從刮宮樣品中獲取人宮內膜間充質幹細胞的方法
2023-09-22 14:20:20
專利名稱：從刮宮樣品中獲取人宮內膜間充質幹細胞的方法
技術領域：
本發明屬於幹細胞分離培養及保存相關技術。
背景技術：
幹細胞技術是當今生命科學中最熱門的技術之一，其研究內容幾乎涉及所有生命科學的生物醫學領域，除了在細胞治療、組織/器官移植和基因治療中發揮重要作用外，還在發現新基因、基因功能分析、發育生物學模型及新藥開發等方面產生重要影響。近幾年來，幹細胞的研究取得了重大突破，1999和2000年，世界最權威的美國《kience》雜誌連續2年將幹細胞和人類基因組計劃列為當年的10大科學突破。幹細胞很可能在醫學領域引發革命性進步，因而具有不可估量的醫學價值，幹細胞和人類基因組計劃將同時成為新世紀最具有發展和應用前景的領域。間充質幹細胞(mesenchymal stem cells，簡稱MSCs)是來源於成熟組織中的多能幹細胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，同時又因為其低免疫原性而成為細胞移植和組織工程的新型種子細胞，具有廣闊的應用前景。眾所周知，子宮內膜細胞系具有很強的自我更新能力。自1978年I^ianishnikov 提出存在子宮內膜幹細胞以來，人們一直沒有停止過研究子宮內膜幹細胞的腳步， 1993-2002子宮內膜幹細胞的存在有了臨床實踐的支持，進一步肯定了研究子宮內膜幹細胞的重要性，直到2004年Chan等證實了子宮內膜幹細胞的存在，極大的激發了研究者們的研究熱情。前期子宮內膜幹細胞的研究材料主要是取自體內的子宮內膜組織，既不方便又限制了研究進展。2006年日本研究人員從女性月經血中成功提取出幹細胞，掀起了研究經血來源子宮內膜幹細胞的熱潮。經美日中等多國科學家的研究證實在隨女性經血脫落的子宮內膜組織中，具有相當數量的間充質幹細胞——宮內膜幹細胞，數量為骨髓來源的30 倍；這些幹細胞活力更強，更強的自我更新和增殖能力(如心肌細胞的培育效率為傳統利用骨髓細胞培育的100倍)，分化潛能更接近胚胎幹細胞。有研究發現子宮內膜的再生細胞 (ERC)不僅具有幾乎每M小時複製一次的驚人速率，而且它們產生獨特生長因子的速率， 比來自於臍帶血的幹細胞要大上10萬倍。從人刮宮術獲得的體液(包括血液)中就含有隨之一起刮取得到的子宮內膜組織，上述理論研究使得從該體液中獲取子宮內膜幹細胞成為可能。人流是指用手術的方法終止妊娠，手術方法之一就是鉗刮術，通過刮宮可以在取出少量胚胎組織的同時獲得一定的子宮內膜組織，而隨這些刮取獲得的子宮內膜組織一起獲得的體液便成了獲取宮內膜幹細胞的最好來源。相比而言，因為供體的年齡原因，該幹細胞可能會擁有更強的增殖能力和更好的活力，除此之外，也可以使得原來被丟棄的體液變廢為寶，無論是從研究角度還是供體角度都是有百利而無一害。如果把這些幹細胞通過科學的方法儲存起來，在女性未來的一生中，一旦發生肝硬化、糖尿病、心衰竭、腫瘤等重大疾病或意外嚴重傷害時，就可立即做自體幹細胞的移植，恢復健康，減輕自己及家人的經濟負擔，減輕社會負擔，還有可能實現女性夢寐以求的「青春常在」、「紅顏永駐」的美好願望，擁有高品質的人生。女性的宮內膜幹細胞不但可用於本人，還可為她的子女、相關親屬(如堂表弟妹，甚至父母)等人的臨床應用。由於國內實行獨生子女政策，一旦患血液系統惡性疾病和遺傳性疾病，就只能採用異基因幹細胞移植，宮內膜幹細胞是異基因幹細胞移植最豐富最好的資源。一旦儲存了宮內膜幹細胞，就相當於為其整個家族建立了一個預防和治療腫瘤及其它相關需幹細胞治療疾病的生命銀行。儲存的宮內膜幹細胞還可供全國和全世界患者選擇作幹細胞移植用， 並逐步替代價格昂貴、難以找到配型相合的骨髓幹細胞。全世界等待幹細胞移植的患者數以億計，僅白血病在我國的發病率就達十萬分之三、四，即每年新增四萬名左右的患者，而累計的白血病患者約有四百萬，其中大部分是兒童，他們都急需通過幹細胞移植來救治。
發明內容
本發明的目的在於針對現有幹細胞來源困難或受倫理限制等問題，尋找一種更為高效的來源廣泛且不受倫理限制的宮內膜幹細胞分離和培養方法。在此基礎上，擴增和純化幹細胞，並對所培養的幹細胞進行形態和功能鑑定，從而建立具有幹細胞特性的新型幹細胞株，然後再將優質的幹細胞資源儲存。為了解決上述技術問題，本發明提供一種從刮宮樣品中獲取人宮內膜間充質幹細胞的方法，包括以下步驟1)、樣品收集將人流產物與採集液按照1 0. 9 1. 1的體積比混合；得刮宮樣品；採集液為在每500mL的採集液中含有400單位肝素以及濃度為％ig/mL的環丙沙星和濃度為lOmg/mL的卡那黴素，其餘為DMEM培養基Gnvitrogen公司)；2)、宮內膜幹細胞分離培養A、樣本的初處理將刮宮樣品於3 5°C進行搖床孵育22 沈小時，然後進行過濾(過濾目的是為了濾除刮宮樣品中的絨毛和蛻膜、胚胎組織)；得濾液；B、利用密度梯度離心法，收集血液中的碎片組織及單核細胞，依次進行以下步驟濾液1500 2500g離心8 12分鐘，分別得位於上層的上清和位於下層的血液；取部分上清用於病毒檢測，如病毒檢測為陽性，則結束整個操作；如病毒檢測為陰性，則繼續進行以下操作去除其餘上清後，得血液；用PBS緩衝液稀釋血液，PBS緩衝液與血液的體積用量比為1. 5 2. 5 1 ；將稀釋後的血液加至人淋巴細胞分離液(市購產品)上，稀釋後的血液和分離液的體積比為1.8 2. 2 1，600 IOOOg離心12 18分鐘，離心完畢後，離心管內出現明顯的分層；吸出位於中間的單核細胞層(白膜層)，用PBS緩衝液洗滌細胞後離心(洗滌2 次，每次均是400g離心10分鐘)，最後用Chang完全培養基製成單細胞懸液；C、細胞的培養將上述步驟所得的單細胞懸液接種於Chang完全培養基中，細胞接種密度為 IXlO5 lX106/ml，置於37°C、飽和溼度、體積分數為5%的(X)2培養箱中進行培養；培養時間為4 5天；Chang完全培養基由以下成分組成65ml的MEM alpha (MEM-alpha培養基， Invitrogen ^w]), 18ml ^ Chang B ( ) (Irvine Scientific ^w]) ,2ml ^ Chang 0( 液)(Irvine Scientific 公司)Uml 的 Penicillin/Str印tomycin (青黴素 / 鏈黴素硫酸鹽，Invitrogen 公司)、Iml 的 L-glutamine (L-穀氨醯胺，Invitrogen 公司，濃度為 200mM) 和15ml的ES-FBS (胎牛血清，Invitrogen公司)；D、細胞擴增和純化待步驟幻的4 5天的培養結束後，更換培養基，棄除未貼壁細胞；根據細胞生長狀況，每3 4天全量換液一次，待細胞生長達到80% 90%融合時，用重量百分含量為 0. 25%的胰蛋白酶消化收集細胞，然後按5000 6000個/cm2密度傳代接種培養，並記為 Pi代；上述過程在37°C、飽和溼度、體積分數為5%的CO2培養箱中進行；3)、細胞凍存待上述步驟所得的Pl代細胞鋪滿瓶底後，用重量百分含量為0.25%的胰蛋白酶消化收集細胞，用預冷的凍存液重懸細胞，得細胞懸液，細胞懸液中細胞的濃度是1 2*106/ml ；並分裝於4支2ml凍存管中；凍存液為DMSO (Calbiochem公司)與Chang完全培養基按照19的體積比混合而得；將上述細胞懸液進行如下凍存程序(即，將上述4支凍存管放入程控降溫儀進行預冷，開始凍存程序)第一步、4°C，等待(即溫度降至4°C後，進入第二步)；第二步、1. O0C /分鐘降至-3. O0C (箱體)；第三步、10. O0C /分鐘降至-20. O0C (箱體)；第四步、1. 0°C /分鐘降至-40. 0°C (箱體)；第五步、10. O0C /分鐘降至-90. O0C (箱體)；第六步結束；得凍存樣本；將所述凍存樣本放入液氮儲存罐保存。在本發明中，經過培養貼壁生長的部分為目標細胞。現在世界上大部分幹細胞庫的做法是從人體取得幹細胞(或混有幹細胞的其他組織，人臍帶、羊水、外周血等)後，稍加分離即進行凍存，等到需要時再將凍存的細胞復甦、培養增殖。本發明的優越之處在於從刮宮樣品中取得體液標本後，經過密度梯度分離後，去除大部分紅細胞，再進行純化擴增培養，獲得純度較高、數量較大的目標細胞即宮內膜幹細胞(人宮內膜間充質幹細胞)，再進行凍存，這樣就保證了凍存細胞的質量，且以後需要用到該份細胞，復甦後的培養時間也較其他方法短得多(圖2復甦細胞的生長曲線，顯示細胞的增殖能力)。本發明的優越之處在於幹細胞資源來自刮宮術後廢棄的體液，採集方便，變廢為寶，其所含幹細胞含量豐富，增殖較快；通過高效的分離方法能夠保證被儲存的幹細胞的質
So在現有技術中，蛻膜組織和子宮內膜活檢組織中分離得到幹細胞沒有進行嚴格的間充質幹細胞鑑定。特別是子宮內膜活檢時，一般是在進行常規例行病理診斷時順便獲得樣品。而本發明所採用的是刮宮的方法，從刮宮的體液中分離宮內膜幹細胞，進過包括微生物的清除、幹細胞鑑定，培養、擴增和儲存等技術。在目前還沒有人報導。與從經血中分離宮內膜幹細胞相比，減少了微生物汙染的可能性，因為刮宮是在無菌的環境下進行的，由此所獲得的細胞活力更高。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是實施例1中培養不同時間的宮內膜幹細胞放大100倍的顯微照片；A 為 PO 代換液 4 天，100X ；B 為 Pl 代 3 天，100X ；C 為 P2 代 3 天，100X ；D 為 P7 代 3 天，100X ；E 為 P22 代 3 天，100X ；圖2復甦細胞生長曲線；圖3是實施例1中流式細胞分析結果圖。
具體實施例方式實施例1 通過刮宮術培養獲取人宮內膜幹細胞的分離、培養、擴增及凍存、復甦1)、準備採集套裝和配製培養基負壓採集瓶(無菌)。採集液在2000mg的環丙沙星、5000mg的卡那黴素和400單位肝素中添加DMEM基礎培養基(即DMEM培養基)，直至定容至500ml，得採集液。S卩，該500ml採集液中含有400單位肝素以及濃度為％ig/mL的環丙沙星和濃度為 10mg/mL的卡那黴素。使用前，該採集液於2 4°C環境下存放。配製Chang完全培養基在無菌條件下，在無菌容器中加入65mL MEM-alpha 培養基(MEM alpha, Invitrogen 公司)、18mL Chang B 基液(Irvine Scientific 公司)、2mL Chang C基液(Irvine kientific公司)、ImL青黴素硫酸鹽或者鏈黴素硫酸鹽(Penicillin/Sti^ptomycin，Invitrogen 公司)、lmL 濃度為 200mM 的 L-穀氨醯胺 (L-glutamine, Invitrogen 公司)、15mL ES-FBS (胎牛血清，Invitrogen 公司)，充分混勻， 置4°C冰箱待用。2)、樣品採集在志願者02歲，已籤訂知情同意書)術前1個小時到達手術室。手術開始前1 分鐘，將負壓採集瓶放至負壓吸引器合適的位置。在嚴格消毒和無痛麻醉下，利用負壓吸引管吸引子宮腔內的胎物至負壓採集瓶中，再用刮匙清理宮腔並進行收集，即，吸出物是由絨毛、蛻膜、子宮內膜組織碎片、胚胎組織和一定量的體液(血液)等組成，以此作為人流產物，此為常規技術。待手術結束後，加等體積的採集液至負壓採集瓶中(即將人流產物與採集液按照1 1的體積比混合，得刮宮樣品)，保持低溫狀態(4-10°C )儘快送至實驗室。刮宮樣品送至實驗室後，將負壓採集瓶中的刮宮樣品轉移至新的50ml離心管中， 放入搖床孵育，溫度設置為4°C。3)、病毒和無菌檢查待刮宮樣品搖床孵育滿24h後，將孵育所得的刮宮樣品先進行過濾，以濾除絨毛、 蛻膜、胚胎組織，並將過濾過所得物混勻；2000g離心10分鐘；分別得位於上層的上清和位於下層的血液；取所得的部分上清液按照血培養法進行厭氧菌和需氧菌、黴菌檢查，並鑑定，若為陽性結果，則結束整個儲存宮內膜幹細胞的程序；同時，取所得的部分上清液通過ELASA進行病毒檢測，檢測範圍包括HBsAg、HBcAb、HCVAb、HIV-A、TP-PA、CMV-IgM，若為陽性結果，則結束整個儲存宮內膜幹細胞的程序。取位於下層的血液進入以下步驟進行分離培養。即，進行病毒、無菌檢查和進行血液分離培養為同時分別進行，由於病毒和無菌檢查需要一定的時間，如果陽性結果，則無需繼續進行對血液的分離培養。4)、宮內膜幹細胞分離培養將上述位於下層的血液(即將上述2000g離心10分鐘所得物去除所有的上清後)，利用密度梯度離心分離子宮碎片組織及單核細胞，具體如下首先用PBS緩衝液按一定比例(PBS緩衝液與血液的體積比為2 1)稀釋血液細胞，電動移液器吹打混勻；得稀釋後血液；在超淨工作檯中取乾淨離心管，轉移15mL人淋巴細胞分離液至每根50ml離心管中；鋪層加樣將稀釋後的血液小心的加至已倒好的人淋巴細胞分離液上(加樣時動作要輕柔，避免衝散分層液面或與分層液面混合而影響分離效果)，稀釋後血液和人淋巴細胞分離液的體積比為2 1 ；配平離心管，800g離心15分鐘，離心機升降速要調至最低速擋，確保離心穩定，分層清晰；提取單個核細胞離心完畢後，離心管內出現明顯的分層，由下到上依次為紅細胞層、粒細胞層、分離液層、單核細胞(MNC)層和血漿層；吸出單核細胞層(可見部分碎片組織)把吸管或移液管直接伸入單核細胞層，先吸該層中央部分細胞，再吸取四周細胞，動作要輕柔，保證不把該層細胞吹散。如果分離液層和MNC層呈乳白色，界面不清楚，提示含有較多單核細胞，酌情吸取分離液層，速度要緩慢，確保不吸取到紅細胞層；洗滌細胞吸出的單核細胞混有部分細胞分離液，需用PBS緩衝液加以洗滌；用電動移液器加PBS緩衝液將細胞稀釋兩倍以上，混勻，400g離心10分鐘；離心完畢後，小心取出離心管，去除上清；重複上述步驟一次；細胞計數將以上所得細胞充分混勻，用臺盤藍染色，計數活細胞；接種細胞根據細胞計數結果，調整細胞密度至2*105/ml接種於75cm2培養瓶內(內裝IOml的Chang完全培養基)。當然，接種時的細胞密度可採用l*105_l*106/ml。 Chang完全培養基的體積比為=Vmem
alpha * ^Chang B * ^Chang C * ^Penicillin/Streptomycin * ^L-glutamine200,1 VES_FBS = 65 18 2 1 1 15 (具體如步驟1)中的配製Chang完全培養基所述)O5)細胞擴增和純化細胞培養於75cm2培養瓶中(內設含有密度為2*105/ml細胞的Chang完全培養基10ml)，置於培養箱內，瓶蓋擰松半圈，確保瓶內空氣與培養箱內空氣相通，保持培養箱 37 °C、飽和溼度、CO2體積濃度5%的狀態開始培養。4天後，從(X)2培養箱中取出細胞培養瓶，在無菌條件下去除瓶中的培養基，棄除未貼壁細胞，添加IOmL Chang完全培養基到培養瓶中，再次放入CO2培養箱培養，根據細胞生長情況，每3-4天全量換液一次(即全量更換Chang完全培養基一次)。待細胞達到 80%-90%融合時，在每個培養瓶中加入ImLO. 25% (質量濃度)的胰蛋白酶消化，水平方向輕輕搖晃，使胰酶鋪滿平底，作用1分鐘後，倒置顯微鏡下觀察消化效果，待大部分細胞 (即80 % 90 % )縮至圓形後，再加入IOmL Chang完全培養基終止消化；然後按5000-6000 個/cm2密度傳代接種培養，並記為Pl代。傳代培養過程中，根據細胞生長情況，每3-4天進行全量或半量換液，直至細胞再次達到融合(即細胞達到80% -90%融合時)，細胞鋪滿瓶底，重複以上操作進行傳代，記為 P2代，依此操作進行傳代。細胞原代培養3-4天全量換液後，去除未貼壁細胞，鏡下觀察，可見較多幾個細胞聚集在一起的克隆，細胞增殖迅速，其倍增時間大約為M-36小時，2天後細胞形態呈均勻長梭形，培養4-5天後細胞可達到80% -90%融合，細胞呈漩渦狀分布。傳代後細胞M小時內完全貼壁，3-4天可鋪滿瓶底，繼續傳代。圖1顯示了培養傳代過程中的細胞形態圖A原代培養4天，換液後2天的細胞形態圖，可見細胞形態較多，有圓形、多角形、梭形等，此時細胞較雜；B是Pl代細胞傳代後3 天的圖，細胞形態趨於一致；C是P2代細胞傳代後3天的圖，D是P7代細胞傳代後3天的圖， 細胞呈漩渦狀排列，此時細胞純度較高；E是P22代細胞傳代後3天的圖，細胞密度較低，增殖速度開始減慢。以上結果說明，從細胞形態來看，本發明分離培養的細胞符合幹細胞的特點，細胞的增殖能力較強，本發明中細胞可傳代至30代左右。6)、細胞凍存選擇Pl代細胞進行凍存，既保證了凍存時細胞的原始狀態，也能夠使細胞擴增到
足夠數量級。每個試管內裝含有密度為1 2*106/ml的Pl代細胞1ml。具體為在上述步驟幻中，待Pl代細胞生長至融合80% -90%後，用Iml質量濃度為0. 25%的胰蛋白酶消化收集細胞。用少量Chang完全培養基重懸細胞，臺盤藍染色，計算細胞數量和細胞活率，確定細胞活率在80 %以上，用Chang完全培養基調整細胞密度為 2-4*106/ml，加入等體積預冷)的2倍濃度的凍存液(20% DMS0)；然後分裝於2ml的凍存管中。採用的凍存液終濃度是含有lO^DMSCKcalbiochem公司)的Chang完全培養基 (即，凍存液為DMSO與Chang完全培養基按照1 9的體積比混合而得)；S卩，凍存前細胞的終濃度為l-2*106/ml。將凍存管放入程控降溫儀進行預冷，開始凍存程序。凍存程序設置如下
第一步4°C，等待(即溫度降至4°C後，進入第二步)；第二步1. O0C /分鐘降至-3. O0C (箱體)；第三步10. O0C /分鐘降至-20. O0C (箱體)；第四步1 · 0°C /分鐘降至-40. 0°C (箱體)；第五步10. O0C /分鐘降至-90. O0C (箱體)；第六步結束；取出凍存樣本，放入液氮儲存罐(即為-196°C )長期保存。實施例2、細胞復甦培養將上述實施例1所得的凍存的樣本從液氮儲存罐中取出，立即放入37°C水浴中解凍。當觀察到凍存管內的冰核只有黃豆大小的時候，將凍存管取出，立刻放入冰水混合物中。在無菌條件下，將凍存管中樣本輕柔吸出，加入一支50mL無菌離心管中，再立即加入 IOmL的Chang完全培養基，充分混勻洗滌，在4°C、IOOOrpm的條件下離心10分鐘，去除管中上清。重複操作一次。用臺盤藍進行細胞計數及活率分析。按照10000個/cm2的密度(利用Chang完全培養基)將細胞接種到75cm2培養瓶中，放入37°C、飽和溼度、體積分數為5 % 的(X)2培養箱培養。根據細胞生長情況，每3-4天全量換液一次，待細胞達到80% -90%融合時，用濃度為0. 25%的胰蛋白酶消化，以5000-6000個/cm2密度傳代，復甦後細胞形態正常，增殖速度沒有改變，傳代至30代左右，細胞出現老化現象，從圖2復甦細胞的生長曲線看出，細胞的倍增時間保持在M-36小時。實施例3.流式細胞檢測選擇實施例1中所得培養P5代的宮內膜間充質幹細胞按如下步驟進行流式檢測。每個試管內裝有濃度為5*106/ml的P5代細胞&ι1。1)細胞懸液製備用Iml的0. 25% (質量濃度)的胰酶將細胞消化下來，500rpm，5min離心，棄上清。 加PBS洗2遍，然後aiil PBS重懸細胞，從而使細胞濃度為5*106/ml。2) 4%多聚甲醛(PBS配製)固定15min，然後PBS洗2遍(1500rpm，離心5min)。3)5%的85六固定40111土11。4)根據流式抗體(直標)稀釋度要求每IO6個細胞/200ul分別加入20ul抗體 (CD29、CD45、CD105、CD117、CD90、CD34、CD73、CD44、HLA-DR)，避光，37°C 孵育 30min。5)用PBS洗一遍，1500rpm，離心5min，棄上清，再加入500ul PBS重懸，準備上機檢測。6)流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司，型號FC-500。所用抗體來自於貝克頓迪肯森公司(Becton，Dickinson & Company，富蘭克林湖，NJ)。根據檢測的幹細胞大小特點利用前向散射光(FS)、側向散射光(SS)找到目標細胞群。根據所選擇的抗體的螢光素標記選擇流式檢測通道，對目標細胞的螢光強弱進行分析，計算出細胞表面標記分子的陽性百分比。具體如圖3所示。從以上實施例可見本發明方法可以成功從女性經血樣品中分離獲得人宮內膜幹細胞，細胞經過擴增和純化培養可培養至20代；細胞經過凍存後能夠復甦繼續傳代培養， 保持幹細胞形態。經過流式細胞檢測，復甦細胞表達⑶29、⑶105、⑶90、⑶73、⑶44，不表達⑶34、⑶117、⑶45、HLA(DR-DP-DQ)。表明本發明能夠建立人宮內膜幹細胞株，本發明的人宮內膜幹細胞儲存方法實際可行，並具有其他細胞庫儲存方法不具備的優點。
最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
1.從刮宮樣品中獲取人宮內膜間充質幹細胞的方法，其特徵是包括以下步驟1)、樣品收集將人流產物與採集液按照1 0. 9 1. 1的體積比混合；得刮宮樣品； 所述採集液為在每500mL的採集液中含有400單位肝素以及濃度為％ig/mL的環丙沙星和濃度為lOmg/mL的卡那黴素，其餘為DMEM培養基；2)、宮內膜幹細胞分離培養A、樣本的初處理將刮宮樣品於3 5°C進行搖床孵育22 沈小時，然後進行過濾；得濾液；B、利用密度梯度離心法，收集血液中的碎片組織及單核細胞，依次進行以下步驟 濾液1500 2500g離心8 12分鐘，分別得位於上層的上清和位於下層的血液；取部分上清用於病毒檢測，如病毒檢測為陽性，則結束整個操作；如病毒檢測為陰性， 則繼續進行以下操作用PBS緩衝液稀釋血液，所述PBS緩衝液與血液的體積用量比為1. 5 2. 5 1 ； 將稀釋後的血液加至人淋巴細胞分離液上，所述稀釋後的血液和人淋巴細胞分離液的體積比為1.8 2. 2 1，600 IOOOg離心12 18分鐘，離心完畢後，離心管內出現明顯的分層；吸出位於中間的單核細胞層，用PBS緩衝液洗滌細胞後離心，最後用Chang完全培養基製成單細胞懸液；C、細胞的培養將上述步驟所得的單細胞懸液接種於Chang完全培養基中，細胞接種密度為1 X IO5 1 X 106/ml，置於37°C、飽和溼度、體積分數為5%的(X)2培養箱中進行培養；培養時間為4 5天；所述Chang完全培養基由以下成分組成65ml的MEM alpha培養基、18ml的Chang B、 2ml 的 Chang C、Iml 的 Penicillin/StreptomycinUml 的濃度為 200mM 的 L-glutamine 禾口 15ml 的 ES-FBS ；D、細胞擴增和純化待步驟幻的4 5天的培養結束後，更換培養基，棄除未貼壁細胞；每3 4天全量換液一次，待細胞生長達到80% 90%融合時，用重量百分含量為0. 25%的胰蛋白酶消化收集細胞，然後按5000 6000個/cm2密度傳代接種培養，並記為Pl代； 上述過程在37°C、飽和溼度、體積分數為5%的(X)2培養箱中進行；3)、細胞凍存待上述步驟所得的Pl代細胞鋪滿瓶底後，用重量百分含量為0. 25%的胰蛋白酶消化收集細胞，用預冷的凍存液重懸細胞，得細胞懸液，所述細胞懸液中細胞的濃度是1_2*106/ ml ；所述凍存液為DMSO與Chang完全培養基按照1 9的體積比混合而得； 將上述細胞懸液進行如下凍存程序 第一步、4°C，等待； 第二步、1. O0C /分鐘降至-3. O0C ； 第三步、10. O0C /分鐘降至-20. O0C ； 第四步、1. O0C /分鐘降至-40. O0C ； 第五步、10. O0C /分鐘降至-90. O0C ；第六步結束；得凍存樣本； 將所述凍存樣本放入液氮儲存罐保存。
全文摘要
本發明公開了一種從刮宮樣品中獲取人宮內膜間充質幹細胞的方法，包括以下步驟1)將人流產物與採集液按照1∶0.9～1.1的體積比混合；得刮宮樣品；2)宮內膜幹細胞分離培養將刮宮樣品經搖床孵育後，過濾；得濾液；然後利用密度梯度離心法，收集血液中的碎片組織及單核細胞；接著進行細胞的培養以及細胞擴增和純化；3)待上述步驟所得的P1代細胞鋪滿瓶底後，用胰蛋白酶消化收集細胞，用預冷的凍存液重懸細胞，得細胞懸液，將上述細胞懸液進行凍存，將所得的凍存樣本放入液氮儲存罐保存。採用本發明的方法能獲得純度較高、數量較大的目標細胞即宮內膜幹細胞。
文檔編號C12N5/0775GK102296048SQ20111024793
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月24日 優先權日2011年8月24日
發明者項春生 申請人:杭州易文賽生物技術有限公司