金銅合金納米晶體為有效成分的藥物組合物及其在製藥中的應用的製作方法

2023-10-07 09:57:19 7

金銅合金納米晶體為有效成分的藥物組合物及其在製藥中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及金銅合金納米晶體為有效成分的藥物組合物及其在製藥中的應用。特別是金銅合金納米晶體在製備治療腫瘤的藥物中的應用。本發明中使用的金銅合金納米晶體與其他光熱材料相比易於大量合成，光熱效果顯著。本發明首次將賤金屬銅摻雜的金屬合金與光熱療法結合起來，實現降低光熱材料的成本的同時，簡單、高效、快速地治療腫瘤。
【專利說明】金銅合金納米晶體為有效成分的藥物組合物及其在製藥中 的應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於貴金屬納米顆粒用於生物診療領域，特別涉及金銅合金納米晶體為有 效成分組成的藥物組合物，及其在製備治療腫瘤的藥物中的應用，以及其在光熱治療癌症 方面的應用。

【背景技術】
[0002] 近幾年來，現有技術對不同結構的金屬納米材料（金納米棒，金納米六角棒，金納 米籠，金納米殼，鈀納米片等）用於光熱治療方面進行了大量的研究。例如，《先進功能材 料》（Adv. Funct. Mater. 19. 3901-3909, 2009)報導了金納米殼在光熱治療學上的應用。《自 然一納米技術》(Nat. nanotechnol6. 28-322011)報導了單分散鈕納米片光熱殺死人肝癌細 胞上的應用。《美國化學會一納米》(ACS Nano7. 2068-20772013)集中比較了金納米棒，金納 米六角棒，金納米籠在光熱治療小鼠乳腺癌上的效果。目前，這些材料用於光熱治療領域已 經進入活體實驗階段，其技術趨於成熟。然而，目前用於光熱治療的金屬材料無一避免需要 使用成本較高的Au，Pd等金屬，如何降低光熱材料的成本成為一個亟待解決的問題。因此， 將一個賤金屬與貴金屬製成合金並將其用於光熱治療領域是一項十分有意義的工作。但是 到現在為止，尚未有人將具有近紅外光熱性能的金銅合金納米晶體用於光熱治療腫瘤。


【發明內容】

[0003] 本發明的目的在於提供一種金銅合金納米晶體在製備治療腫瘤的藥物中的應用。 使用一種具有近紅外吸收峰的金銅合金納米晶體用作光熱治療腫瘤的材料，從而在保證光 熱效果的同時降低光熱材料的成本。
[0004] 為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：
[0005] 藥物組合物，其含有金銅合金納米晶體作為有效成分，以及藥學上可接受的載體。
[0006] 金銅合金納米晶體在製備治療腫瘤的藥物中的應用。
[0007] 金銅合金納米晶體在製備治療腫瘤的藥物中的應用，通過所述的金銅合金納米 晶體在近紅外區域有較強的表面等離基元共振峰或者對此區域的光有較強的吸收值，在 700-900nm內具有較強的表面等離基元共振峰的特性使腫瘤部位縮小或消失。
[0008] 金銅合金納米晶體在製備治療腫瘤的藥物中的應用，所述應用是由金銅合金納米 晶體具有的光熱效應通過近紅外光照射腫瘤部位使其縮小或消失，所述的光熱效應通過調 節金銅合金納米晶體的濃度或近紅外光的照射功率來控制，所述近紅外光的波長與金銅合 金納米晶體的700-900nm內的表面等離基元共振峰相對應。
[0009] 金銅合金納米晶體在製備治療腫瘤的藥物中的應用，所述應用中，金銅合金納米 晶體是被瘤位注射或者被靜脈注射進動物體內，靜脈注射時，該金銅合金納米晶體被聚乙 二醇或以聚乙二醇為重複單元的聚合物包被。
[0010] 金銅合金納米晶體在製備治療腫瘤的藥物中的應用，所述應用中，金銅合金納米 晶體注射進動物體內，在動物的腫瘤部位聚集，對動物的重要器官不造成損害，通過使用 700-900nm雷射照射腫瘤部位，在該納米晶體作用下腫瘤部位產生局部高溫，造成腫瘤壞 死。
[0011] 金銅合金納米晶體在製備治療腫瘤的藥物中的應用，所述應用中，金銅合金納米 晶體的施用方法採用腫瘤部位局部注射，或被聚乙二醇或以聚乙二醇為重複單元的聚合物 包被後靜脈注射，或與本領域中已知的靶向脊椎動物腫瘤的靶向遞送載體結合後局部注射 或經靜脈注射。
[0012] 金銅合金納米晶體在製備治療的藥物中的應用，所述的腫瘤為乳腺癌、肝癌。
[0013] 在本發明的一個實施方案中，將l-100mg/kg體重的金銅合金納米晶體通過瘤位 注射或者聚乙二醇包被的金銅合金納米晶體通過靜脈注射進入動物體內。注射完成l_24h 後，使用808nm雷射器照射腫瘤部位5-10分鐘以達到溫度穩定。在此後的每天，均進行上 述雷射照射治療，直至腫瘤消失。總共治療周期為4-16天。
[0014] 本發明中所涉及的金銅合金納米晶體，其表面等離基元共振光譜在700-900nm之 間有較強的吸收峰。其注射進入動物體內，不會對動物的重要器官造成損害，並且在動物的 腫瘤部位聚集。通過使用808nm雷射照射腫瘤部位，在該納米晶體的作用下腫瘤部位會產 生局部的高溫，從而造成腫瘤壞死。
[0015] 在本發明的方法中，所述金銅合金納米晶體產生的光熱效應通過調節金銅合金納 米晶體的濃度或近紅外光的輻射功率來控制。本
【發明內容】
的動物應指人或其他脊椎動物。
[0016] 本發明中使用的金銅合金納米晶體與其他光熱材料相比易於大量合成，光熱效果 顯著。本發明首次將賤金屬銅摻雜的金屬合金與光熱療法結合起來，實現降低光熱材料的 成本的同時，簡單、高效、快速地治療腫瘤。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1是本發明實施例2的五角星形金銅合金納米晶體透射電子顯微鏡圖；
[0018] 圖2是本發明實施例2的五角星形金銅合金納米晶體紫外可見近紅外消光譜；
[0019] 圖3是本發明實施例3的五角星形金銅合金納米晶體體外光熱曲線圖；
[0020] 圖4是本發明實施例3的小鼠在注射金銅合金納米晶體前後的近紅外成像圖；
[0021] 圖5是本發明實施例4的實驗組小鼠第一，四，十六天的數碼照片和腫瘤部位特寫 照片；
[0022] 圖6是本發明實施例4的對照組和實驗組小鼠腫瘤體積隨時間變化曲線（相對腫 瘤體積按原始體積為1〇〇 %算）；
[0023] 圖7是本發明實施例5的對照組和實驗組小鼠第一天和第四天腫瘤部位組織切片 圖（HE染色法，方框中的部分是鬆散的結構，可看出腫瘤壞死）；
[0024] 圖8是本發明實施例6中小鼠注射金銅合金納米晶體前後的小鼠重要器官組織切 片圖（HE染色法），第一幅圖中的標尺也是其他圖中的標尺，標尺大小是10微米；
[0025] 圖9是本發明實施例7中以尾靜脈注射修飾過的金銅合金納米晶體的小鼠作為實 驗組，對照組和實驗組的小鼠腫瘤部位升溫曲線。
[0026] 圖10是本發明實施例8中使用的200納米五角星形金銅合金納米晶體的透射電 子顯微鏡圖和紫外可見近紅外消光譜；
[0027] 圖11是本發明實施例8中利用200納米五角星形金銅合金光熱殺死肝癌細胞的 統計圖以及死細胞的臺盼藍染色圖。

【具體實施方式】
[0028] 下面結合附圖，用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但並不以 此來限定本發明。
[0029] 實施例1
[0030] 本發明的【具體實施方式】可以概括如下：
[0031] 本發明提供了金銅合金納米晶體作為有效成分的藥物組合物，及其在製備治療腫 瘤中的應用，以及在光熱治療腫瘤中的用途，其中所述金銅合金納米晶體在700-900nm內 具有較強的表面等離子共振吸收峰。
[0032] 在本發明中，金銅合金納米晶體的施用方法可以採用腫瘤部位局部注射，或者被 聚乙二醇或以聚乙二醇為重複單元的聚合物包被後靜脈注射，或與本領域中已知的靶向脊 椎動物腫瘤的靶向遞送載體結合後局部注射或經靜脈注射。在此要說明的是，本發明所希 望保護的金銅合金納米晶體並不僅限於不經修飾的材料以及本發明所提出的聚乙二醇包 被的金納米棒，還包含其他穩定化的修飾方法。之所以選擇聚乙二醇包被的金銅合金納米 晶體，更多的考慮是在實現延長其在血液中的循環周期的基礎上，保證其生物無毒性和安 全性，尤其是在人體中應用的安全性，而其他不同分子量和不同組分包被的金納米棒也存 在同樣的光熱效應和實際應用潛力。
[0033] 本領域技術人員要理解的是，在本發明中，術語"近紅外區"是指780-1100nm的近 紅外短波區。儘管本發明提及的治療方法是利用金銅合金納米晶體在800nm處進行光熱轉 化，但只要在上述的近紅外光區有很好的光吸收和光熱轉化的能力的金銅合金納米晶體， 均可以實現本發明的目的和技術效果。因此，在本發明中，金銅合金納米晶體的選擇不受限 制，並不要求具體吸收峰位的範圍，只要能夠在780-1100nm的近紅外短波區具有良好的光 吸收和光熱轉化能力即可。考慮到生物組織對近紅外光的吸收，最優選在800-900nm處有 較強光吸收能力的金銅合金納米晶體。
[0034] 術語"表面等離基元共振峰"是指在紫外可見光光譜中所測量到的表面等離子共 振峰。在本發明中，近紅外光的"照射功率"和"照射時間"，可以根據具體的近紅外光發射 裝置和金銅合金納米晶體的應用濃度來適當調節。例如，當所使用的近紅外光發射裝置無 法改變照射功率或照射時間難以精確控制時，可以適度調整金銅合金納米晶體的濃度來調 節所需的光熱效果；而當金銅合金納米晶體的濃度為最適濃度或不適於改變時，可以通過 調節近紅外光的照射功率和照射時間來調節所需的光熱效果。
[0035] 在本發明中，近紅外光的照射部位可以選擇脊椎動物的腫瘤部位，照射面積覆蓋 腫瘤部位的表面積即可。
[0036] 在本發明的一個實施方案中，本發明選擇的金銅合金納米晶體為五角星形，其具 有5個分支，每個分支長度在30-40nm。這裡需要指出，只要在近紅外區有光熱轉化能力的 金銅合金納米晶體，均可用於實際應用，不一定局限於五角星形的形貌和尺寸。本發明之所 以挑選平均大小在70nm的五角星形金銅合金，這是因為這種形貌的金銅合金在近紅外區 光熱轉化能力比較強，而且挑選總尺寸小於l〇〇nm的金銅合金納米晶體，有利於避免其被 脊椎動物的網狀內皮系統所吸收。但是，如上所述，只要金銅合金納米晶體在近紅外區具有 較強的光熱轉化能力，均可以實現本發明。因此，本領域技術人員要理解的是儘管本發明優 選平均總尺寸在70nm的五角星形金銅合金納米晶體，但其不是實現本發明的決定因素。
[0037] 本發明的金銅合金納米晶體經注射，給藥量因藥物不同而各有不同，對成人來說， 每天l-1000mg比較合適。注射液、輸液劑或栓劑等形式給藥。製備上述製劑時，可使用常 規的製劑技術。
[0038] 本發明金銅合金納米晶體製劑可以按常規加注射用水，精濾，灌封滅菌製成注射 液；或將其溶於無菌注射用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏鬥過濾，再無菌精濾，分裝於2安 瓿中，低溫冷凍乾燥後無菌熔封得粉針劑。
[0039] 實施例2
[0040] 五角星形金銅合金納米晶體的製備，表徵以及表面等離基元共振性質。
[0041] 在常溫下，依次向20ml的玻璃反應瓶中加入：濃度為100mM的CuCl2 · 2H20水溶 液0. 3mL，濃度為100mM的HAuC14 · 3H20水溶液0. 3mL，45mg的十六胺，濃度為1M的葡萄糖 水溶液0. 28mL，4mL去離子水以及一粒磁子。將瓶蓋蓋緊後，放在磁力攪拌器上常溫攪拌過 夜。之後，將其轉移至l〇〇°C的油浴中，加熱並磁力攪拌反應4min，隨即加入30mg的十六胺， 反應瓶仍至於油浴中加熱反應，當其中溶液顏色由黃綠色變為深棕色，取出反應瓶，用冰水 冷卻，待溫度降為室溫後，將瓶中反應液移至離心管中，10, OOOrpm下離心8min;在相同條 件下，用去離子水和乙醇分別洗滌3次和2次，以洗掉殘留的反應物，包裹劑十六胺和還原 劑葡萄糖。最終可得乾淨的金銅合金納米晶體，其中每個顆粒的分枝長度在30-40nm之間， 平均尺寸為70nm，Cu摩爾比例在10% -15%之間，其透射電子顯微鏡圖見附圖1。該五角 星形金銅合金納米晶體在740nm處有一吸收峰，具體紫外可見近紅外消光譜見附圖2。
[0042] 實施例3
[0043] 所用實施例2中的金銅合金納米晶體在體外和體內的光熱轉化能力。
[0044] 在一個96孔板的兩個孔裡，分別加入150 μ L的超純水以及溶有濃度為10 μ g/mL 的實施例一中的金銅合金納米晶體的超純水溶液，使用lW/cm2的808nm的雷射分別照射兩 組溶液，溶液的溫度隨照射時間的變化見附圖3。
[0045] 大約5 X 106的4T1乳腺癌細胞溶於60 μ L的磷酸鹽緩衝液（PBS)中，然後將溶液 皮下注射進入正常的BALB/c小白鼠（體重約20g)的側面，待腫瘤體積到達60-70mm 3時， 使用該小白鼠進行試驗。（本段中提到的大約，均指誤差在5%以內）。
[0046] 取一隻小白鼠，用lW/cm2的808nm的雷射照射其腫瘤部位，用溫度成像分析軟體 分析腫瘤部位的溫度變化。然後向該小鼠腫瘤部位注射30 μ Llmg/mL的實施例一中的金銅 合金納米晶體，再用lW/cm2的808nm的雷射照射其腫瘤部位，用溫度成像分析軟體分析腫 瘤部位的溫度變化。兩次的溫度變化見附圖4。
[0047] 實施例4
[0048] 實施例2中的金銅合金納米晶體用於小鼠腫瘤光熱治療。
[0049] 大約5 X 106的4T1乳腺癌細胞溶於60 μ L的磷酸鹽緩衝液（PBS)中，然後將溶液 皮下注射進入正常的BALB/c小白鼠（體重約20g)的側面，待腫瘤體積到達60-70mm 3時， 使用該小白鼠進行試驗。（本段中提到的大約，均指誤差在5%以內）。
[0050] 將12隻小白鼠平均分成對照組和實驗組兩組。向實驗組的6隻小白鼠腫瘤部位注 射30uL, lmg/mL的實施例一中的金銅合金納米晶體。之後，每天用lW/cm2的808nm的雷射 器照射實驗組小鼠腫瘤部位5分鐘，然後將兩組小白鼠正常培養。從實驗組小白鼠中取一 只，拍攝其在第一，四，十六天照片以及對應的腫瘤區域特寫照片，能明顯看見腫瘤的消退， 見附圖5。兩組小白鼠平均腫瘤大小隨時間變化圖見附圖6。
[0051] 實施例5
[0052] 實施例4中腫瘤區域的組織切片。
[0053] 為了得到腫瘤區域的組織，在實驗進行至第四天時每組小白鼠中犧牲三隻。獲得 的腫瘤部位使用10%的中性福馬林溶液進行固定，接著用石蠟進行常規性的處理，切 片5yL，使用蘇木精-伊紅進行染色，之後用光學顯微鏡進行觀察，從緻密核中鬆散的結 構和細胞中能看出腫瘤壞死，光學顯微鏡圖片見附圖7。
[0054] 實施例6
[0055] 小白鼠注射實施例2中的金銅合金納米晶體後重要器官反應。
[0056] 大約5 X 106的4T1乳腺癌細胞溶於60 μ L的磷酸鹽緩衝液（PBS)中，然後將溶液 皮下注射進入正常的BALB/c小白鼠（體重約20g)的側面，待腫瘤體積到達60-70mm 3時， 使用該小白鼠進行試驗。（本段中提到的大約，均指誤差在5%以內）。
[0057] 犧牲一隻小白鼠，採集其心臟、肝、腎、肺、脾、胃以及胰腺這幾個重要器官。向另一 只小白鼠腫瘤部位注射30uL, lmg/mL的實施例一中的金銅合金納米晶體，一天後，也採集 其心臟、肝、腎、肺、脾、胃以及胰腺這幾個重要器官。獲得的重要器官使用10%的中性福爾 馬林溶液進行固定，接著用石蠟進行常規性的處理，切片5 μ L，使用蘇木精-伊紅進行染 色，之後用光學顯微鏡進行觀察，從顯微鏡照片上可以看出這幾個器官沒有病變，光學顯 微鏡圖片見附圖8。
[0058] 實施例7
[0059] 小白鼠靜脈注射修飾過的金銅合金納米晶體後腫瘤區域光熱效應。
[0060] 大約5 X 106的4Τ1乳腺癌細胞溶於60 μ L的磷酸鹽緩衝液（PBS)中，然後將溶液 皮下注射進入正常的BALB/c小白鼠（體重約20g)的側面，待腫瘤體積到達60-70mm 3時， 使用該小白鼠進行試驗。（本段中提到的大約，均指誤差在5%以內）。
[0061] 將之前實施例2中合成出的金銅合金納米晶體加入等質量的聚乙二醇一硫醇，攪 拌過夜以實現表面修飾。
[0062] 將6隻小白鼠平均分成對照組和實驗組兩組。向實驗組的3隻小白鼠尾靜脈 中注射200uL，lmg/mL的上面提及的表面修飾過的金銅合金納米晶體。一天後，用1W/ cm2的808nm的雷射器照射兩組小鼠腫瘤部位6分鐘，用溫度成像分析軟體分析腫瘤區 域的局部溫度隨照射時間的變化，具體結果見附圖9。在實現同等光熱效果的前提下， 其金屬使用量低於最近報導的使用金納米棒做光熱測試的金屬使用量。此處的同等光 熱效果指的是在相同的對照組升溫幅度的光照條件下，實驗組光照升溫也相同。達到此 相同效果需要使用l〇mg/kg體重的聚乙二醇包裹的金銅合金納米晶體，需要使用14mg/ kg體重的聚乙二醇包裹的金納米棒。金納米棒數據參考文獻《美國化學會一納米》.（ACS Nano7. 8089-8097, 2013)。
[0063] 實施例8 :
[0064] 利用200納米的五角星形金銅合金納米晶體光熱殺死肝癌細胞的細胞實驗。
[0065] 為了驗證其他具有光熱轉化能力的金銅合金也可作此種藥物的有效成分，並且此 藥物對其他腫瘤細胞起作用，本發明使用200納米五角星形金銅合金納米晶體對肝癌細胞 進行光熱實驗。
[0066] 在常溫下，依次向20ml的玻璃反應瓶中加入：濃度為lOOmM的CuCl2 ·2Η20水溶液 0. 3mL，濃度為100mM的HAuC14 ·3Η20水溶液0. 3mL，45mg的十六胺，濃度為1Μ的葡萄糖水溶 液0.28mL，4mL去離子水以及一粒磁子。將瓶蓋蓋緊後，放在磁力攪拌器上常溫攪拌過夜。 之後，將其轉移至l〇〇°C的油浴中，加熱並磁力攪拌反應30min，在反應過程中，瓶中溶液顏 色由黃綠色變為深棕色，即得粗產物。取出反應瓶，待其冷卻至室溫後，將瓶中反應液移至 離心管中，10, OOOrpm下離心8min ;在相同條件下，用去離子水和乙醇分別洗滌3次和2次， 以洗掉殘留的反應物、包裹劑十六胺和還原劑葡萄糖。最終可得乾淨的五角星形Au-Cu合 金納米晶體，其中每個顆粒的分枝長度在75-150nm之間，平均尺寸為200nm，這種金銅合金 的透射電鏡圖，紫外可見近紅外消光譜圖見附圖10。
[0067] 在96孔板中使用RPMI1640培養基培養人體肝癌細胞，細胞密度約為每孔內 1 X 105個細胞。在培養18個小時後，培養基換為含有10 μ g/mL的大小為200納米的五角 星形金銅合金的培養基。之後，使用lW/cm2的雷射照射3分鐘和10分鐘以實現殺癌效果。 為了辨別死細胞，我們使用臺盼藍對幾個不同照射時間以及不照射的細胞進行染色，死細 胞會被染成藍色，這樣我們可以得到顯微鏡照片。為了得到細胞死亡率，我們對幾個不同情 況的細胞又進行了標準MTT實驗。以上實驗所得到的顯微鏡照片和細胞死亡率統計圖見附 圖11。（本段中提到的大約，均指誤差在5%以內）。
【權利要求】
1. 藥物組合物，其含有金銅合金納米晶體作為有效成分，以及藥學上可接受的載體。
2. 金銅合金納米晶體在製備治療腫瘤的藥物中的應用。
3. 金銅合金納米晶體在製備治療腫瘤的藥物中的應用，其特徵在於通過所述的金銅合 金納米晶體在近紅外區域有較強的表面等離基元共振峰或者對此區域的光有較強的吸收 值，在700-900nm內具有較強的表面等離基元共振峰的特性使腫瘤部位縮小或消失。
4. 金銅合金納米晶體在製備治療腫瘤的藥物中的應用，其特徵在於所述應用是由金銅 合金納米晶體具有的光熱效應通過近紅外光照射腫瘤部位使其縮小或消失，所述的光熱效 應通過調節金銅合金納米晶體的濃度或近紅外光的照射功率來控制，所述近紅外光的波長 與金銅合金納米晶體的7〇〇 -900nm內的表面等離基元共振峰相對應。
5. 金銅合金納米晶體在製備治療腫瘤的藥物中的應用，其特徵在於所述應用中，金銅 合金納米晶體是被瘤位注射或者被靜脈注射進動物體內，靜脈注射時，該金銅合金納米晶 體被聚乙二醇或以聚乙二醇為重複單元的聚合物包被。
6. 金銅合金納米晶體在製備治療腫瘤的藥物中的應用，其特徵在於所述應用中，金銅 合金納米晶體注射進動物體內，在動物的腫瘤部位聚集，對動物的重要器官不造成損害，通 過使用700-900nm雷射照射腫瘤部位，在該納米晶體作用下腫瘤部位產生局部高溫，造成 腫瘤壞死。
7. 金銅合金納米晶體在製備治療腫瘤的藥物中的應用，其特徵在於所述應用中，金銅 合金納米晶體的施用方法採用腫瘤部位局部注射，或被聚乙二醇或以聚乙二醇為重複單元 的聚合物包被後靜脈注射，或與本領域中已知的靶向脊椎動物腫瘤的靶向遞送載體結合後 局部注射或經靜脈注射。
8. 金銅合金納米晶體在製備治療的藥物中的應用，其特徵在於所述的腫瘤為乳腺癌、 肝癌。
【文檔編號】A61P35/00GK104043124SQ201410318697
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年7月3日 優先權日:2014年7月3日
【發明者】曾傑, 劉剛, 王驍勇, 何嶸, 張卓群, 王佔通, 汪友程 申請人:中國科學技術大學