一種雞卵黃抗體的提取方法

2023-10-07 18:30:39

一種雞卵黃抗體的提取方法
【專利摘要】本發明公開了一種雞卵黃抗體的提取方法，步驟如下：將免疫雞蛋進行清洗、消毒；分離卵黃，打碎，加入蒸餾水稀釋，加入量是卵黃溶液體積的3-6倍，根據高免蛋黃抗體效價確定具體稀釋比例，攪勻後裝入塑膠袋內；在-20℃冰櫃中冷凍，凍透後取出，使其在室溫緩慢融化，邊融化邊用濾布過濾裝置過濾；濾液依次用濾紙、孔徑0.8μm濾膜和孔徑0.22μm濾膜過濾，濾液即為透明澄清的卵黃抗體液。本發明具有以下有益效果：解決了卵黃抗體的簡便、成本低廉，適於大規模工業化生產的問題。提取過程中不使用任何化學藥物，對環境無汙染，使卵黃抗體真正無殘留、無副作用。提取過程中抗體損失較小，提取物抗體效價與蛋黃抗體效價基本一致。
【專利說明】一種雞卵黃抗體的提取方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及疾病免疫【技術領域】，具體涉及一種雞卵黃抗體的提取方法。
【背景技術】
[0002]卵黃抗體即卵黃免疫球蛋白(Egg Yolk Immunoglobulin, IgY),是通過免疫雞，從蛋黃中獲取的相關抗體。自從1893年，Klemperer報導了雞蛋中存在抗體以來，卵黃抗體的研究發展越來越快。以其高的特異性和針對性，識別和結合外來抗原並使之失活而用於人類和畜禽疾病的診斷與防治。卵黃抗體化學性質穩定，耐熱、耐酸、抗離子強度和一定的抗酶降解能力。在75°C以下穩定性良好，室溫6個月，2-4°C五年活性無明顯變化。60°C,，30min巴氏消毒不影響其活性；pH4.0-11.0時比較穩定，對胃蛋白酶有較高的抵抗力。耐反覆凍融，反覆凍融5次活性不受影響。卵黃抗體具有來源豐富，產量高，成本低，無副作用，無殘留，不發生交叉血清反應，使用方便，既可注射又可口服等優點。此外IgY比從哺乳動物提取的抗體更加安全衛生 。
[0003]20世紀末頁由於新城疫、雞傳染性法氏囊病的大量流行，卵黃抗體已在我國廣泛應用，不過那時只是將高免蛋黃打碎加適量的生理鹽水和防腐抑菌劑，製作方法簡單、粗略、安全性低，準確的說不能叫卵黃抗體，而是「卵黃液」。現今人們已經研製出多種提取、精製卵黃抗體的方法，如無機鹽沉澱法、聚乙二醇(PEG)沉澱法、氯仿抽提法、水稀釋法、凍融法、超濾法、硫酸葡聚糖、天然膠，如藻酸鈉、角叉聚糖或乙醇沉澱等方法初步純化蛋白質。
[0004]上述提取方法存在提取過程複雜、提取成本較高，抗體損失較多，並對環境造成汙染，大量生產有一定的局限性。

【發明內容】

[0005]為了解決現有技術的不足，本發明依據水稀釋法、凍融法的原理設計出水稀釋-凍融提取方法，本發明步驟簡單，成本低，易大規模工業化生產，不使用化學試劑，無抗體損失的物理提取技術。
[0006]為了實現上述目的，本發明所採用的技術方案是:一種雞卵黃抗體的提取方法，其特徵在於，具體步驟如下:
[0007].1)、將免疫雞蛋進行清洗、消毒；
[0008].2)、從免疫雞蛋中取得卵黃，打碎，加入蒸餾水稀釋，加入量是卵黃溶液體積的3-6倍，稀釋倍數根據卵黃抗體效價確定，攪勻後裝入塑膠袋內；
[0009].3)、在_20°C冰櫃中冷凍，凍透後取出，使其在室溫緩慢融化，邊融化邊用濾布過濾裝置過濾；
[0010].4)、將步驟3)得到的濾液依次用濾紙、孔徑0.8 μ m濾膜和孔徑0.22 μ m濾膜過濾，濾液即為透明澄清的卵黃抗體液。
[0011]上述的消毒，是用0.1%高錳酸鉀水浸泡十分鐘消毒。
[0012]本發明的進一步改進是在用孔徑0.22μπι濾膜過濾之前，向濾液中加入保護劑，所述的保護劑成分和其成分在提取卵黃液中含量為氯化鈉0.9%、亞硫酸氫鈉0.2%、EDTA2Na0.08%、吐溫 800.4%。
[0013]所述步驟2)中加入蒸餾水的量是卵黃溶液體積的6倍。
[0014]所述步驟2)中加入蒸餾水的量是卵黃溶液體積的3倍。
[0015]所述步驟I)還包括取出消毒後的免疫雞蛋，將免疫雞蛋表面的高錳酸鉀液晾乾。
[0016]本發明克服了現有卵黃抗體提取過程複雜，成本高，抗體損失較多，並對環境造成汙染，不適合規模化生產等不足。具有以下有益效果:(1)解決了卵黃抗體的簡便、低成本，適宜規模化生產的問題。(2)本發明提取過程中不使用任何化學藥物，對環境無汙染，使卵黃抗體真正無殘留、無副作用。(3)本發明提取過程中對抗體損失較少，雞卵黃中抗體血凝抑制效價和提純卵黃抗體效價比例與稀釋倍數基本一致；抗體液中不含卵黃顆粒，易吸收，無刺激。
【具體實施方式】
[0017]實施例1
[0018](I)雞新城疫克隆株30活疫苗；
[0019](2)免疫20隻褐殼蛋雞，間隔10天免疫一次，共免疫3次。第三免後第10天檢測卵黃抗體水平，確定卵黃的稀釋倍數為1:6。
[0020](3)抗體水平較高時期收集雞蛋，消毒，分離卵黃，加6倍的蒸餾水，充分攪拌，裝入塑膠袋內，在冰櫃冷凍，凍透後取出緩慢融化，同時進行濾布過濾，濾液依次用濾紙、孔徑0.8 μ m濾膜過濾，向濾液中加入保護劑，所述的保護劑成分和其成分在提取卵黃液中含量為氯化鈉0.9%、亞硫酸氫鈉0.2%、EDTA2Na0.08%、吐溫800.4%。，最後孔徑0.22 μ m濾膜過濾，即獲得澄清透明的卵黃抗體液，核酸蛋白檢測儀檢測蛋白含量，分裝。
[0021]實施例2
[0022]( I)雞新城疫克隆株30活疫苗；
[0023](2)免疫20隻褐殼蛋雞，間隔10天免疫一次，共免疫3次。第三免後第12天檢測卵黃抗體水平，確定卵黃的稀釋倍數為1:5。
[0024](3)抗體水平較高時期收集雞蛋，消毒，分離卵黃，加5倍的蒸餾水，充分攪拌，裝入塑膠袋內，在冰櫃冷凍，凍透後取出緩慢融化，同時進行濾布過濾，濾液依次用濾紙、孔徑0.8 μ m濾膜過濾，向濾液中加入保護劑，所述的保護劑成分和其成分在提取卵黃液中含量為氯化鈉0.9%、亞硫酸氫鈉0.2%、EDTA2Na0.08%、吐溫800.4%。，最後孔徑0.22 μ m濾膜過濾，即獲得澄清透明的卵黃抗體液，核酸蛋白檢測儀檢測蛋白含量，分裝。
[0025]實施例3
[0026](I)禽流感H9活疫苗
[0027](2)免疫20隻褐殼蛋雞，間隔10天免疫一次，共免疫3次。第三免後第10天，用血凝抑制試驗檢測禽流感H9卵黃抗體水平，確定卵黃的稀釋倍數為1:6。
[0028](3)抗體水平較高時期收集雞蛋，消毒，分離卵黃，加6倍的蒸餾水，充分攪拌，裝入塑膠袋內，在冰櫃冷凍，凍透後取出緩慢融化，同時進行濾布過濾，濾液依次用濾紙、孔徑0.8 μ m濾膜過濾，向濾液中加入保護劑，所述的保護劑成分和其成分在提取卵黃液中含量為氯化鈉0.9%、亞硫酸氫鈉0.2%、EDTA2Na0.08%、吐溫800.4%。，最後孔徑0.22 μ m濾膜過濾，即獲得澄清透明的卵黃抗體液，核酸蛋白檢測儀檢測蛋白含量，分裝。
[0029]實施例4
[0030](I)禽流感H9活疫苗
[0031](2)免疫20隻褐殼蛋雞，間隔10天免疫一次，共免疫3次。第三免後第9天，用血凝抑制試驗檢測禽流感H9卵黃抗體水平，確定卵黃的稀釋倍數為1:4。
[0032](3)抗體水平較高時期收集雞蛋，消毒，分離卵黃，加4倍的蒸餾水，充分攪拌，裝入塑膠袋內，在冰櫃冷凍，凍透後取出緩慢融化，同時進行濾布過濾，濾液依次用濾紙、孔徑
0.8 μ m濾膜過濾，向濾液中加入保護劑，所述的保護劑成分和其成分在提取卵黃液中含量為氯化鈉0.9%、亞硫酸氫鈉0.2%、EDTA2Na0.08%、吐溫800.4%。，最後孔徑0.22 μ m濾膜過濾，即獲得澄清透明的卵黃抗體液，核酸蛋白檢測儀檢測蛋白含量，分裝。
[0033]實施例5
[0034](I)禽流感 H5-4、H5-5、H5-6 活疫苗；
[0035](2)免疫20隻褐殼蛋雞，間隔10天免疫一次，共免疫3次。第三免後第8天檢測卵黃抗體水平，確定卵黃的稀釋倍數為1:3。
[0036](3)抗體水平較高時期收集雞蛋，消毒，分離卵黃，加3倍的蒸餾水，充分攪拌，裝入塑膠袋內，在_20°C冷凍，凍透後取出緩慢融化，同時進行濾布過濾，濾液依次用濾紙、孔徑0.8 μ m濾膜過濾，向濾液中加入保護劑，所述的保護劑成分和其成分在提取卵黃液中含量為氯化鈉0.9%、亞硫酸氫鈉0.2%、EDTA2Na0.08%、吐溫800.4%。，最後孔徑0.22 μ m濾膜過濾，即獲得澄清透明的卵黃抗體液，核酸蛋白檢測儀檢測蛋白含量，分裝。
[0037]為了進一步說明本發明的具體使用效果，以下採用實驗數據來加以驗證。
[0038]一、安全和穩定性試驗
[0039](1)動物安全試驗
[0040]取本發明卵黃抗體樣品，注射5隻家兔、5隻小白鼠和10隻雞，間隔12h量一次兔子體溫，並觀察各組試驗動物有無異常症狀。連續觀察15天，各組試驗動物未出現異常症狀，家兔體溫無變化。
[0041](2)光穩定性試驗
[0042]將本發明的卵黃抗體也適量裝入玻璃瓶內，密封后在(4500 ±500) Ix光照條件下室溫放置，分別於0、5和IOd取樣觀察。結果表明，本發明外觀一直保持透明澄清，未見分層、色變、絮凝、沉澱等現象，抗體效價未發生變化。
[0043](3)溫度穩定性和保存時間試驗
[0044]將卵黃抗體液分裝於玻璃瓶內，密封后分別置於4°C和20°C條件下留樣考察，每隔15d取樣觀察並檢測抗體水平。結果表明，本發明在4°C條件下保存9個月外觀性狀和抗體效價未見明顯變化；在20°C條件下6個月外觀性狀和抗體效價未見明顯變化。
[0045](4)反覆凍融試驗
[0046]將卵黃抗體分裝於玻璃瓶中，密封后_20°C冷凍，在室溫融化，這樣反覆凍融8次，每次融化後觀察外觀並檢測抗體效價，試驗結果表明凍融五次對抗體效價沒有明顯影響，第6次開始抗體效價逐漸下降；反覆凍融對卵黃抗體的外觀無影響。
[0047]二、室內治療實驗
[0048]以雞新城疫為例，人工感染新城疫治療實驗。[0049]將AA商品代肉仔雞200隻飼養至21日齡(此時母源抗體已消失殆盡)，挑選發育良好、均勻一致的150隻，分為5組。分別為:
[0050]1組為預防組:先注射實施例1製得的抗新城疫卵黃抗體液1ml，間隔一天再注射新城疫病毒(XX08-NDV)；
[0051]2組為治療I組:按100 μ I/只量接種XX08-NDV病毒，發病後注射實施例1製得的抗新城疫卵黃抗體(IgY) Irnl ；
[0052]3組為治療2組:按100 μ I/只量接種XX08-NDV病毒，發病後注射實施例1製得的抗新城疫卵黃抗體Iml,連續注射兩天；
[0053]4組為同居感染治療組:本試驗組雞與治療I組一起飼養，同居感染髮病後注射實施例2製得的抗新城疫卵黃抗體Iml,連續用兩天；
[0054]5組為對照組:只注射XX08-NDV。
[0055]試驗按以下標準判定:
[0056]發病:雞隻出現精神食慾異常，呼吸困難，拉綠色稀糞，死亡雞氣管黏膜充血或出血，腺胃黏膜有出血點，腸道黏膜出血或有局灶性潰瘍可判為發病。
[0057]治癒:精神活潑，採食增加，糞便正常，體重增加為治癒。
[0058]雞隻攻毒後第三天出現精神沉鬱，拉黃白色稀糞，呼吸困難，並出現死亡。病死雞剖檢氣管黏膜充血或出血，腺胃黏膜有出血點，腸道黏膜出血或有局灶性潰瘍等典型新城疫病理變化。出現症狀後開始注射抗新城疫卵黃抗體。注射IgY後第三天症狀逐漸消失，第四到五天完全康復。
[0059]預防組保護率為96.66% ;治療組一次用卵黃抗體保護率為60.00%,兩次用卵黃抗體保護率為80.00%;同居感染(相當於自然感染病例)兩次用IgY保護率達93.33%。實驗
結果詳見下表。
[0060]
【權利要求】
1.一種雞卵黃抗體的提取方法，其特徵在於，具體步驟如下: 1)、將免疫雞蛋進行清洗、消毒； 2)、從免疫雞蛋中取得卵黃，打碎，加入蒸餾水稀釋，加入量是卵黃液體積的3-6倍，攪勻後裝入塑膠袋內； 3)、在-20°C冰櫃中冷凍，凍透後取出，使其在室溫緩慢融化，邊融化邊用濾布過濾裝置過濾； 4)、將步驟3)得到的溶液依次用濾紙、孔徑0.8 μ m濾膜和孔徑0.22 μ m濾膜過濾，濾液即為透明澄清的卵黃抗體液。
2.根據權利要求1所述的一種雞卵黃抗體的提取方法，其特徵在於，所述的消毒，是用0.1%高錳酸鉀水浸泡十分鐘消毒。
3.根據權利要求1所述的一種雞卵黃抗體的提取方法，其特徵在於，在用孔徑0.22 μ m濾膜過濾之前，向濾液中加入保護劑，所述的保護劑成分和其成分在提取卵黃液中含量為氯化鈉0.9%、亞硫酸氫鈉0.2%、EDTA2Na0.08%、吐溫800.4%。
4.根據權利要求1所述的一種雞卵黃抗體的提取方法，其特徵在於，所述步驟2)中加入蒸餾水的量是卵黃溶液體積的6倍。
5.根據權利要求1所述的一種雞卵黃抗體的提取方法，其特徵在於，所述步驟2)中加入蒸餾水的量是卵黃溶液體積的3倍。
6.根據權利要求2所述 的一種雞卵黃抗體的提取方法，其特徵在於，所述步驟I)還包括取出消毒後的免疫雞蛋，將免疫雞蛋表面的高錳酸鉀液晾乾。
【文檔編號】C07K16/02GK103509106SQ201310468282
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月8日 優先權日:2013年10月8日
【發明者】銀梅, 王新華, 唐海榮, 王秋霞, 寧紅梅, 陳桂香 申請人:河南科技學院