檢測唾液中人幽門螺旋桿菌的螢光免疫層析試紙及其製備方法與流程
2023-10-19 04:48:12 1
本發明涉及一種唾液中人幽門螺旋桿菌的方法，具體涉及採用螢光免疫層析試紙檢測唾液中人幽門螺旋桿菌的方法及該試紙的製備方法。
背景技術：
：免疫層析技術是上世紀八十年代發展起來的一種快速免疫分析技術。免疫層析技術的基本原理是，被檢測的樣品通過毛細作用，在條狀纖維(如硝酸纖維素膜、玻璃纖維等)製成的膜上移動，其中的待測物與膜上一定區域的配體(一般為抗原、抗體、核酸等物質)結合，然後通過酶促顯色反應或直接使用著色標記物，短時間內便可得到直觀的結果。以原理來劃分，免疫層析可以分為兩類，一種是以酶促反應顯色為基礎，根據顯色亮度來定量；另外一種是通過著色標記物(如量子點、膠體金等)標記，纖維膜上的顯色深淺表徵了其上所偶聯的配體含量。抗原和對應抗體在一定條件下特異結合形成可逆性的抗原-抗體複合物的過程被稱為抗原-抗體生物學反應，亦稱免疫反應。抗體都是蛋白質，抗原多數也是蛋白質，也有一些抗原是多糖、類脂和核酸等物質。抗原和抗體反應具有高度的特異性，該反應是分子表面的結合，反應產物相當比較穩定，但因抗體和抗原本身並未受到破壞，它們依舊可以分離。抗原抗體反應主要可以分為兩個階段。首先是抗原和抗體的特異性結合階段，該階段使親水系統變更為疏水系統，反應一般較快，一般耗時數秒鐘到數分鐘，無可見反應。第二階段為免疫反應的可見階段，一般會出現沉澱和凝集等宏觀現象，該反應時間一般為幾分鐘到幾十分鐘，易受電解質、溫度和酸鹼度等外界因素的影響。螢光免疫層析技術是將免疫螢光技術和傳統免疫層析技術相結合的一種新型檢測技術。該技術在保留免疫層析技術的操作簡便、檢測快速和便攜性強的優點外，還可以實現檢測結果的定量化。因為檢測方便、精確度較高，螢光免疫層析技術即時檢驗(POCT)
技術領域：
的發展趨勢。螢光免疫技術是指將不影響抗體抗原活性的螢光材料標記在抗原或者抗體上，製成螢光探針，在與其相對應的抗體或者抗原反應後，形成含有標記螢光染料抗原抗體複合物，然後利用外界光誘導，測定複合物中的螢光強度，進而推算出被測物質的濃度。量子點又稱為螢光半導體納米顆粒，量子點受激發光照射後可以發射螢光，且可以與生物大分子結合，具有極強的生物相容性。與傳統的螢光染料相比，量子點有可調諧的發射波長，可以通過調整其粒徑來獲得具備不同發射光譜的量子點。同時，量子點具有較大的斯託克斯位移和對稱型的螢光光譜，可以有效減弱激發光對發射光的影響，進而降低系統複雜度。幽門螺旋桿菌感染與慢性萎縮性胃炎、十二指腸潰瘍、胃腺癌和胃黏膜相關性淋巴組織淋巴瘤的發生有關，世界衛生組織已經將其定為胃癌的一類致癌原。目前診斷幽門螺旋桿菌感染的方法很多，分為侵入性及非侵入性兩大類。我們結合量子點的優良螢光性質和抗原抗體反應的特異性，應用雙抗體夾心量子點免疫層析法檢測唾液中人幽門螺旋桿菌的方法及該試紙的製備方法，旨在尋求敏感度及特異度高、快速簡便的唾液中人幽門螺旋桿菌檢測方法，進而促進幽門螺旋桿菌感染的早期診斷及治療。技術實現要素：我們提供了一種檢測唾液中人幽門螺旋桿菌的螢光免疫層析試紙及其製備方法，步驟如下：一種檢測唾液中人幽門螺旋桿菌的螢光免疫層析試紙，其製備方法包括如下步驟：(1)製備量子點；(2)製備人幽門螺旋桿菌cagA抗體量子點偶聯標記物；(3)組裝螢光免疫層析試紙。進一步的，一種檢測唾液中人幽門螺旋桿菌的螢光免疫層析試紙，其製備方法包括如下步驟：(1)在劇烈攪拌下，將甲基鎘[(CH3)2Cd]和TOPSe(三辛基磷硒)迅速注射到300-400℃的三辛基氧膦(TOPO)中；然後迅速降溫至200-280℃，而後緩慢升溫到380-320℃；加入過量甲醇，通過離心分離得到CdSe納米顆粒；以硬脂酸鋅，六甲基二矽硫烷[(TMS)2S]Zn作為前體，加入CdSe納米顆粒，在TOPO中合成CdSe/ZnS量子點；(2)將聚(叔丁基丙烯酸酯-乙基丙烯酸酯-甲基丙烯酸)三嵌段共聚物與辛胺混合溶解在二甲亞碸中，加入碳化二亞胺反應後純化，得到高分子溶液；將製備得到的CdSe/ZnS量子點和高分子溶液共同充分溶解在氯仿中，在超聲過程中加入到乳化劑LipoidE-80和蒸餾水中，並繼續超聲，然後再室溫下對獲得的乳液進行磁力攪拌，直到氯仿完全揮發，即得到水溶性量子點；(3)將適量PBS緩衝液和水溶性量子點加入反應器中攪拌均勻後，加入人幽門螺旋桿菌cagA抗體，繼續攪拌至混合均勻；加入碳二亞胺(EDC)溶液，室溫反應2-4h，然後在35-40℃條件下，180r/min振動反應2-5h，後置於4℃冰箱中過夜，用20000r/min超速離心，去上清液，將沉澱用BSA溶液重懸，得到人幽門螺旋桿菌量子點螢光偶聯物；(4)免疫層析試紙由樣品墊、結合墊、層析膜、吸水紙和底板構成；樣品墊和結合墊採用BSA溶液浸泡後洗滌乾燥；將人幽門螺旋桿菌量子點螢光偶聯物加入結合墊中，乾燥；層析膜檢測帶和質控帶為羊抗鼠IgG劃線；將樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙依次粘貼於底板上，切成4mm的試紙條，置於4℃冰箱中儲存，即得。進一步的，一種檢測唾液中人幽門螺旋桿菌的螢光免疫層析試紙，其製備方法包括如下步驟：(1)將10mg甲基鎘[(CH3)2Cd]和10mgTOPSe(三辛基磷硒)迅速注射到劇烈攪拌的350℃的三辛基氧膦(TOPO)中；然後迅速降溫至250℃，而後緩慢升溫到280℃；加入過量甲醇，通過離心分離得到CdSe納米顆粒；在TOPO中加入8mg硬脂酸鋅，12mg六甲基二矽硫烷[(TMS)2S]Zn和CdSe納米顆粒，加入微波爐高溫加熱，待溶液自然冷卻後，用中速濾紙過濾去除不溶性黑色沉澱，離心除去大顆粒，收集上清液注入透析袋內進行透析；將透析後的產物進行真空旋轉蒸發至固體狀，獲得CdSe/ZnS量子點；(2)將10mL聚(叔丁基丙烯酸酯-乙基丙烯酸酯-甲基丙烯酸)三嵌段共聚物與10mL辛胺混合溶解在二甲亞碸中，加入碳化二亞胺反應6h後純化，得到高分子溶液；將製備得到的CdSe/ZnS量子點和高分子溶液共同充分溶解在氯仿中，在超聲過程中加入到乳化劑LipoidE-80和蒸餾水中，並繼續超聲，然後再室溫下對獲得的乳液進行磁力攪拌，直到氯仿完全揮發，即得到水溶性量子點；(3)將5mLPBS緩衝液和10μg水溶性量子點加入反應器中，攪拌，加入10μL人幽門螺旋桿菌cagA抗體，繼續攪拌至混合均勻；緩慢攪拌5min後，加入1.2mL碳二亞胺(EDC)溶液，繼續室溫反應2h，反應結束後，在37℃條件下，150r/min振動反應2h，後置於冰箱中4℃過夜，用40000r/min超速離心，去上清液，將沉澱用BSA溶液重懸，相同條件下離心兩次，重懸得到人幽門螺旋桿菌量子點螢光偶聯物；(4)免疫層析試紙由樣品墊、結合墊、層析膜、吸水紙和底板構成；樣品墊和結合墊採用BSA溶液浸泡後洗滌乾燥，以減少實際檢測時的蛋白吸附；將人幽門螺旋桿菌量子點螢光偶聯物加入結合墊中，乾燥；層析膜檢測帶和質控帶為羊抗鼠IgG劃線。將樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙依次粘貼於底板上，切成4mm的試紙條，置於4℃冰箱中儲存，即得檢測唾液中人幽門螺旋桿菌的螢光免疫層析試紙。相比於現有技術，本發明優勢在於：1、選擇了採用乳化法將疏水化改性後的高分子材料直接包裹脂溶性量子點，這樣的改造不僅保持了原量子點的特性，還能夠在保證產品穩定性的同時提供了良好的水溶性，保證與蛋白分子的偶聯。並且螢光量子產率大幅提高，因而增強了量子點的發光強度，提高了檢測靈敏度。2、採用氨基和羧基共價結合的標記技術，利用交聯劑使得活化量子點上的羧基活化進而得以與蛋白質上的氨基進行縮合反應。相比另外一種常用的偶聯方法「靜電吸附」耗時更短。3、應用雙抗體夾心量子點免疫層析法檢測唾液中人幽門螺旋桿菌抗原，其原理是，首先將適量的待測液被滴加在樣品墊上，然後待測液在滲透和虹吸的作用下，遷移到結合墊上，液體迅速浸透結合墊。結合墊上固定有量子點抗體的複合物，即人幽門螺旋桿菌量子點螢光偶聯物，其被待測液迅速溶解，將隨著待測液一起，沿著硝化纖維膜向前運動。在這個過程中，如果待測液中存在幽門螺旋桿菌cagA抗原，就會與被溶解的幽門螺旋桿菌量子點螢光偶聯物發生特異性免疫反應，它們形成的複合物以及過量未與抗原發生反應的量子點偶聯物繼續在硝化纖維膜毛細管力的作用下沿著膜向前運動。當運動到試紙條帶上的檢測線時，檢測線上的人幽門螺旋桿菌抗體會將標記量子點的人幽門螺旋桿菌捕獲，形成檢測帶，未標記人幽門螺旋桿菌的量子點抗體偶聯物繼續移動至質控線被IgG捕獲形成質控線。具體實施方式實施例1一種檢測唾液中人幽門螺旋桿菌的螢光免疫層析試紙，其製備方法為：(1)將10mg甲基鎘[(CH3)2Cd]和10mgTOPSe(三辛基磷硒)迅速注射到劇烈攪拌的350℃的三辛基氧膦(TOPO)中；然後迅速降溫至250℃，而後緩慢升溫到280℃；加入過量甲醇，通過離心分離得到CdSe納米顆粒；在TOPO中加入8mg硬脂酸鋅，12mg六甲基二矽硫烷[(TMS)2S]Zn和CdSe納米顆粒，加入微波爐高溫加熱，待溶液自然冷卻後，用中速濾紙過濾去除不溶性黑色沉澱，離心除去大顆粒，收集上清液注入透析袋內進行透析；將透析後的產物進行真空旋轉蒸發至固體狀，獲得CdSe/ZnS量子點；(2)將10mL聚(叔丁基丙烯酸酯-乙基丙烯酸酯-甲基丙烯酸)三嵌段共聚物與10mL辛胺混合溶解在二甲亞碸中，加入碳化二亞胺反應6h後純化，得到高分子溶液；將製備得到的CdSe/ZnS量子點和高分子溶液共同充分溶解在氯仿中，在超聲過程中加入到乳化劑LipoidE-80和蒸餾水中，並繼續超聲，然後再室溫下對獲得的乳液進行磁力攪拌，直到氯仿完全揮發，即得到水溶性量子點；(3)將5mLPBS緩衝液和10μg水溶性量子點加入反應器中，攪拌，加入10μL人幽門螺旋桿菌cagA抗體，繼續攪拌至混合均勻；緩慢攪拌5min後，加入1.2mL碳二亞胺(EDC)溶液，繼續室溫反應2h，反應結束後，在37℃條件下，150r/min振動反應2h，後置於冰箱中4℃過夜，用40000r/min超速離心，去上清液，將沉澱用BSA溶液重懸，相同條件下離心兩次，重懸得到人幽門螺旋桿菌量子點螢光偶聯物；(4)免疫層析試紙由樣品墊、結合墊、層析膜、吸水紙和底板構成；樣品墊和結合墊採用BSA溶液浸泡後洗滌乾燥，以減少實際檢測時的蛋白吸附；將人幽門螺旋桿菌量子點螢光偶聯物加入結合墊中，乾燥；層析膜檢測帶和質控帶為羊抗鼠IgG劃線。將樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙依次粘貼於底板上，切成4mm的試紙條，置於4℃冰箱中儲存，即得檢測唾液中人幽門螺旋桿菌的螢光免疫層析試紙。實施例2量子點偶聯測定採用酶聯免疫分析法測定：在固化有幽門螺旋桿菌抗原的微孔板利用偶聯混合物與該抗原反應，如果量子點與抗體有效偶聯，則經過偶聯的抗體就會與固化在微孔板上的經過量子點標記的抗原反應，在洗板後未與微孔板上抗原反應的量子點抗體偶聯物就會被洗脫。將實施例1步驟(3)製備的人幽門螺旋桿菌量子點螢光偶聯物經過上述步驟，在酶標儀下觀察，結果觀測到了螢光現象。因此，表明本發明製備的量子點和抗體之間是發生了有效偶聯的。實施例3靈敏度評價將唾液中人幽門螺旋桿菌樣品進行按照10倍梯度稀釋，通過傾注平板法測得其濃度分別約為1*10-1，1*10，1*102CFU/mL。分別取100μL不同濃度的菌懸液用本發明製備的量子點螢光免疫層析試紙條檢測，結果如表1顯示。表1量子點螢光免疫層析試紙適用性測試樣品濃度CFU/mL本發明試紙膠體金試紙1*10-1+-1*10++1*102++可見，本發明製備的量子點螢光免疫層析試紙靈敏度高於市售的膠體金試紙。本發明製備得到的試紙具有檢測人幽門螺旋桿菌高特異性，高靈敏度，快速，方便的特點。當前第1頁1 2 3