一種芽孢桿菌fh3菌株及其篩選方法和應用的製作方法

2023-10-19 18:07:52

一種芽孢桿菌fh3菌株及其篩選方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於微生物【技術領域】，特別涉及一種芽孢桿菌FH3菌株及其篩選方法和應用，所述芽孢桿菌FH3菌株的保藏號為CGMCC?NO.8269，該菌株酶解滸苔的應用方法為，將凍存的FH3菌株於LB斜面培養基中活化培養，然後挑取一滿環於LB液體培養基中，振蕩培養24-28h後取1-2mL菌液於已滅菌纖維素液體發酵培養基中，振蕩培養5-7天；再將發酵液低溫離心，取上清液為粗酶液或是將發酵液過濾，取濾液為粗酶液。將粗酶液與乾淨的滸苔粉於45-55℃條件下反應。所述芽孢桿菌FH3菌株具有產纖維素酶的能力，能有效地將滸苔中的纖維素類物質降解為還原糖，而且生產成本低，設備簡單，反應溫和，適合大規模工業生產。
【專利說明】一種芽孢桿菌FH3菌株及其篩選方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物【技術領域】，特別涉及一種芽孢桿菌--3菌株及其篩選方法和應用。
【背景技術】
[0002]目前，世界石油資源供應漸趨緊張、環境汙染日益嚴重，能源問題也越來越受到人們的關注。近兩年來，各大能源消費國競先尋求替代石油的新能源，生物乙醇燃料以其突出的環保性和可再生性，受到許多國家的重視和積極扶持。生物乙醇作為可再生資源，可減少對石油的消耗，能直接作為液體燃料或者同汽油混合使用。
[0003]2007年開始，我國黃海海域連續7年爆發大規模滸苔，滸苔糖類成分分析結果顯示，其纖維素含量為13.3%、半纖維素含量為28.01%、澱粉含量為2.475%、水溶性多糖含量為11.503%、水溶性戊聚糖含量11.25%。纖維素是由葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成的線狀大分子物質，是地球上最豐富的多糖物質。1904年，在蝸牛消化液中人們首次發現了纖維素酶，從此，對於纖維素酶的研究日益深入。纖維素酶並不是單一酶，是一個酶系的總稱。滸苔中的纖維素是用於製取生物乙醇的主要成分，在對滸苔中的纖維素降解時，一般採用商品纖維素酶，但是，商品纖維素酶成本較高，纖維素酶解過程對環境造成汙染，不適合大規模工業生產。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種芽孢桿菌--3菌株，該菌株可分泌纖維素酶，對滸苔中的纖維素類物質有降解效果`，可將纖維素有效降解為還原糖，為滸苔進一步能源化利用奠定了基礎。
[0005]本發明的另一目的是提供一種芽孢桿菌--3菌株的篩選方法。
[0006]本發明的另一目的是提供一種芽孢桿菌FH3菌株酶解滸苔的應用方法。
[0007]為了實現以上技術效果，本發明通過如下技術方案來實現:
[0008]一種芽孢桿菌--3菌株，其特徵在於:保藏號為CGMCC N0.8269
[0009]上述芽孢桿菌Π13菌株的篩選方法，其步驟包括:
[0010](I)將腐爛的滸苔藻體的懸液加入到選擇培養基中，搖床培養2-3天；
[0011](2)將步驟(1)中的選擇培養液經梯度稀釋後的菌懸液，塗布在鑑別培養基上，待菌落長出；
[0012](3)在長出菌落的平板上用剛果紅染色法篩選有透明圈的菌株，並用平板劃線分離法分離、提純。
[0013]所述步驟(1)中，腐爛的滸苔藻體的懸液與選擇培養基的體積比為1:25-45 ;搖床培養的溫度為25-35°C，轉速為135-145r/min。
[0014]所述步驟(1)中，選擇培養基中的組分包括纖維素粉、硝酸鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、酵母膏、水解酪素及陳海水，各組分的加入配比依次為3-5g:lg:0.3-0.5g:1.1-1.3g:0.8~lg:0.4-0.5g:0.4-0.5g:0.4-0.5g:950_1050mL。
[0015]所述步驟(2)中，鑑別培養基中的組分包括羧甲基纖維素鈉、酵母膏、磷酸二氫鉀、瓊脂、土豆汁及陳海水，各組分的加入配比依次為5-10g:lg:0.1-0.3g:12-16g:90-1 IOmL:950_1050mL。
[0016]上述芽孢桿菌--3菌株酶解滸苔的應用方法:
[0017](a)將芽孢桿菌Π13菌株於LB液體培養基中振蕩培養22_26小時，然後在菌液中加入凍存緩衝液，於-20—25°C保存；
[0018](b)將步驟(a)中的芽孢桿菌FH3菌株於LB斜面培養基中斜面活化培養，然後挑取一滿環於LB液體培養基中，振蕩培養24-28h後取l-2mL菌液於已滅菌纖維素液體發酵培養基中，振蕩培養5-7天；將發酵液低溫離心，取上清液為粗酶液或是將發酵液過濾，取濾液為粗酶液；
[0019](c)將乾淨的滸苔乾燥、粉碎，然後與步驟(b)中的粗酶液於45_55°C條件下反應45-50小時。
[0020]所述步驟(a)中，振蕩培養的溫度為25-35°C，轉速為135_145r/min ;所述緩衝液是體積濃度為45-55%的甘油，緩衝液與LB培養基的體積比為1: 1-1.5。
[0021]所述步驟(b)中，振蕩培養的溫度為30-35°C，轉速為135-145r/min ;離心分離溫度為3-5°C，離心轉速為3500-4500r/min，離心時間為10-20分鐘。
[0022]所述步驟(b)中，纖維素液體發酵培養基中的組分包括酵母浸膏、蛋白腖、羧甲基纖維素鈉及陳海水，各組分的加入配比依次為Ig:3-6g:8-12g:950-1050mL。
[0023]所述步驟(c)中，將乾淨的滸苔於55_`65°C下乾燥10-14小時，然後粉碎至70-90目；滸苔與粗酶液的加入量比為lg:45-55mL。
[0024]本發明的陳海水由上海金山區城市沙灘海域採集備用。
[0025]本發明篩選得到的菌株屬於芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，該菌株保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8269，保藏日期為2013年9月23日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，其16S rDNA序列，如下SEQ ID N0.1所示:
[0026]本發明的有益效果是:1、本發明提供的芽孢桿菌FH3菌株可分泌纖維素酶，而且在應用時，直接將該菌株的液體發酵體系與滸苔纖維素作用，能有效地將滸苔中的纖維素降解為還原糖，為更進一步地製備生物乙醇做好準備。2、本發明以綠潮藻滸苔為原料，變廢為寶，而且生產成本低，設備簡單，反應溫和，操作簡便，適合大規模工業生產。
【具體實施方式】
[0027]下面結合實施例，對本發明作進一步說明:
[0028]陳海水:是指由上海金山區城市沙灘海域大量採集備用的海水。
[0029]實施例1
[0030]芽孢桿菌--3菌株的篩選
[0031](I)分別採自自然條件生長及綠潮海域密集漂浮的腐爛滸苔藻體，採集地為山東青島第一海水浴場和第六海水浴場。採集後用保溫箱低溫運輸帶回實驗室進行細菌篩選。
[0032]將採集到的腐爛滸苔藻體懸液lmL，加入裝有30mL選擇培養基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，30°C，140r/min震蕩培養2~3天，直至培養液變渾濁。
[0033]其中選擇培養基為:纖維素粉5g，
[0034]硝酸鈉Ig,
[0035]氯化鉀0.5g，
[0036]磷酸氫二鈉1.2g,
[0037]磷酸二氫鉀0.9g,
[0038]硫酸鎂0.5g，
[0039]酵母膏0.5g，
[0040]水解酪素0.5g, [0041]陳海水1000mL。
[0042](2)將選擇培養後的培養基進行梯度稀釋:10' 10_2，10_3，10_4，10_5，10_6，將稀釋度為10_5、10_6的菌懸液各取0.2mL塗布在鑑別培養基上，48h後觀察菌落。
[0043]其中鑑別培養基為:羧甲基纖維素鈉5-10g，
[0044]酵母膏lg，
[0045]磷酸二氫鉀0.25g,
[0046]土豆汁 IOOmL,
[0047]瓊脂15g，
[0048]陳海水1000mL。
[0049](3)在長出菌落後的鑑別培養基平板上滴加1%的剛果紅溶液染色，15min後倒去多餘剛果紅溶液，然後加入lmol/L的氯化鈉溶液，蕩去表面剛果紅，15min後倒去溶液，觀察透明圈，測量透明圈的直徑，將透明圈較大的菌株進行平板劃線分離得到純菌株。
[0050]實施例2
[0051]粗酶液的製取。
[0052](I)將實施例1中得到的芽孢桿菌--3於LB液體培養基中，28 V，140r/min培養24h，然後在菌液中添加凍存緩衝液。緩衝液的體積濃度為50%的甘油，緩衝液與菌液的加入體積比為1:1，加入凍存緩衝液，為了更好地保護芽孢桿菌FH3菌株，使得該菌株不會因為脫水而死亡。
[0053](2)將上述中的芽孢桿菌--3菌株於LB培養基中斜面活化培養，活化2代後挑取一滿環於LB液體培養基中，28°C, 140r/min培養24h後取ImL於50mL滅菌冷卻的纖維素液體發酵培養基中，350C、140r/min振蕩培養6天。
[0054]其中液體發酵培養基為:
[0055]酵母浸膏lg，
[0056]蛋白腖5g，
[0057]羧甲基纖維素鈉10g，
[0058]陳海水1000ml。
[0059](3)將步驟(2)中得到的液體發酵培養液於4°C，4000r/min離心15分鐘，取上清液作為粗酶液。
[0060]粗酶液的活性測定:
[0061]濾紙酶活(FPA)測定:將新華I號濾紙剪成I X 6cm大小捲成小卷,放進25mL比色管內，加入ImL檸檬酸緩衝液(pH=4.8)，再加入ImL本實施例中製得的粗酶液，搖勻使濾紙完全浸泡在溶液中，50°C準確保溫Ih後立即按DNS法測還原糖，測得酶活力為22.55U/mL。
[0062]CMC酶活測定:移取ImL本實施例中所得的粗酶液於25mL比色管中，加入ImL含
0.5% CMC-Na的檸檬酸緩衝液(pH=4.4)，50°C準確保溫30min後立即按DNS法測還原糖，測得酶活力為49.57U/mL。
[0063]實施例3
[0064]粗酶液的製取。
[0065]步驟(1)和步驟(2 )同實施例2。
[0066](3)將步驟(2)中得到的液體發酵培養液過濾，取其過濾溶液作為粗酶液。
[0067]粗酶液的活性檢測:
[0068]濾紙酶活(FPA)測定:測定方法同實施例2，測得酶活力為27.83U/mL。
[0069]CMC酶活測定:測定方法同實施例2，測得酶活力為56.98U/mL。
[0070]實施例4
[0071 ] 粗酶液對滸苔的酶解應用。
[0072](I)以黃海海域大量暴發的綠潮藻滸苔為原料，清洗除去貝殼、沙石等雜物後，清水漂洗海藻3-4遍，放置於60°`C烘箱中12h，烘乾後用粉碎機粉碎I分鐘，過80目篩後備用。
[0073]( 2)將Ig乾燥的滸苔粉置於三角瓶中，加入到實施例3中製得的粗酶液中，滸苔粉與粗酶液的加入配比為lg: 50mL，於50°C水浴鍋中反應48h，然後按DNS法，測得還原糖得率為10.03%，說明粗酶液對滸苔中的纖維素類物質有很好地降解作用，可將纖維素降解為還原糖，為滸苔進一步製取生物乙醇做好了準備。
[0074]實施例5
[0075]粗酶液對滸苔的酶解應用。
[0076](I)以黃海海域大量暴發的綠潮藻滸苔為原料，清洗除去貝殼、沙石等雜物後，清水漂洗海藻3-4遍，放置於60°C烘箱中12h，烘乾後用粉碎機粉碎I分鐘，過80目篩後備用。
[0077]( 2)將Ig乾燥的滸苔粉置於三角瓶中，加入到實施例2中製得的粗酶液中，滸苔粉與粗酶液的加入配比為lg: 50mL，於50°C水浴鍋中反應48h，然後按DNS法，測得還原糖得率為9.53%，說明粗酶液對滸苔中的纖維素類物質有很好地降解作用，可將纖維素降解為還原糖，為滸苔進一步製取生物乙醇做好了準備。
【權利要求】
1.一種芽孢桿菌Π13菌株，其特徵在於:保藏號CGMCC N0.8269。
2.如權利要求1所述的芽孢桿菌FH3菌株的篩選方法，其步驟包括: (1)將腐爛的滸苔藻體的懸液加入到選擇培養基中，搖床培養2-3天； (2)將步驟(1)中的選擇培養液經梯度稀釋後的菌懸液，塗布在鑑別培養基上，待菌落長出； (3)在長出菌落的平板上用剛果紅染色法篩選有透明圈的菌株，並用平板劃線分離法分離、提純。
3.根據權利要求2所述的芽孢桿菌--3菌株的篩選方法，其特徵在於:所述步驟(O中，腐爛的滸苔藻體的懸液與選擇培養基的體積比為1:25-45 ;搖床培養的溫度為25-35°C，轉速為 135-145r/min。
4.根據權利要求2或3所述的芽孢桿菌FH3菌株的篩選方法，其特徵在於:所述步驟(O中，選擇培養基中的組分包括纖維素粉、硝酸鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、酵母膏、水解酪素及陳海水，各組分的加入配比依次為3-5g:lg:0.3-0.5g:1.1-1.3g:0.8~lg:0.4-0.5g:0.4-0.5g:0.4-0.5g:950_1050mL。
5.根據權利要求2所述的芽孢桿菌FH3菌株的篩選方法，其特徵在於:所述步驟(2)中，鑑別培養基中的組分包括羧甲基纖維素鈉、酵母膏、磷酸二氫鉀、瓊脂、土豆汁及陳海水，各組分的加入配比依次為 5-10g:lg:0.1-0.3g:12-16g:90-1 IOmL:950_1050mL。
6.如權利要求1所述的芽孢桿菌FH3菌株酶解滸苔的應用方法: Ca)將芽孢桿菌--3菌株於LB液體培養基中振蕩培養22-26小時，然後在菌液中加入凍存緩衝液，於_20°C—-25°C保存； (b)將步驟(a)中的芽孢桿菌--3菌株於LB斜面培養基中斜面活化培養，然後挑取一滿環於LB液體培養基中，振蕩培養24-28h後取l-2mL菌液於已滅菌纖維素液體發酵培養基中，振蕩培養5-7天；將發酵液低溫離心，取上清液為粗酶液或是將發酵液過濾，取濾液為粗酶液； (c)將乾淨的滸苔乾燥、粉碎，然後與步驟(b)中的粗酶液於45-55°C條件下反應45-50小時。
7.根據權利要求1所述的芽孢桿菌FH3菌株酶解滸苔的應用方法，其特徵在於:所述步驟(a)中，振蕩培養的溫度為25-35°C，轉速為135_145r/min ;所述緩衝液是體積濃度為45-55%的甘油，緩衝液與菌液的體積比為1:1-1.5。
8.根據權利要求1所述的芽孢桿菌FH3菌株酶解滸苔的應用方法，其特徵在於:所述步驟(b)中，振蕩培養的溫度為30-35°C，轉速為135-145r/min ;離心分離溫度為3_5°C，離心轉速為3500-4500r/min，離心時間為10-20分鐘。
9.根據權利要求1所述的芽孢桿菌FH3菌株酶解滸苔的應用方法，其特徵在於:所述步驟(b)中，纖維素液體發酵培養基中的組分包括酵母浸膏、蛋白腖、羧甲基纖維素鈉及陳海水，各組分的加入配比依次為Ig:3-6g:8-12g:950-1050mL。
10.根據權利要求1所述的芽孢桿菌FH3菌株酶解滸苔的應用方法，其特徵在於:所述步驟(c)中，將乾淨的滸苔於55-65°C下乾燥10-14小時，然後粉碎至60-100目；滸苔與粗酶液的加入量比為Ig:45-55mL。
【文檔編號】C12N1/20GK103695334SQ201310594997
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年11月21日 優先權日:2013年11月21日
【發明者】費嵐, 邵飛, 胡樂琴, 何培民, 賈睿 申請人:上海海洋大學