以端粒酶活性判斷卵巢上皮性癌藥物敏感性的方法
2023-10-22 15:39:57 2
專利名稱：以端粒酶活性判斷卵巢上皮性癌藥物敏感性的方法
技術領域：
本發明屬於惡性腫瘤診斷領域，特別是一種以端粒酶活性判斷卵巢上皮性癌藥物敏感性的方法。
背景技術：
細胞減滅術加術後以順鉑為基礎的聯合化療是卵巢上皮性癌的一種常規治療模式。目前臨床選擇化療藥物仍具有一定盲目性，因為卵巢上皮性癌化療方案大多是根據臨床經驗總結出來的，主要針對不同病理類型來選擇不同的化療方案，而不是根據患者腫瘤的生物學本質與特性來選擇用藥。因此同一種化療方案將產生不同的療效。為了克服這一問題，現有技術已對腫瘤進行體外藥敏檢測做了大量研究，其中的方法有四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測法、活細胞計數法等，對臨床選擇敏感化療藥物有一定的指導作用。但在原代細胞培養中，由於細胞成分複雜，在腫瘤細胞中常夾雜許多正常細胞，而以上方法不能區別化療藥物作用於腫瘤細胞與正常細胞間的差異。因此，以其作為藥物篩選指標具有較大的局限性。近年來，還有研究發現，90％以上的卵巢上皮性癌中端粒酶活性增強，而在正常卵巢組織中，端粒酶常呈陰性或活性較低，但目前尚未見以端粒酶活性作為檢測藥物敏感性指標的報導。
發明內容本發明的目的是提供一種以端粒酶活性判斷卵巢上皮性癌藥物敏感性的方法，它是一種以檢測用藥前後端粒酶活性變化作為判斷卵巢上皮性癌化療藥物敏感性的方法，與MTT法相比具有更廣泛的臨床應用前景，可以客觀地指導臨床選擇用藥。
本發明為實現上述目的所採用的方案，是一種以端粒酶活性判斷卵巢上皮性癌藥物敏感性的方法，其特徵是按以下步驟完成1)取患者卵巢上皮性癌組織進行原代培養；2)取原代培養後腫瘤細胞提取液測定腫瘤細胞原始端粒酶活性；
3)取原代培養後腫瘤細胞加入順鉑或阿黴素繼續培養，以胰蛋白酶消化貼壁腫瘤細胞，測定用藥後腫瘤細胞端粒酶活性；4)計算用藥後端粒酶活性比原始端粒酶活性的下降程度，當端粒酶活性下降超過30％時判斷為藥物敏感，低於30％時判斷為藥物不敏感。
本發明的有益效果是本發明依據卵巢上皮性癌中端粒酶活性增強，而在正常卵巢組織中，端粒酶常呈陰性或活性較低的性質。以不同化療藥物處理卵巢上皮性癌原代培養細胞，測定處理前後腫瘤細胞提取液中端粒酶活性的改變，可以客觀反映出腫瘤細胞對化療藥物的敏感程度，而正常細胞的存在對端粒酶活性的改變並不產生影響。所以實驗結果可靠，特異性強，從而有效地指導臨床選擇用藥。
實驗證明耐藥腫瘤細胞中端粒酶活性較相應的藥物敏感腫瘤細胞中端粒酶活性增高27.68％～69.06％。卵巢癌SKOV3細胞數量與端粒酶活性呈正相關，即卵巢癌活細胞數量越多，端粒酶活性越高。在藥物敏感性腫瘤細胞中，用藥前後端粒酶活性下降均高於50％，而在相應的耐藥腫瘤細胞中，用藥前後端粒酶活性下降均低於30％，說明端粒酶活性下降程度與腫瘤藥物敏感性有關。
本發明通過端粒酶活性檢側，MTT法測定腫瘤生長抑制率，以及與臨床療效進行對比證明端粒酶活性下降法較MTT法臨床符合率高。
在11例卵巢上皮性癌中，分別加入順鉑、阿黴素進行用藥前後端粒酶活性檢側，結果表明端粒酶活性下降在30％以上者分別有9例(81.82％)、9例(81.82％)，端粒酶活性下降低於30％者分別有2例(18.18％)、2例(18.18％)。
以MTT法測定腫瘤生長抑制率，在11例患者中，順鉑、阿黴素生長抑制率在30％以上者分別有4例(36.36％)、7例(63.64％)，而生長抑制率低於30％者分別有7例(63.64％)、4例(36.36％)。
與臨床療效相比，以端粒酶活性下降法及MTT法測定卵巢上皮性癌對順鉑及阿黴素敏感性與臨床療效符合率分別為90.91％、63.64％及90.91％、72.73％。
具體實施方式以端粒酶活性判斷卵巢上皮性癌藥物敏感性的方法，首先要對患者卵巢上皮性癌組織進行原代培養，然後取原代培養後腫瘤細胞提取液測定腫瘤細胞原始端粒酶活性，另取原代培養後腫瘤細胞加入順鉑或阿黴素後繼續培養72小時，測定用藥後腫瘤細胞端粒酶活性，再用公式ΔA＝1-用藥後端粒酶活性/用藥前端粒酶活性，計算用藥後端粒酶活性比原始端粒酶活性的下降程度。當端粒酶活性下降超過30％時判斷為藥物敏感，低於30％時判斷為藥物不敏感。
本發明採用的卵巢上皮性癌組織原代培養方法是將卵巢上皮性癌患者手術中切除的癌組織立即放入含有RPMI1640培養基的無菌培養瓶中，於超淨臺中打開放入無菌培養皿內，以生理鹽水反覆衝淨血液後用剪刀將組織剪碎，並以RPMI1640反覆衝洗。然後以0.125％～0.25％胰蛋白酶在37℃下消化10～20分鐘，以胎牛血清滅活後反覆吹打製成單細胞懸液，1500bpm離心，棄上清液，以RPMI1640加10％胎牛血清將細胞沉澱旋起，調整細胞濃度為1×106/ml接種於培養皿中，在37℃、5％CO2培養箱中培養。
本專利採用的端粒酶檢測法TRAP-PCR-ELISA法檢測端粒酶活性，為半定量方法。其中1)首先通過Folin-酚試劑法(Lowry法)測定卵巢上皮性癌組織提取液中蛋白質含量①制定標準曲線取人血清白蛋白5mg溶於5ml雙蒸水中，再製成濃度為250μg/ml的工作液。分別取工作液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml，用水補足到1.0ml。每個濃度各取3組。在各試管中加入5ml試劑甲，混勻，於20～25℃放置10分鐘，再加入0.5ml試劑乙(Folin氏試劑)，立即振蕩搖勻，在20～25℃保溫30分鐘，然後於500nm處比色。以1ml蒸餾水代替樣品作為空白對照。繪製標準曲線，計算回歸方程；②將待測樣品卵巢上皮性癌組織提取液以相同方法進行上述檢測比色，並於每次行0.4ml工作液做對照，將結果帶入直線回歸方程，計算樣品中蛋白質含量；2)進行無RNA酶(RNase)實驗條件的製備以0.1％焦碳酸乙二脂(DEPC)處理Eppendorf管、薄壁PCR管及各種吸頭，並以0.1％DEPC處理的雙蒸水配製磷酸緩衝液(PBS)，再以15磅20分鐘高壓滅菌，同時去除殘留的DEPC。
3)TRAP-PCR-ELISA檢測收集消化後離心沉澱的腫瘤細胞，將其置於Eppendorf管中，加入裂解液200μl，冰浴30分鐘。4℃，13000g離心20分鐘，取上清液移入另一管中。以上述方法測定組織提取液中蛋白含量後取6μg蛋白進行PCR，反應體系為50μl，其中包括端粒酶底物、端粒序列特異性引物P1-TS標記生物素引物及P2擴增引物等。
然後，分別取陽性對照液與陰性對照液3μl作為對照。加變性反應液20μl及PCR擴增產物5μl，室溫放置10分鐘。加雜交緩衝液225μl，取100μl轉入微孔板，在37℃、300bpm水浴搖床上雜交2小時。以洗滌緩衝液250μl洗滌2次，加Anti-DIG-POD(結合有過氧化物酶的抗地戈辛抗體)100μl，終濃度10mU/ml，室溫下放置30分鐘，以洗滌緩衝液250μl洗滌2次。加TMB底物100μl，室溫下放置10-20分鐘。加入終止液100μl，在波長為450nm、690nm下測定吸光度，根據以下公式計算端粒酶活性。
△A＝標本值(A450-A690)-標準陰性對照值(A450-A690)其中標準陰性對照值(A450-A690)應小於0.25U，標準陽性對照值(A450-A690)應大於1.5U，當△A＞0.2U判斷為陽性。
在本發明中測定用藥前後腫瘤細胞端粒酶活性，是先將卵巢上皮性癌組織以胰蛋白酶消化法製成單細胞懸液，調整腫瘤細胞濃度為1×106/ml，取2ml測定原始端粒酶活性。然後另取2ml接種培養皿，繼續培養12小時，加入順鉑10μg/ml或阿黴素1μg/ml，繼續培養72小時終止，以0.25％胰蛋白酶消化貼壁腫瘤細胞，測定用藥後端粒酶活性。
例153歲，右卵巢漿液性囊腺癌III期，行細胞減滅術，術後殘存病灶為1cm，癌組織以胰蛋白酶消化法行原代培養，由於腫瘤呈菜花狀，質糟脆，故胰蛋白酶濃度選擇0.125％，37℃下消化10分鐘，消化較完全。檢測端粒酶活性為2.495U，加用順鉑、阿黴素後檢測端粒酶活性分別為1.254U、1.023U，用藥前後端粒酶活性分別下降49.74％、59.0％，提示該患者對順鉑、阿黴素均敏感，而MTT法測定順鉑、阿黴素的腫瘤細胞抑制率分別為10.33％、48.67％，提示腫瘤對順鉑不敏感，而對阿黴素敏感，臨床隨訪結果表明，該患者對順鉑、環磷醯胺方案化療有效。
例2患者58歲，雙卵巢漿液性乳頭狀腺癌III期，行細胞減滅術，術後殘存病灶為1cm，癌組織以胰蛋白酶消化法行原代培養，由於腫瘤組織呈結節狀，組織較緻密，故胰蛋白酶濃度選擇0.25％，37℃下消化20分鐘，消化較完全。檢測端粒酶活性為2.705U，加用順鉑、阿黴素後檢測端粒酶活性分別為1.632U、1.569U，用藥前後端粒酶活性分別下降39.67％、42.0％，提示該患者對順鉑、阿黴素均敏感，而MTT法測定順鉑、阿黴素的腫瘤細胞抑制率分別為14.45％、34.91％，提示腫瘤對順鉑不敏感，而對阿黴素敏感，臨床隨訪結果表明，該患者對順鉑、環磷醯胺方案化療有效。但在8個療程化療結束後1年患者復發，血CA125再次升高，再次給予順鉑、環磷醯胺方案化療仍有效。
例3患者49歲，雙卵巢漿液性乳頭狀腺癌IV期，左鎖骨上淋巴結活檢陽性，行1個療程順鉑、阿黴素、環磷醯胺先期化療後手術，術後最大殘留病灶2cm，癌組織以胰蛋白酶消化法行原代培養，胰蛋白酶濃度為0.25％，37℃下消化15分鐘，消化較完全。檢測端粒酶活性為2.879U，加用順鉑、阿黴素後檢測端粒酶活性分別為2.133U、2.215U，用藥前後端粒酶活性分別下降25.91％、23.06％，提示該患者對順鉑、阿黴素均不敏感，而MTT法測定順鉑、阿黴素的腫瘤細胞抑制率分別為13.33％、10.33％，也提示腫瘤對順鉑、阿黴素均不敏感，臨床隨訪結果表明，在第三療程順鉑、阿黴素、環磷醯胺化療後，患者血CA125沒有下降反而顯著增高，提示患者對順鉑、阿黴素耐藥。
例4患者54歲，左卵巢漿液性腺癌III期，細胞減滅術後最大殘留病灶小於2cm，癌組織以胰蛋白酶消化法行原代培養，胰蛋白酶濃度為0.125％，37℃下消化15分鐘，消化較完全。檢測端粒酶活性為1.776U，加用順鉑、阿黴素後檢測端粒酶活性分別為0.998U、0.734U，用藥前後端粒酶活性分別下降43.81％、58.67％，提示該患者對順鉑、阿黴素均敏感，而MTT法測定順鉑、阿黴素的腫瘤細胞抑制率分別為40.68％、87.33％，也提示腫瘤對順鉑、阿黴素均敏感，臨床隨訪結果表明，患者對順鉑、阿黴素、環磷醯胺方案化療有效。患者血CA125水平持續下降，至第四療程化療後降至正常。
權利要求
1一種以端粒酶活性判斷卵巢上皮性癌藥物敏感性的方法，其特徵是按以下步驟完成1)取患者卵巢上皮性癌組織進行原代培養；2)取原代培養後腫瘤細胞提取液測定腫瘤細胞原始端粒酶活性；3)取原代培養後腫瘤細胞加入順鉑或阿黴素繼續培養，以胰蛋白酶消化貼壁腫瘤細胞，測定用藥後腫瘤細胞端粒酶活性；4)計算用藥後端粒酶活性比原始端粒酶活性的下降程度，當端粒酶活性下降超過30％時判斷為藥物敏感，低於30％時判斷為藥物不敏感。
2按照權利要求1所述的方法，其特徵在於卵巢上皮性癌組織原代培養的方法是將手術中切下的癌組織放入含有RPMI1640培養基的無菌培養瓶中，於超淨臺中打開放入無菌培養皿內，以生理鹽水反覆衝淨血液後用剪刀將組織剪碎，並以RPMI1640反覆衝洗；然後以0.125％～0.25％胰蛋白酶在37℃下消化10～20分鐘，以胎牛血清滅活後反覆吹打製成單細胞懸液，1500bpm離心，棄上清液，以RPMI1640加10％胎牛血清將細胞沉澱旋起，後調整細胞濃度為1×106/ml，接種於培養皿中，在37℃、5％CO2培養箱中培養。
3按照權利要求1或2所述的方法，其特徵在於應用TRAP-PCR-ELISA法檢測用藥前端粒酶活性，是以胰蛋白酶消化法將卵巢上皮性癌組織製成單細胞懸液，調整腫瘤細胞濃度為1×106/ml，取2ml測定原始端粒酶活性。
4按照權利要求1或2所述的方法，其特徵在於應用TRAP-PCR-ELISA法檢測用藥後端粒酶活性，是以胰蛋白酶消化法將卵巢上皮性癌組織製成單細胞懸液，調整腫瘤細胞濃度為1×106/ml，取2ml接種於培養皿中，繼續培養12小時，加入順鉑10μg/ml或阿黴素1μg/ml，繼續培養72小時終止，以0.25％胰蛋白酶消化貼壁腫瘤細胞，測定端粒酶活性。
全文摘要
本發明是一種以端粒酶活性判斷卵巢上皮性癌藥物敏感性的方法，首先對患者卵巢上皮性癌組織進行原代培養，然後取原代培養後腫瘤細胞提取液測定腫瘤細胞原始端粒酶活性，另取原代培養後腫瘤細胞加入順鉑或阿黴素後繼續培養，測定用藥後腫瘤細胞端粒酶活性，最後計算用藥後比原始端粒酶活性的下降程度，並判斷藥物是否敏感。本發明以不同化療藥物處理卵巢上皮性癌原代培養細胞，測定處理前後腫瘤細胞提取液中端粒酶活性的改變，可以客觀反映出腫瘤細胞對化療藥物的敏感程度，而正常細胞的存在對端粒酶活性的改變並不產生影響。所以實驗結果可靠，特異性強，從而可以有效地指導臨床選擇用藥。
文檔編號C12Q1/25GK1563412SQ200410018808
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月30日 優先權日2004年3月30日
發明者瞿全新, 糜若然 申請人:天津醫科大學總醫院