΡ-1409，，、"ΤΡΡ-1410，，、"ΤΡΡ-141Γ，、"ΤΡΡ-1412，，或"TPP-1415" ；或者其 分別與 "M048-D01"、"M047-D08"、"M017-B02"、"M021-H02"、"M054-A05"、"M054-D03"、 "TPP-1397"、"TPP-1398"、"TPP-1399"、"TPP-1400"、"TPP-1401"、"TPP-1402"、"TPP-1403"、 "ΤΡΡ-1406"、"ΤΡΡ-1407"、"ΤΡΡ-1408"、"ΤΡΡ-1409"、"ΤΡΡ-1410"、"ΤΡΡ-1411"、"ΤΡΡ-1412" 或"TPP-1415" 的 VH 或 VL 序列 50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%相同。
[0125] 在另一個優選的實施方案中，本發明的抗體或抗原結合片段包含表9和表10中所 描述的至少一個CDR序列或至少一個重鏈可變序列或輕鏈可變序列。
[0126] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈抗 原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:5(H-⑶Rl)、SEQ ID N0:6(H-CDR2)和SEQIDN0:7(H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含SEQIDN0:8(L-CDR1)、SEQ ID N0:9(L-CDR2)和 SEQ ID NO:10 (L-CDR3)。
[0127] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:15 (H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 16 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 17 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO: 18 (L-CDR1)、SEQ ID NO: 19 (L-CDR2)和 SEQ ID NO: 20 (L-CDR3)。
[0128] 在一個更優選的實施方案中本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:25(H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 26 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 27 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO:28(L-CDR1)、SEQ ID NO:29 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:30(L-CDR3)。
[0129] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:35(H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 36 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 37 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO: 38 (L-CDR1)、SEQ ID NO: 39 (L-CDR2)和 SEQ ID NO: 40 (L-CDR3)。
[0130] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:45(H-⑶R1)、 SEQ ID N0:46 (H-CDR2)和 SEQ ID N0:47 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO: 48 (L-CDR1)、SEQ ID NO: 49 (L-CDR2)和 SEQ ID NO: 50 (L-CDR3)。
[0131] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:55(H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 56 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 57 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO: 58 (L-CDR1)、SEQ ID NO: 59 (L-CDR2)和 SEQ ID NO: 60 (L-CDR3)。
[0132] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:75(H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 76 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 77 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO: 78 (L-CDR1)、SEQ ID NO: 79 (L-CDR2)和 SEQ ID NO: 80 (L-CDR3)。
[0133] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ IDN0:85(H-⑶R1)、 SEQ ID N0:86 (H-CDR2)和 SEQ ID N0:87 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO: 88 (L-CDR1)、SEQ ID NO: 89 (L-CDR2)和 SEQ ID NO: 90 (L-CDR3)。
[0134] 在一個更優選的實施方案中本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:95(H-⑶R1)、 SEQ ID N0:96 (H-CDR2)和 SEQ ID N0:97 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO:98(L-CDR1)、SEQ ID NO:99 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:100(L-CDR3)。
[0135] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:105 (H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 106 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 107 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO:108(L-CDR1)、SEQ ID NO:109 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:110(L-CDR3)。
[0136] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:115 (H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 116 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 117 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO:118(L-CDR1)、SEQ ID NO:119 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:120(L-CDR3)。
[0137] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ IDN0:125(H-⑶R1)、 SEQ ID N0:126 (H-CDR2)和 SEQ ID N0:127 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO:128(L-CDR1)、SEQ ID NO:129(L-CDR2)和 SEQ ID NO:130(L-CDR3)。
[0138] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:135 (H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 136 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 137 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO:138(L-CDR1)、SEQ ID NO:139(L-CDR2)和 SEQ ID NO:140(L-CDR3)。
[0139] 在一個更優選的實施方案中本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈抗 原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:145 (H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 146 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 147 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO: 148 (L-CDR1)、SEQ ID NO: 149 (L-CDR2)和 SEQ ID NO: 150 (L-CDR3)。
[0140] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:155 (H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 156 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 157 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO: 158 (L-CDR1)、SEQ ID NO: 159 (L-CDR2)和 SEQ ID NO: 160 (L-CDR3)。
[0141] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:165 (H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 166 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 167 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO:168(L-CDR1)、SEQ ID NO:169 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:170(L-CDR3)。
[0142] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:175 (H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 176 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 177 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO: 178 (L-CDR1)、SEQ ID NO: 179 (L-CDR2)和 SEQ ID NO: 180 (L-CDR3)。
[0143] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:185 (H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 186 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 187 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO:188(L-CDR1)、SEQ ID NO:189 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:190(L-CDR3)。
[0144] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:195 (H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 196 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 197 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO:198(L-CDR1)、SEQ ID NO:199 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:200(L-CDR3)。
[0145] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:205 (H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 206 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 207 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID NO:208(L-CDR1)、SEQ ID NO:209 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:210(L-CDR3)。
[0146] 在一個更優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈 抗原結合區和輕鏈抗原結合區，所述重鏈抗原結合區包含SEQ ID N0:215(H-⑶R1)、 SEQ ID NO: 216 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 217 (H-CDR3)，所述輕鏈抗原結合區包含 SEQ ID N0:218(L-CDR1)、SEQ ID N0:219(L-CDR2)和 SEQ ID N0:220(L-CDR3)。
[0147] 本發明的抗體可為IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)，而抗體片段可為例如Fab、 Fab'、F(ab'）2或scFv。因此，本發明的抗體片段可為或可含有，以本文所描述的一種或多 種方式起作用的抗原結合區。
[0148] 例如，抗體Fab片段M048-D01 (對於VH鏈為SEQ ID N0:31，對於VL鏈為SEQ ID N0:32)被表達為人IgGlM048-D01-hIgGl (對於重鏈為SEQ ID N0:67,對於輕鏈為SEQ ID N0:68)，並且Fab片段M047-D08(對於VH鏈為SEQIDN0:21，對於VL鏈為SEQIDN0:22)被 表達為人IgGlM047-D08-hIgGl(對於重鏈為SEQIDN0:69，對於輕鏈為SEQIDN0:70)。為 了有效的克隆，重鏈（SEQ IDN0:67和SEQ IDN0:69)N末端的前3個胺基酸[EVQ]或者還可 被表達為[QVE]，例如被表達為人IgGlM048-D01-hIgGl(SEQIDN0:222)的重鏈的變體。為 了有效的克隆，輕鏈的N末端可由胺基酸殘基例如丙氨酸延長。
[0149] 在一個優選實施方案中，本發明的抗體或抗原結合抗體片段為單克隆的。在另一 個優選實施方案中，本發明的抗體或抗原結合抗體片段為人的、人源化的或嵌合的。
[0150] 在另一方面中，本發明提供了具有抗原結合區的抗體或抗原結合片段，其不依賴 於α和β同種型以及mb和IIIc剪接形式而特異性結合FGFR2和/或具有高的針對 FGFR2 的親和力（例如，參見，對於 FGFR2a Illb 為 SEQ IDN0:61，對於 FGFR2P Illb 為 SEQ ID N0:62)。如果親和力測量為小於250nM(所述抗體或抗原結合片段的單價親和力），那麼就 說抗體或抗原結合片段具有對抗原的"高親和力"。本發明的抗體或抗原結合區優選地可以 小於250nM，優選小於150nM的親和力結合至人FGFR2,所述親和力作為對人FGFR2的單價 親和力來確定。例如，抗來自不同物種的FGFR2的本發明抗體的親和力可為大約ΙΟΟηΜ(所 述抗體或抗原結合片段的單價親和力），如表8對於M048-D1和M047-D08所示例性地示出 的。
[0151] IgGl型用於通過螢光激活細胞分類術（FACS)進行的基於細胞的親和力的確定。 表6提供了代表性的抗FGFR2-IgG的抗體在人（SNU16、MFM223)、鼠（4T1)和大鼠（RUCA)來 源的癌細胞系上的結合強度（EC50)的總結。
[0152] 如果通過FACS測量的親和力測量結果為小於ΙΟΟηΜ(IgG的表觀親和力），那麼就 說IgGl具有對抗原的"高親和力"。本發明的二價抗體或抗原結合片段優選地可以以小於 ΙΟΟηΜ，更優選小於50nM，仍更優選小於ΙΟηΜ的親和力結合FGFR2。還優選的是，以小於5nM， 和更優選小於InM的親和力結合FGFR2的二價抗體，所述親和力被確定為IgG對FGFR2的 表觀親和力。例如，在人、小鼠和大鼠來源的不同腫瘤細胞系上本發明抗體對FGFR2的表觀 親和力可為約89. 5nM或小於0· InM，所述親和力是通過FACS分析確定，如表6中所描述。
[0153] 當本發明的抗體或抗原結合片段的內化進表達FGFR2的腫瘤細胞中半最大內化 時間（tl/2)為短於180min或更優選短於120min並且仍更優選短於90min時，本發明的抗 體或抗原結合片段"有效"內化。還優選的是，半最大內化時間（tl/2)為60分鐘或更短的 抗體或抗原結合片段，所述tl/2是通過實施例12中所述的方案確定。
[0154] 小G蛋白的共染色可用於更加詳細的評價內化後抗體的運輸途徑。例如Rab GTP 酶可用於區分不同的途徑，所述Rab GTP酶調節膜運輸的許多步驟，包括囊泡形成、囊泡沿 著肌動蛋白和微管蛋白網絡移動和膜融合。因此，在晚期內體和溶酶體中表達的Rab7與經 標記的抗體的共染色指示FGFR2內化之後所述複合體進入內體-溶酶體途徑，而用在早期 內體和再循環內體中表達的Rabll進行的共染色則指示這些抗體結合FGFR2之後發生內化 並側重於再循環途徑。進入胞內體-溶酶體途徑使得所述抗體能夠在內化後誘導FGFR2的 降解，這最終導致該途徑的脫敏。圖7示出了實施例12中所述的本發明的典型抗體與Rab7 和Rabll的共染色模式。
[0155] 本發明的可內化抗體或抗原結合片段適於作為抗體-藥物綴合物（ADC)的靶向部 分。抗體或抗原結合片段適於在體外或體內方法中將化合物優選細胞毒性劑遞送至表達 FGFR2的細胞中。
[0156] 在一些實施方案中，分離了抗體、其抗原結合片段，或其衍生物或編碼它們的 核酸。分離的生物學組分（例如核酸分子或蛋白質，例如抗體）是已從所述組分天然 存在的生物體的細胞中其他生物學組分（例如，其他的染色體和染色體外DNA和RNA、 蛋白質和細胞器）中基本上分離或純化出來的生物學組分。已被"分離的"核酸和蛋 白質包括通過標準的純化方法純化的核酸和蛋白質，所述純化方法例如Sambrook et al. , 1989(Sambrook, J. , Fritsch,E.F.and Maniatis, T. (1989)Molecular Cloning:A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA)和 Robert K. Scopes eat al 1994 (Protein Purification, -Principles and Practice, Springer Science and Business Media LLC)中所述。該術語也包括通過宿主細胞中重組表達製備的 核酸和蛋白，以及化學合成的核酸。
[0157] 本發明的抗體可來源於重組抗體文庫，所述重組抗體文庫基於已經從大量健康志 願者的抗體中分離的胺基酸序列。使用n-CoDeR?技術可將完全的人cdr重組至新的抗 體分子中。獨特的重組方法使得所述文庫能夠含有比由人免疫系統天然產生的抗體種類更 多的抗體。
[0158] 抗體產生
[0159] 通過全細胞和蛋白質淘選（panning)的組合併且通過開發特異性方法，將完全人 N-CoDeR抗體噬菌體展示文庫用於分離本發明的FGFR2特異性的人單克隆抗體和其抗原結 合片段。這些方法包括能夠鑑定抗體的淘選方法和篩選測定法的開發，所述抗體優先結合 細胞表面上展示的FGFR2並且可與鼠 FGFR2和來自其他物種的FGFR2交叉反應，並且具有 不依賴於FGFR2過表達和在FGFR2相關疾病例如癌症中存在的普通FGFR2突變的結合和功 能活性。
[0160] 通過噬菌體展示技術（PDT)中三種非常規方法的結合來開發針對細胞表面FGFR2 的抗體。首先，使用某些剪接變體（α、β、mb和IIIc)的重組、可溶、人和鼠 FGFR2FC融 合蛋白進行選擇，以選擇非常寬的剪接變體交叉反應性。第二，使用其細胞表面表達FGFR2 的ΚΑΤ0 III細胞來進行額外的細胞表面選擇。第三，開發篩選方法，其允許連續篩選在全 ΚΑΤΟΠΙ細胞的淘選中獲得的噬菌體輸出，以及某些剪接變體（α、β、Illb和IIIc)的重 組、可溶、人和鼠 FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4Fc融合蛋白，以選擇具有非常寬的剪接變體 交叉反應性的FGFR2特異性結合體（不結合FGFR1、FGFR3和FGFR4)。
[0161] 鑑定優選的Fab片段之後，將這些Fab片段表達為全長IgG。例如抗體Fab 片段M048-D01 (對於VH鏈為SEQ ID NO: 31，對於VL鏈為SEQ ID NO: 32)被表達為人 IgGlM048-D01-hIgGl (對於重鏈為 SEQ ID N0:67,對於輕鏈為 SEQ ID N0:68)，以及 Fab 片段M047-D08 (對於VH鏈為SEQ ID NO: 21，對於VL鏈為SEQ ID NO: 22)被表達為人 IgGlM047-D08-hIgGl (對於重鏈為 SEQ ID N0:69,對於輕鏈為 SEQ ID N0:70)。為了有效的 克隆，重鏈（SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:69) N末端的前3個胺基酸[EVQ]或者還可被表達 為[QVE]，例如被表達為人IgGlM048-D01-hIgGl(SEQIDN0:222)的重鏈的變體。為了有效 的克隆，輕鏈的N末端可由胺基酸殘基例如丙氨酸延長。例如這些構建體在哺乳動物細胞 中短暫表達，如 Tom et al.，Chapterl2in Methods Express:Expression Systems edited by Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 中所記載。簡言之，將基 於CMV-啟動子的表達質粒轉染至HEK293-6E細胞中，在Fernbach燒瓶或搖袋（Wave-Bag) 中孵育。在F17培養基（Invitrogen)中於37°C下表達5-6天。轉染後24小時補充5g/ 1 膜蛋白腺 TNI (Organotechnie)、1 % Ultra-Low IgG FCS(Invitrogen)和 0· 5mM 丙戊酸 (Sigma)〇
[0162] 通過這些抗體在ELISA中的結合親和力和通過與可溶性FGFR2的BIAcore結合來 進一步表徵這些抗體。實施使用來自不同物種的細胞進行的FACS結合，以選擇在小鼠、大 鼠和人癌細胞系上具有高親和力的細胞結合抗體。
[0163] 這些特定方法的組合使得能夠分離獨特的抗體"M017-B02 "、"M021-H02 "、 "M047-D08 "、"M048-D01"、"M054-A05 " 和 "M054-D03 "。
[0164] 進一步的表徵揭示了所選擇的抗體結合至FGFR2的N末端上的獨特表位，導致其 特有的特徵。在體外磷酸化測定法、內化測定法和體內腫瘤異種移植物實驗中進一步表徵 這些獨特的抗體。在使用SNU16細胞的腫瘤異種移植物實驗中，所選擇的抗體表現出強烈 且顯著的抗腫瘤活性。
[0165] 肽變體
[0166] 本發明的抗體或抗原結合片段不限於本文提供的具體肽序列。相反，本發明還包 括這些多肽的變體。參考本公開內容和常規可用技術和參考文獻，技術人員能夠製備、測試 和利用本文公開的抗體的功能性變體，同時應理解具有結合FGFR2能力的這些變體落在本 發明的範圍內。
[0167] 變體可包括例如，與本文公開的肽序列相比，具有至少一個改變的互補決定區 (CDR)(高變的）和/或框架（FR)(可變的）域/位置的抗體。為了更好地說明這個概念， 下文簡要描述抗體結構。
[0168] 抗體由兩條肽鏈組成，每條鏈含有1個（輕鏈）或3個（重鏈）恆定結構域和1 個可變區（VL、VH)，後者在每種情況下均由4個FR區和3個間隔的CDR組成。所述抗原結 合位點由一個或多個CDR形成，而FR區為所述CDR提供結構框架，並且因此在抗原結合中 起重要作用。通過改變CDR或FR區中的一個或多個胺基酸殘基，技術人員可常規地產生突 變的或多樣化的抗體序列，所述抗體序列可用所述抗原進行篩選，用於例如篩選新的或改 善的特性。
[0169] 本發明的另一個優選實施方案為其中如表9所不選擇了 VH和VL序列的抗體或抗 原結合片段。技術人員可使用表9中的數據設計本發明範圍內的肽變體。優選通過改變一 個或多個CDR區內的胺基酸來構建變體；變體還可以具有一個或多個改變的框架區。還可 在框架區進行改變。例如，可改變其中與種系序列相比殘基有偏差的肽FR結構域。
[0170] 或者，技術人員可通過使用例如nappik A.，et al.，JMB2000, 296:57-86所記載的 方法，將本文公開的胺基酸序列與這類抗體的相同類別的已知序列進行比較，來進行相同 的分析。
[0171] 此外，可如下獲得變體：通過使用一種抗體作為優化的起點，通過使所述抗體中的 一個或多個胺基酸殘基，優選一個或多個CDR中的胺基酸殘基多樣化，並且通過篩選所得 的抗體變體集合以獲得具有改善特性的變體。特別優選的是VL和/VH的CDR3中的一個或 多個胺基酸殘基的多樣化（diversification)。多樣化可通過採用三核苷酸誘變（TRIM)技 術（Virnek§S B. et al.，Nucl. Acids Res. 1994, 22:5600.)來合成一批 DNA 分子來進行。 抗體或其抗原結合片段包括具有修飾/變化的分子，所述修飾/變化包括但不限於例如導 致半衰期改變（例如，修飾Fc部分或連接其他分子例如PEG)、結合親和力改變或者ADCC或 CDC活性改變的修飾。
[0172] 如表 10 中所述，給出了 M048-D01(TPP-1397、TPP-1398、TPP-1399、TPP-1400、 TPP-1401、TPP-1402 和 TPP-1403)和 M047-D08(TPP-1406、TPP-1407、TPP-1408、TPP-1409、 TPP-1410、TPP-1411、TPP-1412和TPP-1415)的抗體變體的實例。這些變體抗體的改善特 性不於表11。
[0173] 保守性胺基酸變體
[0174] 可以使得多肽變體保留本文所述的抗體肽序列的整體分子結構。考慮到各胺基酸 的特性，技術人員會認識到一些合理的置換。胺基酸置換，即"保守性置換"，可以例如在所 涉及的殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性質的相似性的基礎上進行。
[0175] 例如，（a)非極性（疏水性）胺基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)極性中性胺基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱 氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和穀氨醯胺；（c)荷正電（鹼性）胺基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨 酸；（d)荷負電（酸性）胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸。置換通常可以在（a)-(d)組內進 行。此外，基於它們破壞α -螺旋的能力，甘氨酸和脯氨酸可以相互置換。相似地，某些氨基 酸，例如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、穀氨酸、穀氨醯胺、組氨酸和賴氨酸更常見地 存在於α -螺旋中，而纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和蘇氨酸更常見地存在 於β-摺疊片中。甘氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、天冬醯胺和脯氨酸常見地存在於轉角（turn) 中。一些優選的置換可以在下組中進行：（i)S和T;(ii)P和G;(iii)A、V、L和I。考慮到 已知的遺傳密碼以及重組和合成DNA技術，技術人員可以容易地構建編碼保守性胺基酸變 體的DNA。
[0176] 用於本文時，兩條多肽序列之間的"序列同一性"表示所述序列之間相同的胺基酸 的百分比。"序列同源性"表示相同的或代表保守性胺基酸置換的胺基酸的百分比。
[0177] 本發明的DNA分子
[0178] 本發明還涉及編碼本發明的抗體或其抗原結合片段的DNA分子。這些序列包括但 不限於 SEQ IDs3、4、13、14、23、24、33、34、43、44、53 和 54 所示的那些 DNA 分子。
[0179] 本發明的DNA分子不限於本文公開的序列，還包括其變體。本發明中的DNA變體 可以參照它們在雜交中的物理特性來描述。技術人員會認識到利用核酸雜交技術，DNA可 用於鑑別其互補物以及（因為DNA是雙鏈的）其等同物或同系物。還會認識到雜交可以 以低於100%互補性發生。然而，考慮到條件的適當選擇，雜交技術可用於基於DNA序列 與與特定探針的結構相關性來區分所述DNA序列。對於這類條件的指導參見，Sambrook et al. , 1989supra and Ausubel et al. , 1995 (Ausubel, F. M. , Brent, R. , Kingston, R. E. , Moore, D. D. , Sedman, J. G. , Smith, J. A. , &Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons) 〇
[0180] 兩條多核苷酸序列之間的結構相似性可以表示為這兩個序列會彼此雜交的條件 的"嚴格性"的函數。用於本文時，術語"嚴格性"是指條件不利於雜交的程度。嚴格條件 非常不利於雜交，並且僅結構上最相關的分子會在這類條件下彼此雜交。相反地，非-嚴格 條件有利於表現出較低程度的結構相關性的分子的雜交。因此，雜交嚴格性與兩條核酸序 列的結構關係直接相關。以下關係可用於關聯雜交與相關性（其*T m為核酸雙鏈體的解 鏈溫度）：
[0181] a. Tm = 69. 3+0. 41 (G+C) %
[0182] b.錯配鹼基對數目每增加1 %，雙鏈體DNA的Tm降低1 °C。
[0183] C. (Tm) μ 2- (Tm) μ! = 18. 51og10 μ 2/ μ 1
[0184] 其中，μ 1和μ 2為兩種溶液的離子強度。
[0185] 雜交嚴格性是許多因素的函數，包括總DNA濃度、離子強度、溫度、探針大小以及 破壞氫鍵的試劑的存在情況。促進雜交的因素包括高DNA濃度、高離子強度、低溫、較長的 探針大小以及不存在破壞氫鍵的試劑。雜交通常在兩個階段中進行："結合"階段和"洗滌" 階段。
[0186] 功能等同的變體
[0187] 本發明的範圍內的另一類DNA變體可參考它們編碼的產物來描述。這些功能等 同的多核苷酸通過以下事實表徵：由於遺傳密碼的簡併性，它們編碼SEQ ID N0:1、2、5-12、 15-22、25-32、35-42、45-52、55-60 中存在的相同肽序列。
[0188] 據認為，本文提供的DNA分子的變體可以以若干種不同的方式構建。例如，它們可 以構建為完全合成的DNA。有效合成在20至約150個核苷酸的範圍內的寡核苷酸的方法可 廣泛獲得。參見 Ausubel etal.，section2.11，Supplement21(1993)。重疊寡核苷酸可以 通過Khorana et al.，J. Mol. Biol. 72:209-217(1971)首先報導的方式合成和裝配；也參見 Ausubel et al.，supra，Section8. 2。優選地設計合成的DNA以在所述基因的5'和3'末端 改造出方便的限制性位點，以便於克隆至適當載體中。
[0189] 如本文所示，產生變體的方法是從本文公開的DNA之一開始，然後進行定點突變。 參見 Ausubel et al·，supra, chapter8，Supplement37 (1997)。在典型方法中，將革 EDNA 克 隆至單-鏈DNA噬菌體載體中。分離單鏈DNA，並將其與含有所需核苷酸改變的寡核苷酸雜 交。合成互補鏈，並且將雙鏈噬菌體引入宿主中。一些所得的子代會含有所需的突變，這可 以利用DNA測序來證實。此外，可以使用多種方法來增加子代噬菌體為所述突變體的可能 性。這些方法對於本領域的技術人員是已知的，並且用於產生這類突變體的試劑盒是可商 購的。
[0190] 重組DNA構建體和表達
[0191] 本發明還提供了包含本發明的一個或多個核苷酸序列的重組DNA構建體。本發明 的重組構建體可與載體一起使用，所述載體例如質粒、噬粒、噬菌體或病毒載體，編碼本發 明的抗體或其抗原結合片段的DNA分子插入所述載體中。
[0192] 本文提供的抗體、抗原結合部分或其衍生物可通過在宿主細胞中重組表達編碼 輕鏈和重鏈或其部分的核酸序列來製備。為了以重組方法表達抗體、抗原結合部分或其 衍生物，可用攜帶編碼輕鏈和/或重鏈或其部分的DNA片段的一個或多個重組表達載體 轉染宿主細胞，以使得所述輕鏈和重鏈在所述宿主細胞中表達。標準重組DNA方法學被 用於製備和/或獲得編碼重鏈和輕鏈的核酸、將這些核酸納入重組表達載體中並且將 所述載體引入至宿主細胞中，例如 Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds. )，Molecular Cloning ；A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)> Ausubel, F. M. et al. (eds. ) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)和 Boss et al.的美國專利 No. 4, 816, 397 中記載的那些。
[0193] 此外，可將編碼所述重鏈和/或輕鏈的可變區的核酸序列轉化為例如編碼全長抗 體鏈、Fab片段或ScFv的核酸序列。可以將編碼VL或VH的DNA片段可操作地連接（以 使得所述兩個DNA片段編碼的胺基酸序列都在框架中）至編碼例如抗體恆定區或柔性接 頭的另一 DNA片段。人重鏈和輕鏈恆定區的序列是本領域中已知的（參見，例如Kabat，E. A. , el al. (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)，包括這些區 域的DNA片段可通過標準PCR擴增來獲得。
[0194] 在某些測定法中，優選本發明的抗體表達為鼠 IgG，例如通過使用鼠抗體可以更容 易地分析採用人樣品的免疫組織化學。因此，例如抗體Fab片段M048-D01 (對於VH鏈為 SEQ IDN0:31，對於 VL 鏈為 SEQ IDN0:32)被表達為鼠 IgG2a，被稱為 M048-D01-mIgG2a(對 於重鏈為SEQ ID N0:221)。該抗體還用於實施例17中作為對照。
[0195] 為了產生編碼scFv的多核苷酸序列，可將編碼VH和VL的核酸可操作連接 至編碼柔性接頭的另一片段，以使得所述VH和VL序列可以被表達為連續的單鏈蛋 白，且所述VL和VH區通過所述柔性接頭連接在一起（參見，例如Bird et al. (1988) Science242:423-426 ；Huston et al. (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883 ； McCafferty et al.，Nature(1990)348:552-554)。
[0196] 為了表達所述抗體、抗原結合部分或其衍生物，可使用標準重組DNA表達方法（參 見，例如，Goeddel ;Gene Expression Technology. Methods in Enzymologyl85, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))。例如，可將編碼所需多肽的DNA插入至表達載體中，隨後 將所述表達載體轉染至合適的宿主細胞中。合適的宿主細胞為原核細胞和真核細胞。原核 宿主細胞的實例為例如細菌，真核宿主細胞的實例為酵母、昆蟲或哺乳動物細胞。在一些實 施方案中，將編碼所述重鏈和輕鏈的DNA插入至不同載體中。在其他實施方案中，將編碼所 述重鏈和輕鏈的DNA插入至同一載體中。應理解，包括選擇調節序列的表達載體的設計受 到多種因素的影響，例如宿主細胞的選擇、所需的蛋白質的表達水平以及表達是組成型的 還是可誘導型的。
[0197] 細菌表達
[0198] 通過將編碼所需蛋白的結構DNA序列連同合適的翻譯起始和終止信號以及有功 能的啟動子插入可操作閱讀相（phase)中，來構建可用於細菌的可用表達載體。所述載體 會包含一個或多個表型選擇標記以及複製起點以確保維持所述載體，以及根據需要在宿主 內提供擴增。用於轉化的合適的原核宿主包括大腸桿菌（E. coli)、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)以及假單胞菌屬（Pseudomonas)、 鏈黴菌屬（Streptomyces)和葡萄球菌屬（Staphylococcus)中的多個種。
[0199] 細菌載體可以是例如基於噬菌體、質粒或噬粒的。這些載體可含有選擇標記和細 菌複製起點，其來源於通常含有公知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的元件的可商購的質 粒。轉化合適的宿主菌株並使所述宿主菌株生長至適當細胞密度之後，通過適當的方法 (例如，溫度變化或化學誘導）將所選擇的啟動子去阻遏/誘導，並且將細胞培養額外的時 間。通常通過離心收穫細胞，通過物理或化學方法使細胞破裂，並且保留所得的粗提取物用 於進一步純化。
[0200] 在細菌系統中，根據所表達的蛋白的目的用途，可有利地選擇多種表達載體。例 如，當要生產大量這樣的蛋白用於生產抗體或用於篩選肽文庫時，例如，可能需要指導易於 純化的融合蛋白產物的高水平表達的載體。
[0201] 因此，本發明的實施方案為包含編碼本發明的新抗體的核酸序列的表達載體。參 見實施例2的示例性描述。
[0202] 本發明的抗體或其抗原結合片段包括天然純化的產物、化學合成方法的產物和通 過重組技術從原核宿主產生的產物，所述原核宿主包括，例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠 傷寒沙門氏菌以及假單胞菌屬、鏈黴菌屬和葡萄球菌屬內的多個種，優選大腸桿菌細胞。
[0203] 哺乳動物表達和純化
[0204] 用於哺乳動物宿主細胞表達的優選調節序列包括在哺乳動物細胞中指導高水平 蛋白表達的病毒元件、例如源於巨細胞病毒（CMV)的啟動子和/或增強子（例如CMV啟 動子/增強子）、猿猴病毒40 (SV40)的啟動子和/或增強子（例如SV40啟動子/增強 子）、腺病毒的啟動子和/或增強子（例如腺病毒主要晚期啟動子（AdMLP))和多瘤病毒 的啟動子和/或增強子。對病毒調節元件及其序列的進一步描述參見例如，Stinski的 U. S. 5, 168, 062、Bell et al.的 U. S. 4, 510, 245 和 Schaffner et al 的 U. S. 4, 968, 615。重 組表達載體還可以包括複製起點和選擇標記（參見例如，Axel et al的U. S. 4, 399, 216、 4, 634, 665和U. S. 5, 179, 017)。合適的選擇標記包括賦予已經引入所述載體的宿主細胞對 藥物例如G418、潮黴素或甲氨蝶呤的抗性的基因。例如，二氫葉酸還原酶（DHFR)基因賦予 對甲氨蝶呤的抗性，而neo基因賦予對G418的抗性。對於有效的克隆，重鏈（SEQIDN0:67 和SEQ ID N0:69)N末端的前3個胺基酸[EVQ]或者還可被表達為[QVE]，例如被表達為人 IgGlM048-D01-hIgGl(SEQ IDN0:222)的重鏈的變體。對於有效的克隆，輕鏈的N末端可由 胺基酸殘基例如丙氨酸延長。
[0205] 將所述表達載體至宿主細胞中的轉染可以利用標準技術例如電穿孔、磷酸鈣沉澱 和DEAE-葡聚糖轉染來進行。
[0206] 用於表達本文提供的抗體、抗原結合部分或其衍生物的合適的哺乳動物宿主細胞 包括中國倉鼠卵巢（CH0細胞）[包括dhfr-CHO細胞，記載於UrlaubandChasin，（1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:4216-4220 中，使用 DHFR 選擇標記，例如記載於 R. J. Kaufman andP. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621 中]，NS0骨髓瘤細胞、COS 細胞和 SP2 細胞。 在一些實施方案中，設計表達載體，使得所表達的蛋白分泌至所述宿主細胞生長的培養基 中。所述抗體、抗原結合部分或其衍生物可使用標準蛋白質純化方法從所述培養基中回收。
[0207] 本發明的抗體或其抗原結合片段可通過公知方法從重組細胞培養物回收和純化， 所述公知方法包括，但不限於，硫酸銨或乙醇沉澱、酸提取、Protein A色譜法、Protein G 色譜法、陰離子或陽林子交換色譜法、磷酸纖維素色譜法、疏水相互作用色譜法、親和色譜 法、羥磷灰石色譜法以及凝集素色譜法。高效液相色譜法（"HPLC"）也可用於純化。參 見例如，Colligan, Current Protocols in Immunology,或 Current Protocols in Protein Science, John Wiley&Sons, NY, N. Y.，（1997-2001)，例如第 1、4、6、8、9、10 章，各自以引用的 方式全文納入本文。
[0208] 本發明的抗體或其抗原結合片段包括天然純化的產物、化學合成方法的產物和 通過重組技術從真核宿主產生的產物，所述真核宿主包括，例如酵母、高等植物、昆蟲和哺 乳動物細胞。根據重組生產方法中所使用的宿主，本發明的抗體可以是糖基化的，或者 可以是非糖基化的。這類方法記載於許多標準實驗室手冊中，例如上文的Sambrook，第 17. 37-17. 42 節；上文的 Ausubel，第 10、12、13、16、18 和 20 章。
[0209] 因此，本發明的實施方案還為包含所述載體或核酸分子的宿主細胞，其中所述宿 主細胞可為高等真核宿主細胞例如哺乳動物細胞、低等真核宿主細胞例如酵母細胞，並可 為原核細胞例如細菌細胞。
[0210] 本發明的另一個實施方案是使用所述宿主細胞產生抗體和抗原結合片段的方法， 所述方法包括在合適的條件下培養所述宿主細胞並回收所述抗體。
[0211] 因此，本發明的另一個實施方案是使用本發明的宿主細胞產生本發明抗體（例如 抗體M048-D01-hIgGl)，以及將這些抗體純化至至少95重量％的同質性。
[0212] 治療方法
[0213] 治療方法包括向有治療需要的受試者給予治療有效量的本發明考慮到的抗體或 其抗原結合片段。"治療有效"量在本文定義為抗體或抗原結合片段的量，其是足以作為單 一劑量或根據多劑量方案，單獨或聯合其他試劑，耗盡受試者治療區中的FGFR2陽性細胞 的量，這導致不利病症的減輕，而且所述量是毒理學上可耐受的。所述受試者可為人或非人 動物（例如兔、大鼠、小鼠、狗、猴子或其他更低目的靈長類）。
[0214] 本發明的抗體或其抗原結合片段可以與已知藥物共同給藥，並且在一些實例中， 所述抗體本身可被修飾。例如，抗體可綴合至細胞毒性試劑或放射性同位素，以可能進一步 增加效能。
[0215] 本發明的抗體可以作為單獨的藥物試劑給予或與一種或多種額外的治療性試劑 組合給予，其中所述組合不會引起不可接受的不利影響。該組合療法包括給予含有本發明 的抗體和一種或多種額外的治療性試劑的單一藥物劑型，以及給予其自己單獨的藥物劑型 形式的本發明抗體和每種額外的治療性試劑。例如，本發明的抗體和治療性試劑可以以單 一口服劑量組合物的形式例如片劑或膠囊劑共同給予所述患者，或者每種試劑可以以單獨 的劑型形式給予。
[0216] 當使用單獨的劑型時，本發明的抗體和一種或多種額外的治療性試劑可以在基本 上相同的時間（例如同時地）或者在各自錯開的時間（例如慣序地）給予。
[0217] 具體地，本發明的抗體可以與其他抗腫瘤試劑固定組合或單獨組合使用，所述其 他抗腫瘤試劑例如烷化劑、抗代謝藥、植物來源的抗腫瘤試劑、激素治療試劑、拓撲異構酶 抑制劑、喜樹鹼衍生物、激酶抑制劑、靶向藥物、抗體、幹擾素和/或生物應答調節劑、抗血 管生成的化合物，以及其他抗腫瘤藥物。在這方面，以下是可以與本發明的抗體組合使用的 第二試劑的實例的非限制性列表：
[0218] 烷化劑包括，但不限於，氮芥N氧化物、環磷醯胺、異環磷醯胺、塞替派、雷莫司汀、 尼莫司汀、替莫唑胺、六甲蜜胺、阿帕齊醌、溴他利星、苯達莫司汀、卡莫司汀、雌莫司汀、福 莫司汀、葡膦醯胺、馬磷醯胺、苯達莫司汀和二溴衛矛醇；鉬配位的烷化化合物包括，但不限 於，順鉬、卡鉬、艾鉬、洛鉬、奈達鉬、奧沙利鉬和沙鉬；
[0219] 抗代謝藥包括，但不限於，甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤核苷、巰基嘌呤、5-氟尿嘧啶（單 獨或與亞葉酸組合）、替加氟、去氧氟尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽、 依諾他濱、吉西他濱、氟達拉賓、5_阿扎胞苷、卡培他濱、克拉屈濱、氯法拉濱、地西他濱、依 氟鳥氨酸、乙炔基胞苷、胞嘧啶阿糖核苷、羥基脲、美法侖、奈拉濱、諾拉曲塞、十八烷基磷酸 鹽（ocfosfite)、培美曲塞二鈉、噴司他丁、批利曲索、雷替曲塞、triapine、三甲曲沙、阿糖腺 苷、長春新鹼和長春瑞濱；
[0220] 激素治療劑包括，但不限於，依西美坦、亮丙瑞林、阿那曲唑、度骨化醇、法羅唑、福 美坦、ll-β羥基類固醇脫氫酶1抑制劑、17-α羥化酶/17,20裂解酶抑制劑例如醋酸阿比 特龍、5-α還原酶抑制劑例如非那雄胺和愛普列特、抗雌激素類例如枸櫞酸他莫昔芬和氟 維司群、曲普瑞林、託瑞米芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、來曲唑、抗雄激素類例如比卡魯胺、氟他 胺、米非司酮、尼魯米特、康士得和抗黃體酮及其組合；
[0221] 植物來源的抗腫瘤物質包括例如選自有絲分裂抑制劑的物質，例如埃博黴素例如 沙戈匹隆、伊沙匹隆和愛波喜龍B、長春鹼、長春氟寧、多西他賽和紫杉醇；
[0222] 細胞毒性拓撲異構酶抑制劑包括但不限於阿柔比星、多柔比星、氨萘非特、貝洛 替康、喜樹鹼、10-羥喜樹鹼、9-氨基喜樹鹼、二氟替康、伊立替康、託泊替康、艾特咔林、 epimbicin、依託泊苷、依沙替康、吉馬替康、勒託替康、米託蒽醌、pirambicin、匹克生瓊、蘆 比替康、索布佐生、他氟泊苷及其組合；
[0223] 免疫藥包括幹擾素（例如幹擾素 α、幹擾素 a _2a、幹擾素 a _2b、幹擾素 β、幹擾 素 Y-la和幹擾素 γ-nl)和其他免疫增強劑例如L19-IL2和其他IL2衍生物、非格司亭、香 燕多糖、西左非蘭、TheraCys、烏苯美司、阿地白介素、阿侖珠單抗、BAM-002、達卡巴嗪、達克 珠單抗、地尼白介素、吉妥珠單抗、奧加米星、替伊莫單抗、咪喹莫德、來格司亭、香菇多糖、 黑素瘤疫苗（Corixa)、莫拉司亭、沙格司亭、他索納明、替西白介素、胸腺法新、託西莫單抗、 Vimlizin、依帕珠單抗、米妥莫單抗、奧戈伏單抗、帕尼單抗和Provenge ;
[0224] 生物反應調節劑是改進活生物的防禦機制或生物反應（例如組織細胞的存活、生 長或分化）以引導它們具有抗腫瘤活性的藥劑；這類藥劑包括例如雲芝多糖、香菇多糖、西 佐喃、溶血性鏈球菌製劑（picibanil)、ProMune和烏苯美司；
[0225] 抗血管生成化合物包括但不限於阿維A、阿柏西普、血管生長抑素、阿普立定 (aplidine)、asentar、阿昔替尼、貝伐單抗、丙氨酸布立尼布（brivanib alaninat)、西侖吉 肽（cilengtide)、考布他汀、內皮生長抑素、芬維A胺、齒夫酮、帕唑帕尼、雷珠單抗、瑞馬司 他、瑞司汀（recentin)、瑞戈非尼，、卡妥索單抗（removab)、來那度胺（revlimid)、索拉非 尼、角S胺、舒尼替尼、替拉替尼、沙利度胺、ukrain、伐他拉尼和維他辛（vitaxin);
[0226] 抗體包括但不限於曲妥單抗、西妥昔單抗、貝伐單抗、利妥昔單抗、替西木單抗、伊 匹木單抗、魯昔單抗、卡妥索單抗（catumaxomab)、阿塞西普、奧戈伏單抗和阿侖珠單抗；
[0227] VEGF抑制劑例如索拉非尼、瑞戈非尼、貝伐單抗、舒尼替尼、瑞司汀、阿昔替尼、阿 柏西普、替拉替尼、丙氨酸布立尼布、伐他拉尼、帕唑帕尼和雷珠單抗；
[0228] EGFR(HERl)抑制劑例如西妥昔單抗、帕尼單抗、維克替比（vectibix)、吉非替尼、 埃羅替尼和凡德他尼（Zactima);
[0229] HER2抑制劑例如拉帕替尼、曲妥單抗（tratuzumab)和培妥珠單抗；
[0230] mTOR抑制劑例如坦羅旲司、西羅旲司/雷帕黴素和依維旲司；
[0231] c-Met 抑制劑；
[0232] PI3K 和 AKT 抑制劑；
[0233] Q3K抑制劑例如細胞周期蛋白依賴激酶（roscovitine)和黃酮比多 (flavopiridol)；
[0234] 紡錘體裝配檢查點抑制劑和靶向的抗有絲分裂劑例如PLK抑制劑、Aurora抑制劑 (例如Hesperadin)、檢查點激酶抑制劑和KSP抑制劑；
[0235] HDAC抑制劑例如帕比司他、伏林司他、MS275、貝林司他和LBH589 ;
[0236] HSP90 和 HSP70 抑制劑；
[0237] 蛋白酶體抑制劑例如硼替佐米和卡非佐米；
[0238] 絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑包括MEK抑制劑和Raf抑制劑例如索拉非尼；
[0239] 法尼基轉移酶抑制劑例如替匹法尼；
[0240] 酪氨酸激酶抑制劑包括例如達沙替尼、尼洛替尼（nilotibib)、瑞戈非尼、波舒替 尼、索拉非尼、貝伐單抗、舒尼替尼、西地尼布、阿昔替尼、阿柏西普、替拉替尼、甲磺酸伊馬 替尼、丙氨酸布立尼布、帕唑帕尼、雷珠單抗、伐拉尼布、西妥昔單抗、帕木單抗、維克替比、 吉非替尼、埃羅替尼、拉帕替尼、曲妥單抗、培妥珠單抗和C-Kit抑制劑；
[0241] 維生素 D受體激動劑；
[0242] Bcl-2蛋白抑制劑例如奧巴克拉、奧利美生鈉和棉酚；
[0243] 分化 20 受體族拮抗劑（Cluster of differentiation20receptor antagonist)的 簇，例如利妥昔單抗；
[0244] 核糖核苷酸還原酶抑制劑例如吉西他濱；
[0245] 腫瘤壞死細胞凋亡誘導配體受體I激動劑例如馬帕木單抗；
[0246] 5-輕色胺受體拮抗劑例如rEV598、扎利羅登（xaliprode)、鹽酸帕洛諾司瓊、格拉 司瓊、Zindol 和 AB-1001 ;
[0247] 整聯蛋白抑制劑包括α 5-β 1整聯蛋白抑制劑，例如E7820、JSM6425、伏洛昔單抗 和內皮生長抑素；
[0248] 雄激素受體拮抗劑包括例如癸酸諾龍、氟甲睪酮、甲睪酮、Prost-aid、安卓姆斯汀 (andromustine)、比卡魯胺、氟他胺、載脂蛋白環丙孕酮（apo-cyproterone)、載脂蛋白氟他 胺（apo-flutamide)、醋酸氯地孕酮、色普龍、Tabi、醋酸環丙孕酮和尼魯米特；
[0249] 芳香酶抑制劑例如阿那曲唑、來曲唑、睪內酯、依西美坦、氨魯米特和福美坦；
[0250] 基質金屬蛋白酶抑制劑；
[0251] 其它抗癌藥劑包括例如阿利維A酸、聚肌胞、阿曲生坦、貝沙羅汀、硼替佐米、波生 坦、骨化三醇、依昔舒林、福莫司汀、伊班膦酸、米替福新、米託蒽醌、I-天冬醯胺酶、丙卡巴 肼、達卡巴嗪、輕基脲、培門冬酶、噴司他丁、他扎羅汀（tazaroten)、萬河（velcade)、硝酸 鎵、坎磷醯胺、達雷那新和維A酸。
[0252] 在一個優選的實施方案中，本發明的抗體可以與化學療法（即細胞毒性試劑）、抗 激素和/或靶向療法例如其他激酶抑制劑（例如EFGR抑制劑）、mT0R抑制劑和血管生成抑 製劑組合使用。
[0253] 本發明的化合物還可與放射療法和/或外科手術聯合用於癌症治療。
[0254] 本發明的抗體或其抗原結合片段在一些實例中可以自身被修飾。例如，抗體可以 綴合至任何但不限於上文提及的化合物或任何放射性同位素，以可能進一步增加效能。此 夕卜，本發明的抗體可以本身或在組合物中使用，用於研究和診斷中，或者用作分析參考標 準，等等，這些在本領域中是公知的。
[0255] 本發明的抗體或其抗原結合片段可在多種具有異常FGFR2信號傳導的情形中-- 例如細胞增殖疾病例如癌症或纖維化疾病--用作治療或診斷工具。特別適合用本發明的 抗體治療的疾病和病症為實體瘤，例如乳腺、呼吸道、腦、生殖器官、消化道、泌尿道、眼、肝、 皮膚、頭頸、甲狀腺、副甲狀腺的癌症，及其遠端轉移。那些疾病還包括淋巴瘤、肉瘤和白血 病。
[0256] 消化道的腫瘤包括，但不限於肛門癌、結腸癌、結直腸癌、食管癌、膽囊癌、胃癌、胰 腺癌、直腸癌、小腸癌和唾液腺癌。
[0257] 食管癌的實例包括，但不限於食管細胞癌和腺癌，以及鱗狀細胞癌、平滑肌肉瘤、 惡性黑色素瘤、橫紋肌肉瘤和淋巴瘤。
[0258] 胃癌的實例包括，但不限於腸型胃腺癌和彌散性胃腺癌。
[0259] 胰腺癌的實例包括，但不限於導管腺癌、腺鱗癌和胰腺內分泌腫瘤。
[0260] 乳腺癌的實例包括，但不限於三陰性乳腺癌、浸潤性導管癌、浸潤性小葉癌、原位 導管癌和原位小葉癌。
[0261] 呼吸道癌症的實例包括，但不限於小細胞肺癌和非小細胞肺癌，以及支氣管腺瘤 和胸膜肺母細胞瘤。
[0262] 腦癌的實例包括，但不限於腦幹和下丘腦神經膠質瘤、小腦和大腦星形細胞瘤、膠 質母細胞瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤，以及神經外胚層和松果體腫瘤。
[0263] 男性生殖器官腫瘤包括，但不限於前列腺癌和睪丸癌。女性生殖器官腫瘤包括，但 不限於子宮內膜癌、宮頸癌、卵巢癌、陰道癌和外陰癌，以及子宮肉瘤。
[0264] 卵巢癌的實例包括，但不限於漿液性腫瘤、子宮內膜樣腫瘤、粘液囊腺癌、粒層細 胞瘤、Sertoli-Leydig細胞瘤和含睪丸母細胞瘤。
[0265] 宮頸癌的實例包括，但不限於鱗狀細胞癌、腺癌、腺鱗狀癌、小細胞癌、神經內分泌 癌、玻璃狀細胞癌和絨毛腺性腺癌。
[0266] 泌尿道腫瘤包括，但不限於膀胱癌、陰莖癌、腎癌、腎盂癌、輸尿管癌、尿道癌，以及 遺傳性和自發性乳突狀腎癌（papillary renal cancer)。
[0267] 腎癌的實例包括，但不限於腎細胞癌、膀胱上皮細胞癌、腎小球旁細胞瘤（腎素 瘤）、血管肌脂瘤、腎嗜酸細胞瘤、比裡尼導管癌、腎透明細胞肉瘤、中胚葉腎瘤和腎母細胞 瘤。
[0268] 膀胱癌的實例包括，但不限於移行細胞癌、鱗狀細胞癌、腺癌、肉瘤和小細胞癌。
[0269] 眼癌包括，但不限於眼內黑色素瘤和視網膜母細胞瘤。
[0270] 肝癌的實例包括，但不限於肝細胞癌（伴或不伴纖維板層變體的肝細胞癌）、膽管 癌（肝內膽管癌）以及混合型肝細胞癌和膽管癌。
[0271] 皮膚癌包括，但不限於鱗狀細胞癌、卡波西肉瘤、惡性黑素瘤、梅克爾細胞皮膚癌 和非黑色素瘤皮膚癌。
[0272] 頭頸癌包括,但不限於頭頸部鱗狀細胞癌、喉癌、下咽癌、鼻咽癌、口咽癌、唇癌和 口腔癌，以及鱗狀細胞癌。
[0273] 淋巴瘤包括，但不限於AIDS相關的淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、 伯基特淋巴瘤、霍奇金病和中樞神經系統淋巴瘤。
[0274] 肉瘤包括，但不限於軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、淋巴肉瘤和橫紋 肌肉瘤。
[0275] 白血病包括，但不限於急性髓性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞 白血病、慢性髓性白血病和多毛細胞白血病。在優選的實施方案中，本發明的抗體或其抗原 結合片段適合用於治療或診斷癌症疾病的治療或診斷方法，所述癌症疾病包括在以下癌症 組中：胃癌、乳腺癌、胰腺癌、結直腸癌、腎癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、子宮內膜癌、 食管癌、頭頸癌、肝細胞癌、黑色素瘤和膀胱癌。此外，本發明的抗體或其抗原結合片段還可 用作治療或診斷多種涉及FGFR2的其他疾病的工具，所述其他疾病例如，但不限於纖維化 疾病例如肺泡內纖維化、二氧化矽誘導的肺纖維化、實驗性肺纖維化、特發性肺纖維化、腎 纖維化、以及淋巴管平滑肌增多症、多囊卵巢症候群、痤瘡、銀屑病、膽脂瘤、膽脂瘤型慢性 中耳炎、牙周炎、曬斑、腸病、動脈粥樣硬化或子宮內膜異位症。
[0276] 上文提到的疾病在人中已被充分地表徵，但是也以相似的病因學存在於其他動物 (包括哺乳動物）中，並且可通過給予本發明的藥物組合物進行治療。
[0277] 為了治療任一種上述疾病，按照本發明使用的藥物組合物可以通過使用一種或多 種生理學上可接受的載體或賦形劑以常規方式配製。本發明的抗體或其抗原結合片段可通 過任何合適的方法給予，所述給藥方法可以根據待治療的疾病的類型而有所不同。可能的 給藥途徑包括腸胃外（例如，肌肉內、靜脈內、動脈內、腹腔內或皮下）、肺內和鼻內給藥，並 且根據需要，對於局部免疫抑制治療採用病灶內給藥。此外，本發明的抗體可通過使用例如 遞減劑量的所述抗體的脈衝輸注給予。優選地，所述給藥是通過注射進行，最優選靜脈內或 皮下注射，這部分地取決於所述給藥是短暫還是長期的。待給予的量取決於多種因素例如 臨床症狀、個體的重量、是否給予其他藥物。技術人員會認識到給藥途徑根據待治療的疾病 或病症而有所不同。
[0278] 確定本發明的新多肽的治療有效量，主要取決於具體患者特徵、給藥途徑 以及待治療的疾病的性質。一般性指導記載於例如國際協調會議的出版物中以及 REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第 27 和 28 章，484-528 頁（18th ed.，Alfonso R. Gennaro, Ed.，Easton, Pa. :Mack Pub. Co.，1990)中。更具體地，確定治療有效量，取決於 諸如藥物的毒性和效能（efficacy)的因素。毒性可使用本領域中公知的和上述參考文獻中 記載的方法測定。效能可利用相同的指導結合下文實施例中所述的方法測定。
[0279] 診斷方法
[0280] FGFR2的抗體或其抗原結合片段可用於檢測表達FGFR2的腫瘤的存在。在多種生 物樣品（包括血清和組織活檢標本）中含有FGFR2的細胞或脫落的FGFR2的存在，可使用 FGFR2的抗體檢測。此外，FGFR2的抗體可用於多種成像方法學，例如使用綴合有"Tc (或 其他同位素）的抗體進行的免疫閃爍成像。例如，與最近記載的使用綴合有mIn的抗PSMA 的抗體的成像方法類似的成像方法，可用於檢測胰腺癌或卵巢癌（5〇(^6 6丨31.，(：1111.燦(3· Med. 21:759-766, 1997)。另一個可用的檢測方法是通過將本發明的抗體與合適的同位素綴 合進行的正電子發射斷層掃描，（參見Herzog et al.，J. Nucl. MecL 34:2222-2226, 1993)。
[0281] 藥物組合物和給藥
[0282] 本發明的實施方案為包含抗FGFR2的抗體或其抗原結合片段的藥物組合物，所述 抗體或抗原結合片段是單獨的或與至少一種其他試劑（例如穩定化合物）組合，所述藥物 組合物可以在任何無菌的生物相容性藥物載體中給藥，所述載體包括但不限於鹽水、緩衝 鹽水、葡萄糖和水。另一個實施方案為包含結合FGFR2的抗體或其抗原結合片段和其他藥 物活性化合物的藥物組合物，所述其他藥物活性化合物適於治療與FGFR2相關的疾病例如 癌症。可將任何這些分子在藥物組合物中單獨或與其他試劑、藥物或激素組合給予患者，在 所述藥物組合物中所述分子與賦形劑或可藥用載體混合。在本發明的一個實施方案中，所 述可藥用載體在藥學上是惰性的。
[0283] 本發明還涉及藥物組合物的給藥。這種給藥可經口或經腸胃外完成。腸胃外遞送 的方法包括體表、動脈內（直接至腫瘤）、肌肉內、皮下、髓內、鞘內、心室內、靜脈內、腹膜內 或鼻內給藥。除了活性成分以外，這些藥物組合物可以含有合適的可藥用載體，包括賦形劑 和助劑，其有利於將所述活性化合物加工為在藥學上可使用的製劑。製劑和給藥技術的進 一步細節可以在最新版本的 Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.)中找到。
[0284] 用於口服給藥的藥物組合物可使用本領域中公知的可藥用載體以適於口服給藥 的劑量配製。這類載體使得所述藥物組合物可被配製為片劑、丸劑、錠劑、膠囊劑、液體、凝 膠劑、糖漿劑、膏劑、懸液等，用於患者攝取。
[0285] 用於口服使用的藥物製劑可通過以下方式獲得：將活性化合物與固體賦形劑組 合，任選地研磨所得的混合物，根據需要加入合適的助劑之後，加工所述粒料混合物以獲得 片劑或錠劑的片芯。合適的賦形劑是碳水化合物或蛋白質填充劑例如糖，包括乳糖、蔗糖、 甘露醇或山梨醇；來自玉米、小麥、稻、土豆或其他植物的澱粉；纖維素例如甲基纖維素、羥 丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉；膠，包括阿拉伯膠和西黃蓍膠；以及蛋白質例如明膠 和膠原。根據需要，可加入崩解劑或增溶劑，例如交聯的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、藻酸或它們 的鹽,例如藻酸鈉。
[0286] 錠劑片芯與合適的包衣（例如濃縮糖溶液）一起提供，其還可能含有阿拉伯膠、滑 石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液以及合適的有機溶劑 或溶劑混合物。可向所述片劑或錠劑包衣中加入染料或色素，用於產品辨識或表徵活性化 合物的量，即劑量。
[0287] 可口服使用的藥物製劑包括由明膠製成的壓入式（push-fit)膠囊，以及由明膠和 包衣（例如甘油和山梨醇）製成的軟的密封膠囊。壓入式膠囊可含有與填充劑或粘合劑 (例如乳糖或澱粉）、潤滑劑（例如滑石或硬脂酸鎂）和任選的穩定劑混合的活性成分。在 軟膠囊中，可在有或沒有穩定劑的情況下將活性化合物溶解或懸浮在合適的液體中，例如 脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。
[0288] 用於腸胃外給藥的藥物製劑包括活性化合物的水溶液。為了注射，可以將本發明 的藥物組合物配製於水溶液中，優選生理學上相容的緩衝液例如漢克斯（Hank)溶液、林格 氏（Ringer)溶液或生理緩衝鹽水。水性注射懸液可含有增加該懸液的粘度的物質，例如羧 甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。此外，所述活性化合物的懸液可以製備為適當的油性注射 懸液。合適的親脂性溶劑或賦形劑（vehicles)包括脂肪油例如芝麻油，或者合成的脂肪酸 酯例如油酸乙酯或甘油三酯，或者脂質體。任選地，所述懸液還可含有合適的穩定劑或增加 所述化合物的溶解度以允許製備高度濃縮溶液的試劑。
[0289] 為了局部或經鼻給藥，適合待滲透的特定屏障的滲透劑可以被用於該製劑。這類 滲透劑是本領域中通常已知的。
[0290] 試劑盒
[0291] 本發明還涉及藥物包裝和包含一個或多個容器的試劑盒，所述容器裝有上文提到 的本發明組合物的一種或多種成分。與這類容器相關的可以是管理藥物或生物製品的生 產、使用或銷售的政府機構所規定的形式的提示，其反映被所述產品的生產、使用或銷售的 機構批准用於人類給藥。
[0292] 在另一個實施方案中，所述試劑盒可含有編碼本發明抗體的DNA序列。優選地，所 述編碼這些抗體的DNA序列在適用於轉染至宿主細胞內並由宿主細胞表達的質粒中提供。 所述質粒可含有啟動子（通常為誘導型啟動子）以調節所述DNA在宿主細胞中的表達。所 述質粒還可含有適當的限制性位點以便於將其他DNA序列插入至所述質粒中以產生各種 抗體。所述質粒還可含有多種其他元件以有利於所編碼蛋白的克隆和表達。這類元件是本 領域技術人員公知的，並且包括例如選擇標記、起始密碼子、終止密碼子等。
[0293] 製備和儲存
[0294] 本發明的藥物組合物可以以本領域中已知的方式製備，例如通過常規的混合、溶 解、造粒、錠劑製備、研磨（levigating)、乳化、包裹、包埋或凍幹方法。
[0295] 所述藥物組合物可以鹽的形式提供，可以用酸形成，所述酸包括但不限於鹽酸、 硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。鹽更易溶於相應的游離鹼形式的水性或其 他質子性溶劑。在其他情況中，優選的製劑可以為在PH4. 5-5. 5下的lmM-50mM組氨酸、 0. 1% -2%蔗糖、2% -7%甘露醇中的凍乾粉，其在使用之前與緩衝液組合。
[0296] 在已經製備包含配製於可接受的載體中的本發明化合物的藥物組合物之後，可以 將它們放置在適當的容器中並貼上標籤用於治療所標明的病症。對於抗FGFR2的抗體或其 抗原結合片段的給藥，這類標籤會包括給藥的量、頻率和方法。
[0297] 治療有效劑量
[0298] 適用於本發明的藥物組合物包括其中含有有效量的活性成分以實現預期目的 (即治療以FGFR2表達表徵的具體疾病狀態）的組合物。有效劑量的確定在本領域技術人 員的能力之內。
[0299] 對於任何化合物，治療有效劑量最初可在細胞培養測定法例如贅生性細胞，或在 動物模型（通常為小鼠、兔、狗、豬或猴）中估計。動物模型也可用於獲得所需的給藥的濃 度範圍和途徑。然後這類信息可用於確定在人中給藥的可用劑量和途徑。
[0300] 治療有效劑量是指改善症狀或病症的抗體或其抗原結合片段的量。這類化合 物的治療效果和毒性可通過在細胞培養或實驗動物中進行的標準藥學方法來確定，例如 ED5Q (在群體的50%中治療有效的劑量）和LD5(I (對群體的50%致死的劑量）。治療作用 和毒性作用之間的劑量比為治療指數，其可表示為比值ED5(I/LD 5(I。表現出大的治療指數的 藥物組合物是優選的。獲自細胞培養測定法和動物研究的數據被用於配製人使用的劑量範 圍。這類化合物的劑量優選地在循環濃度的範圍內，所述範圍包括具有很少毒性或無毒性 的ED 5(I。根據所用的劑型、患者的敏感性和給藥途徑，劑量在該範圍內有所變化。
[0301] 確切劑量由個體醫師根據待治療的患者來選擇。調整劑量和給藥以提供足夠水平 的活性部分或維持所需的作用。可以考慮的其他因素包括疾病狀態的嚴重性；例如腫瘤大 小和位置；患者的年齡、體重和性別；飲食、給藥的時間和頻率、藥物組合、反應敏感性和對 治療的耐受性和應答。根據具體製劑的半衰期和清除率，長效藥物組合物可每3-4天、每周 或每兩周一次給藥。
[0302] 根據給藥途徑，正常劑量可以在0. 1至100, 000微克，最高達約2g的總劑量內變 化。具體遞送劑量和方法的指導提供在文獻中。參見U. S專利No. 4, 657, 760 ;5, 206, 344 ; 或5, 225, 212。對於多核苷酸，本領域的技術人員會使用與蛋白質或它們的抑制劑的製劑不 同的製劑。相似地，多核苷酸或多肽的遞送會是特定細胞、病症、部位等特異性的。放射性 標記的抗體的優選特異性活性可以為〇· 1至10mCi/mg的蛋白（Riva et al.，Clin. Cancer Res. 5:3275-3280, 1999 ;Ulaner et al.，2008Radiology246(3):895-902)。
[0303] 本發明通過以下實施例進一步描述。提供實施例僅為了參考具體實施方案說明本 發明。這些例證雖然說明本發明的某些特定方面，但是不意圖限制或者限定所公開的本發 明的範圍。
[0304] 所有實施例均利用標準技術進行，所述標準技術對於本領域技術人員來說是公知 和常規的，除了當另有詳細描述時。以下實施例的常規分子生物學技術可以依標準實驗室 手冊進行，例如 Sambrook et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed. ；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N. Y.，1989。
[0305] 本發明的優選實施方案為：
[0306] A.分離的抗體或其抗原結合片段，其在結合過表達FGFR2的細胞系 SNU16(ATCC-CRL-5974)和 MFM223(ECACC-98050130)和表達突變的 FGFR2 的細胞系 八吧-04(05]\^-4〇：267)和]^屯-296伍04〇：-98031101)中的？6?1?2之後，降低？6?1?2的細胞表 面表達。
[0307] B.權利要求A的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段 特異性結合由（SEQ ID N0:63)表示的FGFR2的細胞外N末端表位CRPSFSLVEDTTLEPE15)。
[0308] C.權利要求B的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體與所述細胞外N末 端表位（SEQ ID N0:63)的結合是通過至少一個選自殘基Argl、Pro2、Phe4、Ser5、Leu6和 Glu8的表位殘基介導的。
[0309] D.權利要求B-C任一項的分離的抗體或其抗原結合片段，其中通過將FGFR2的N 末端表位Crpsfslvedttlepe15)中的至少一個胺基酸殘基改變為丙氨酸，所述抗體或其抗 原結合片段失去了多於50%的其ELISA信號
[0310] a)所述殘基選自Pro2、Leu6和Glu8,或
[0311] b)所述殘基選自 Argl、Pro2、Phe4 和 Ser5。
[0312] E.權利要求A-D任一項的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段 與至少一個選自如下的抗體競爭性結合FGFR2 :"M048-D01"、"M047-D08"、"M017-B02"、 "M021-H02"、"M054-A05"、"M054-D03"、"TPP-1397"、"TPP-1398"、"TPP-1399"、"TPP-1400"、 "TPP-1401"、"TPP-1402"、"TPP-1403"、"TPP-1406"、"TPP-1407"、"TPP-1408"、"TPP-1409"、 "ΤΡΡ-1410"、"ΤΡΡ-1411"、"ΤΡΡ-1412"和"ΤΡΡ-1415"。
[0313] F.權利要求Ε的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段的胺基酸 序列與"M 048-D01"、"M047-D08"、"M017-B02"、"M021-H02"、"M054-A05"、"M054-D03"、 "TPP-1397"、"TPP-1398"、"TPP-1399"、"TPP-1400"、"TPP-1401"、"TPP-1402"、"TPP-1403"、 "ΤΡΡ-1406"、"ΤΡΡ-1407"、"ΤΡΡ-1408"、"ΤΡΡ-1409"、"ΤΡΡ-1410"、"ΤΡΡ-1411"、"ΤΡΡ-1412" 或"τρρ_1415"的至少一個⑶1?序列至少5〇%、 55%、6〇%、7〇%、8〇%、9〇或 95%相同； 或者與 "M048-D01"、"M047-D08 "、"Μ017-Β02 "、"Μ021-Η02 "、"Μ054-Α05 "、"M054-D03 "、 "ΤΡΡ-1397"、"ΤΡΡ-1398"、"ΤΡΡ-1399"、"ΤΡΡ-1400"、"ΤΡΡ-1401"、"ΤΡΡ-1402"、"ΤΡΡ-1403"、 "ΤΡΡ-1406"、"ΤΡΡ-1407"、"ΤΡΡ-1408"、"ΤΡΡ-1409"、"ΤΡΡ-1410"、"ΤΡΡ-1411"、"ΤΡΡ-1412" 或 "ΤΡΡ-1415" 的 VH 或 VL 序列至少 50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%相同。
[0314] G.權利要求E-F任一項的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包 含表9和表10所示的至少一個⑶R序列或至少一個重鏈可變區或輕鏈可變區序列。
[0315] H.權利要求A-G的抗體或抗原結合片段包含
[0316] a)由SEQ ID N0:5-7表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:8-10表示的可變輕 鏈CDR序列，或
[0317] b)由SEQ ID NO: 15-17表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO: 18-20表示的可 變輕鏈CDR序列，或
[0318] c)由SEQ ID NO:25-27表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO:28-30表示的可 變輕鏈CDR序列，或
[0319] d)由SEQ ID NO:35-37表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO:38-40表示的可 變輕鏈CDR序列，或
[0320] e)由SEQ ID N0:45-47表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:48-50表示的可 變輕鏈CDR序列，或
[0321] f)由SEQ ID NO:55-57表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO:58-60表示的可 變輕鏈CDR序列，或
[0322] g)由SEQ ID NO:75-77表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO :78-80表示的可 變輕鏈CDR序列，或
[0323] h)由SEQ ID N0:85-87表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:88-90表示的可 變輕鏈CDR序列，或
[0324] i)由SEQ IDN0:95-97表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ IDN0:98-100表示的可 變輕鏈CDR序列，或
[0325] j)由SEQ ID N0:105-107表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:108-110表示 的可變輕鏈CDR序列，或
[0326] k)由SEQ ID N0:115-117表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:118-120表示 的可變輕鏈CDR序列，或
[0327] 1)由SEQ ID N0:125-127表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:128-130表示 的可變輕鏈CDR序列，或
[0328] m)由SEQ ID N0:135-137表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:138-140表示 的可變輕鏈CDR序列，或
[0329] η)由SEQ ID N0:145-147表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:148-150表示 的可變輕鏈CDR序列，或
[0330] 〇)由SEQ ID N0:155-157表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:158-160表示 的可變輕鏈CDR序列，或
[0331] p)由SEQ ID N0:165-167表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:168-170表示 的可變輕鏈CDR序列，或
[0332] q)由SEQ ID N0:175-177表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:178-180表示 的可變輕鏈CDR序列，或
[0333] r)由SEQ ID N0:185-187表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:188-190表示 的可變輕鏈CDR序列，或
[0334] s)由SEQ ID N0:195-197表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:198-200表示 的可變輕鏈CDR序列，或
[0335] t)由SEQ ID N0:205-207表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:208-210表示 的可變輕鏈CDR序列，或
[0336] u)由SEQ ID NO: 215-217表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO: 218-220表示 的可變輕鏈CDR序列。
[0337] I.權利要求A-Η的抗體或抗原結合片段包含
[0338] a)由SEQ ID NO: 1表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:2表示的可變輕鏈序列，或
[0339] b)由SEQ ID N0:11表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:12表示的可變輕鏈序列， 或
[0340] c)由SEQ ID N0:21表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:22表示的可變輕鏈序列， 或
[0341] d)由SEQ ID N0:31表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:32表示的可變輕鏈序列， 或
[0342] e)由SEQ ID N0:41表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:42表示的可變輕鏈序列， 或
[0343] f)由SEQ ID N0:51表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:52表示的可變輕鏈序列， 或
[0344] g)由SEQ ID N0:73表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:74表示的可變輕鏈序列， 或
[0345] h)由SEQ ID N0:83表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:84表示的可變輕鏈序列， 或
[0346] i)由SEQ ID N0:93表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:94表示的可變輕鏈序列， 或
[0347] j)由SEQ ID N0:103表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:104表示的可變輕鏈序 列，或
[0348] k)由SEQ ID N0:113表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:114表示的可變輕鏈序 列，或
[0349] 1)由SEQ ID N0:123表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:124表示的可變輕鏈序 列，或
[0350] m)由SEQ ID N0:133表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:134表示的可變輕鏈序 列，或
[0351] η)由SEQ ID N0:143表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:144表示的可變輕鏈序 列，或
[0352] 〇)由SEQ ID N0:153表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:154表示的可變輕鏈序 列，或
[0353] p)由SEQ ID N0:163表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:164表示的可變輕鏈序 列，或
[0354] q)由SEQ ID N0:173表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:174表示的可變輕鏈序 列，或
[0355] r)由SEQ ID N0:183表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:184表示的可變輕鏈序 列，或
[0356] s)由SEQ ID N0:193表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:194表示的可變輕鏈序 列，或
[0357] t)由SEQ ID NO:203表示的可變重鏈序列和由SEQ ID NO:204表示的可變輕鏈序 列，或
[0358] u)由SEQ ID N0:213表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:214表示的可變輕鏈序 列。
[0359] J.前述權利要求任一項的抗體，其為IgG抗體。
[0360] K.前述權利要求任一項的抗原結合片段，其為scFv、Fab、Fab'片段或F(ab'）2片 段。
[0361] L.前述權利要求任一項的抗體或抗原結合片段，其為單克隆抗體或抗原結合片 段。
[0362] M.前述權利要求任一項的抗體或抗原結合片段，其為人、人源化或嵌合抗體或抗 原結合片段。
[0363] N. -種抗體-藥物綴合物，其包含權利要求A-Μ的抗體或其抗原結合片段。
[0364] 0. -種分離的核酸序列，其編碼權利要求A-Μ的抗體或抗原結合片段。
[0365] P. -種載體，其包含權利要求0的核酸序列。
[0366] Q. -種分離的細胞，其表達權利要求A-Μ任一項的抗體或抗原結合片段和/或包 含權利要求〇的核酸或權利要求P的載體。
[0367] R.權利要求Q的分離的細胞，其中所述細胞為原核細胞或真核細胞。
[0368] S. -種產生權利要求A-Μ任一項的抗體或抗原結合片段的方法，所述方法包括培 養權利要求R的細胞和純化所述抗體或抗原結合片段。
[0369] T.權利要求A-Μ的抗體或抗原結合片段或權利要求N的抗體-藥物綴合物作為藥 物。
[0370] U.權利要求A-Μ的抗體或抗原結合片段作為診斷試劑。
[0371] V.權利要求A-Μ的抗體或抗原結合片段或權利要求N的抗體-藥物綴合物作為用 於治療癌症的藥物。
[0372] W. -種藥物組合物，其包含權利要求A-Μ的抗體或抗原結合片段或權利要求N的 抗體-藥物綴合物。
[0373] X.權利要求W的藥物組合物與一種或多種治療活性化合物的結合物。
[0374] Y. -種用於治療與不需要的FGFR2的存在相關的疾病或病症的方法，所述方法包 括給予有所需要的受試者有效量的權利要求W的藥物組合物或權利要求X的結合物。
[0375] 實施例
[0376] 實施例1 :從n-CoDeR文庫產生抗體
[0377] 用於噬菌體選擇的工具：
[0378] 用於分離本發明的人抗體的重組蛋白從R&D Systems獲得，列於表1中。使用 的所有變體在無載體製劑中作為Fc融合蛋白存在。hTRAIL-Fc充當消耗（depletion) 試劑以消除Fc結合劑（binder)。依照製造商說明書使用大約2倍摩爾過量的生物 素-LC-NHS (Pierce ;Cat. No. 21347)對蛋白質進行生物素化，並使用Zeba脫鹽柱（Pierce ; Cat. No. 89889)脫鹽。
[0379] 表1 :用於噬菌體選擇和篩選的重組蛋白的列表
[0380]

【權利要求】
1. 一種分離的抗體或其抗原結合片段，其在結合至過表達FGFR2的細胞系 SNU16(ATCC-CRL-5974)和 MFM223(ECACC-98050130)和表達突變的 FGFR2 的細胞系 八吧-04(05]\^-4〇：267)和]^屯-296伍04〇：-98031101)中的？6?1?2之後，降低？6?1?2的細胞表 面表達。
2. -種分離的抗體或其抗原結合片段，其特異性結合由SEQ ID N0:63表示的FGFR2的 細胞外N末端表位CRPSFSLVEDTTLEPE15)。
3. 權利要求2的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體與所述細胞外N末端表 位（SEQ ID N0:63)的結合是通過至少一個選自Argl、Pro2、Phe4、Ser5、Leu6和Glu8殘基 的表位殘基介導的。
4. 權利要求2-3任一項的分離的抗體或其抗原結合片段，其中通過將FGFR2的N末端 表位CRPSFSLVEDTTLEPE 15)中的至少一個胺基酸殘基改變為丙氨酸，所述抗體或其抗原結 合片段失去了多於50%的其ELISA信號 a) 所述殘基選自Pro2、Leu6和Glu8,或 b) 所述殘基選自Argl、Pro2、Phe4和Ser5。
5. 權利要求1-4任一項的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段與 至少一個選自如下的抗體競爭結合至FGFR2 :"M048-D01"、"M047-D08"、"M017-B02"、 "M021-H02"、"M054-A05"、"M054-D03"、"TPP-1397"、"TPP-1398"、"TPP-1399"、"TPP-1400"、 "TPP-1401"、"TPP-1402"、"TPP-1403"、"TPP-1406"、"TPP-1407"、"TPP-1408"、"TPP-1409"、 "ΤΡΡ-1410"、"ΤΡΡ-1411"、"ΤΡΡ-1412"和"ΤΡΡ-1415"。
6. 權利要求5任一項的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段的氨基 酸序列與 "M048-D0r'、"M047-D08"、"M017-B02"、"M021-H02"、"M054-A05"、"M054-D03"、 "TPP-1397"、"TPP-1398"、"TPP-1399"、"TPP-1400"、"TPP-1401"、"TPP-1402"、"TPP-1403"、 "ΤΡΡ-1406"、"ΤΡΡ-1407"、"ΤΡΡ-1408"、"ΤΡΡ-1409"、"ΤΡΡ-1410"、"ΤΡΡ-1411"、"ΤΡΡ-1412" 或" τρρ_1415"中的至少一個⑶1?序列至少5〇%、 55%、6〇%、7〇%、8〇%、9〇或 95%相同； 或者與 "M048-D01"、"M047-D08"、"MO17-Β02"、"Μ021-Η02"、"Μ054-Α05"、"M054-D03"、 "ΤΡΡ-1397"、"ΤΡΡ-1398"、"ΤΡΡ-1399"、"ΤΡΡ-1400"、"ΤΡΡ-1401"、"ΤΡΡ-1402"、"ΤΡΡ-1403"、 "ΤΡΡ-1406"、"ΤΡΡ-1407"、"ΤΡΡ-1408"、"ΤΡΡ-1409"、"ΤΡΡ-1410"、"ΤΡΡ-1411"、"ΤΡΡ-1412" 或 "ΤΡΡ-1415" 的 VH 或 VL 序列至少 50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%相同。
7. 權利要求5-6任一項的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含表 9和表10所示的至少一個⑶R序列或者至少一個可變重鏈或輕鏈序列。
8. 權利要求1-7任一項的抗體或抗原結合片段，其包含 a. 由SEQ ID NO: 5-7表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO:8-10表示的可變輕鏈CDR 序列，或 b. 由SEQ ID NO: 15-17表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO: 18-20表示的可變輕 鏈CDR序列，或 c. 由SEQ ID NO:25-27表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO:28-30表示的可變輕 鏈CDR序列，或 d. 由SEQ ID NO:35-37表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO:38-40表示的可變輕 鏈CDR序列，或 e. 由SEQ ID NO:45-47表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO:48-50表示的可變輕 鏈CDR序列，或 f. 由SEQ ID NO:55-57表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO:58-60表示的可變輕 鏈CDR序列，或 g. 由SEQ ID NO:75-77表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO:78-80表示的可變輕 鏈CDR序列，或 h. 由SEQ ID NO:85-87表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO:88-90表示的可變輕 鏈CDR序列，或 i. 由SEQ ID NO:95-97表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO:98-100表示的可變輕 鏈CDR序列，或 j. 由SEQ ID NO: 105-107表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO: 108-110表示的可 變輕鏈CDR序列，或 k. 由SEQ ID NO: 115-117表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO: 118-120表示的可 變輕鏈CDR序列，或 l. 由SEQ ID NO: 125-127表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO: 128-130表示的可 變輕鏈CDR序列，或 m. 由SEQ ID NO: 135-137表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO: 138-140表示的可 變輕鏈CDR序列，或 η.由SEQ ID NO: 145-147表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO: 148-150表示的可 變輕鏈CDR序列，或 〇.由SEQ ID NO: 155-157表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO: 158-160表示的可 變輕鏈CDR序列，或 P.由SEQ ID N0:165-167表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:168-170表示的可 變輕鏈CDR序列，或 q. 由SEQ ID N0:175-177表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:178-180表示的可 變輕鏈CDR序列，或 r. 由SEQ ID NO:185-187表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO:188-190表示的可 變輕鏈CDR序列，或 s. 由SEQ ID N0:195-197表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:198-200表示的可 變輕鏈CDR序列，或 t. 由SEQ ID NO:205-207表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO:208-210表示的可 變輕鏈CDR序列，或 u. 由SEQ ID N0:215-217表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID N0:218-220表示的可 變輕鏈CDR序列。
9.權利要求1-8任一項的抗體或抗原結合片段，其包含 a. 由SEQ ID NO: 1表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:2表示的可變輕鏈序列，或 b. 由SEQ ID N0:11表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:12表示的可變輕鏈序列，或 c. 由SEQ ID N0:21表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:22表示的可變輕鏈序列，或 d. 由SEQ ID N0:31表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:32表示的可變輕鏈序列，或 e. 由SEQ ID N0:41表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:42表示的可變輕鏈序列，或 f. 由SEQ ID NO:51表示的可變重鏈序列和由SEQ ID NO:52表示的可變輕鏈序列，或 g. 由SEQ ID NO:73表示的可變重鏈序列和由SEQ ID NO:74表示的可變輕鏈序列，或 h. 由SEQ ID NO:83表示的可變重鏈序列和由SEQ ID NO:84表示的可變輕鏈序列，或 i. 由SEQ ID N0:93表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:94表示的可變輕鏈序列，或 j. 由SEQ ID NO: 103表示的可變重鏈序列和由SEQ ID NO: 104表示的可變輕鏈序列，或 k. 由SEQ ID NO: 113表示的可變重鏈序列和由SEQ ID NO: 114表示的可變輕鏈序列，或 l. 由SEQ ID NO: 123表示的可變重鏈序列和由SEQ ID NO: 124表示的可變輕鏈序列，或 m. 由SEQ ID NO: 133表示的可變重鏈序列和由SEQ ID NO: 134表示的可變輕鏈序列，或 η.由SEQ ID NO: 143表示的可變重鏈序列和由SEQ ID NO: 144表示的可變輕鏈序列，或 〇.由SEQ ID NO: 153表示的可變重鏈序列和由SEQ ID NO: 154表示的可變輕鏈序列，或 p. 由SEQ ID N0:163表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:164表示的可變輕鏈序列，或 q. 由SEQ ID N0:173表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:174表示的可變輕鏈序列，或 r. 由SEQ ID N0:183表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:184表示的可變輕鏈序列，或 s. 由SEQ ID N0:193表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:194表示的可變輕鏈序列，或 t. 由SEQ ID N0:203表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:204表示的可變輕鏈序列，或 u. 由SEQ ID N0:213表示的可變重鏈序列和由SEQ ID N0:214表示的可變輕鏈序列。
10. 前述權利要求任一項的抗體，其為IgG抗體。
11. 前述權利要求任一項的抗原結合片段，其為scFv、Fab、Fab'片段或F(ab'）2片段。
12. 前述權利要求任一項的抗體或抗原結合片段，其為單克隆抗體或抗原結合片段。
13. 前述權利要求任一項的抗體或抗原結合片段，其為人、人源化或嵌合抗體或抗原結 合片段。
14. 一種抗體-藥物綴合物，其包含權利要求1-13任一項的抗體或其抗原結合片段。
15. -種分離的核酸序列，其編碼權利要求1-13任一項的抗體或抗原結合片段。
16. -種載體，其包含權利要求15的核酸序列。
17. -種分離的細胞，其表達權利要求1-13任一項的抗體或抗原結合片段和/或包含 權利要求15的核酸或權利要求16的載體。
18. 權利要求17的分離的細胞，其中所述細胞為原核細胞或真核細胞。
19. 一種產生權利要求1-13任一項的抗體或抗原結合片段的方法，所述方法包括培養 權利要求18的細胞和純化所述抗體或抗原結合片段。
20. 權利要求1-13任一項的抗體或抗原結合片段或權利要求14的抗體-藥物綴合物 作為藥物。
21. 權利要求1-13任一項的抗體或抗原結合片段作為診斷試劑。
22. 權利要求1-13任一項的抗體或抗原結合片段或權利要求14的抗體-藥物綴合物 作為用於治療癌症的藥物。
23. -種藥物組合物，其包含權利要求1-13任一項的抗體或抗原結合片段或權利要求 14的抗體-藥物綴合物。
24. 權利要求23的藥物組合物與一種或多種治療活性化合物的結合物。
25. -種用於治療與不希望存在的FGFR2相關的疾病或病症的方法，所述方法包括給 予有需要的受試者有效量的權利要求23的藥物組合物或權利要求24的結合物。
【文檔編號】C07K16/28GK104066750SQ201280067865
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2012年11月22日 優先權日:2011年11月23日
【發明者】A·哈倫加, C·C·考皮茲, S·哈默爾, F·迪特默, S·高菲爾, M·特蘭特溫, S·布魯德, J·弗朗茨, B·斯特爾特-路德維格, L·林登, R·芬納恩, S·格利文, J·泰比 申請人:拜耳智慧財產權有限責任公司