無血清植物蛋白肽通用細胞培養基的製作方法

2023-10-05 00:18:09

專利名稱：:無血清植物蛋白肽通用細胞培養基的製作方法無血清植物蛋白肽通用細胞培養基
技術領域：
：本發明涉及無血清或低血清通用細胞培養基。技術背景細胞是病毒、蛋白的表達載體，細胞質量直接影響表達量，只有好的培養基才能篩選、馴化出優質細胞。普通的細胞培養基中含有小牛血清，由於血清都是批量生產，各批間差異很大、質量不穩定，而且血清中含有一些對細胞產生毒性的物質，會影響細胞的生長，甚至造成細胞死亡，同時也更加了工業化生產中分離純化的難度；而且特別不適合生長因子對細胞作用的研究、細胞分泌物功能的研究及大量細胞分泌物的製備。無血清培養基是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養基。雖然目前已有無血清培養基問世，但是在原代培養或者細胞生長狀況不良時還是只能先用有血清的培養液進行培養，待細胞生長旺盛以後才能再換成現有無血清培養液；而且多數細胞轉入現有的無血清培養基培養要有一個適應過程，一般要逐步降低血清濃度，直至無血清培養。由於目前的無血清培養基包含非常少的蛋白質，所以更易於受外界因素的影響，並缺乏血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子，容易導致所培養細胞的致死性損害。
發明內容本發明的目的是為了解決現有無血清培養基不能直接培養生長狀況不良的細胞，多數細胞要逐步降低血清濃度才能適應現有的無血清培養基及易受外界因素影響、容易造成致死性損害的問題，而提供的一種無血清植物蛋白肽通用細胞培養基。本發明1000mL無血清植物蛋白肽通用細胞培養基由200mg氯化牽丐、400mg氯化鉀、97.67mg無水硫酸鎂、6800mg氯化鈉、121.74mg無水磷酸二氫鈉、292mgL-穀氨醯胺、lOOOmgD-葡萄糖、10mg酚紅、lmgD-泛酸鈣、lmg氯化膽鹼、lmg葉酸、2mgi-肌醇、lmg煙醯胺、lmg鹽酸吡哆醛、O.lmg核黃素、lmg鹽酸硫胺、5000mg大豆蛋白肽和餘量的蒸餾水製成。本發明無血清植物蛋白肽通用細胞培養基中所使用的大豆蛋白肽按中國專利"大豆蛋白活性肽的製作方法"(專利號ZL00110471.3，公開號CN1273783A)的方法製備。本發明無血清植物蛋白肽通用細胞培養基中所使用的大豆蛋白肽由微生物發酵法製備；因活性微生物菌體直接參與生化代謝，所以可以將大分子的大豆蛋白分解為更具有活性的小分子肽，在配置培養基的過程中大豆小分子肽在水溶液中會形成具有生物活性的大分子大豆蛋白肽，可以代替血清中的動物源性蛋白和因子。現有無血清培養基中添加的蛋白多是酶解蛋白，由於酶只能機械的切割肽鍵導致目前的無血清培養基蛋白類營養物質種類少、不均衡，難以使生長狀況不良細胞的存活。本發明中的植物大豆蛋白肽經活性微生物菌體的生化代謝，所以蛋白種類多、營養均衡；而且在本發明通用培養基大豆蛋白肽中還含有微生物的初級代謝產物和次級代謝產物，可為所培養的細胞提供各種所需的生長因子，由於採用的是植物蛋白和微生物發酵手段，所以可以有效的避免動物源性對所培養動物或人細胞的幹擾。細胞可直接在本發明無血清植物蛋白肽通用細胞培養基上培養而不必逐步馴化和培養，節省了培養周期和其它因素的幹擾；並且使用本發明無血清植物蛋白肽通用細胞培養基細胞成活率高達94%以上。採用本發明無血清植物蛋白肽通用細胞培養基簡化了後期的分離純化工藝，使雜質含量降低，提高產品純度，降低生產成本。圖1是具體實施方式二中無血清植物蛋白肽通用細胞培養基中培養的HaLe細胞形態圖片，圖2是具體實施方式二中普通MEM細胞培養基中培養的HaLe細胞形態圖片。具體實施方式具體實施方式一本實施方式1000mL無血清植物蛋白肽通用細胞培養基由200mg氯化鈣、400mg氯化鉀、97.67mg無水硫酸鎂、6800mg氯化鈉、121.74mg無水磷酸二氫鈉、292mgL-穀氨醯胺、1000mgD-葡萄糖、10mg酚紅、lmgD-泛酸鈣、lmg氯化膽鹼、lmg葉酸、2mgi-肌醇、lmg煙醯胺、lmg鹽酸吡哆醛、O.lmg核黃素、lmg鹽酸硫胺、5000mg大豆蛋白肽和餘量的蒸餾水製成。按中國專利"大豆蛋白活性肽的製作方法"(專利號ZL00110471.3，公開號CN1273783A)製備出的大豆蛋白活性肽的色澤微乳白色或淡黃色、具有滋氣味、粉狀無結塊；在原專利中大豆蛋白活性肽僅被用於食品加工。此大豆蛋白活性肽製備方法工藝穩定、產品質量波動小、質量高。經檢測大豆中富含18種胺基酸、其中8種主要胺基酸平衡，本實施方式培養基中使用的大豆蛋白肽可完全替代血清培養基中的胺基酸組分，同時微生物發酵而產生的肽類物質為細胞提供了更為重組和全面的營養，也減輕了後期分離純化的工作壓力。本實施方式可用於培養CHO細胞、NSO細胞、Sp2/0細胞、雜交瘤細胞、HEK293細胞、MDCK細胞、HeLa細胞、MDBK細胞等細胞。對於培養基中必須添加血清培養的特殊細胞(如Marcl45細胞、BHK21細胞、VERO細胞、骨髓間充質幹細胞等)，在本發明無血清植物蛋白肽通用細胞培養基中添加低量血清(<3%質量)後即可實現成功培養(現有血清培養基中血清加入量為質量的8%10%)。本實施方式無血清植物蛋白肽通用細胞培養基可增加所培養細胞的密度及收穫次數，提高表達量，從而提高醫藥領域的疫苗產量；並解決因取消或降低小牛血清的使用而造成的細胞過早死亡，形態不飽和問題。本實施方式因為採用大豆蛋白，其成本遠遠低於使用牛血清的培養基，並同時解決了現有無血清培養基培養細胞過早死亡、形態不飽和的問題。而且使用本實施方式無血清植物蛋白肽通用細胞培養基培養的細胞不易發生老化脫落現象，細胞增殖迅速、代謝旺盛。具體實施方式二本實施方式用無血清植物蛋白肽通用細胞培養基HaLe細胞(非洲女性宮頸癌細胞)。本實施方式HaLe細胞由八一農墾大學動物科技學院實驗室液氮保存。分別使用具體實施方式一本實施方式無血清植物蛋白肽通用細胞培養基和普通MEM細胞培養基(產品代碼MD600，批號070512)在37"C的條件下直接培養復甦後的HaLe細胞，並用顯微鏡觀察各組細胞形態及生長增殖情況。表ltableseeoriginaldocumentpage6無血清植物蛋白肽通用細胞培養基中培養的細胞分裂百分率明顯優於普通MEM細胞培養基，並且無血清植物蛋白肽通用細胞培養基中細胞長成單層的時間與傳統培養基相同，而且細胞形態基本一致(HaLe細胞在不同培養基中的形態分別如圖1和圖2所示)。無血清植物蛋白肽通用細胞培養基的營養成分優於普通血清培養基，無血清植物蛋白肽通用細胞培養基中細胞增殖迅速，代謝旺盛，細胞分裂百分率(24h)明顯高於普通血清培養基。說明具體實施方式一無血清植物蛋白肽通用細胞培養基在細胞培養中可行。權利要求1、無血清植物蛋白肽通用細胞培養基，其特徵在於1000mL無血清植物蛋白肽通用細胞培養基由200mg氯化鈣、400mg氯化鉀、97.67mg無水硫酸鎂、6800mg氯化鈉、121.74mg無水磷酸二氫鈉、292mgL-穀氨醯胺、1000mgD-葡萄糖、10mg酚紅、1mgD-泛酸鈣、1mg氯化膽鹼、1mg葉酸、2mgi-肌醇、1mg煙醯胺、1mg鹽酸吡哆醛、0.1mg核黃素、1mg鹽酸硫胺、5000mg大豆蛋白肽和餘量的蒸餾水製成。專利摘要無血清植物蛋白肽通用細胞培養基，它涉及無血清或低血清通用細胞培養基。它解決了現有無血清培養基不能直接培養生長狀況不良的細胞，多數細胞要逐步降低血清濃度才能適應現有的無血清培養基及易受外界因素影響、容易造成致死性損害的問題。無血清植物蛋白肽通用細胞培養基由氯化鈣、氯化鉀、無水硫酸鎂、氯化鈉、無水磷酸二氫鈉、L-穀氨醯胺、D-葡萄糖、酚紅、D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、i-肌醇、煙醯胺、鹽酸吡哆醛、核黃素、鹽酸硫胺、大豆蛋白肽和蒸餾水製成。細胞可直接在本發明培養基上培養而不必逐步馴化和培養，節省了培養周期和其它因素的幹擾；減少血清帶來的病毒汙染；並且細胞成活率高達94％以上。文檔編號C12N5/12GKCN101245335SQ200810064156公開日2008年8月20日申請日期2008年3月21日發明者雷王,王東典,王淑傑申請人:樂能生物工程股份有限公司導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan