一種液固雙重發酵製備高密度微生態製劑的方法
2023-09-22 05:25:45
專利名稱：一種液固雙重發酵製備高密度微生態製劑的方法
技術領域：
本發明屬於生物工程製備技術領域，涉及一種通過液態發酵和固態發酵製備高濃度枯草芽胞桿菌固態微生態製劑的工藝，特別是一種液固雙重發酵製備高密度微生態製劑的方法。
背景技術：
動物微生態學是近20年來發展起來的新興學科，它是研究正常微生物與動物體內環境，動物體與外界環境和正常微生物之間三者的相互關係，以動物體內微生態的平衡與失調等理論為核心的，具有細胞學水平和分子水平的生命科學，微生物作為活菌飼料添加劑是微生態學的又一發展，有關飼料行業的專家和營養學專家定義為微生態飼料添加劑是用已知有益的微生物經培養、發酵、乾燥等特殊工藝製成的對人、畜安全有益的活菌制齊U，並用於飼料的添加劑，一般簡稱為微生態製劑，或簡稱為微生態，目前市售的微生態制 劑有液態和固態兩種。中國農業部於1999年6月公布了 12種可直接飼餵動物的飼料級微生物菌種，枯草芽胞桿菌是其中之一。微生態製劑的質量標準通常是以單位重量g或體積ml中活菌的數量來確定，有關具體的含量數量，除光合細菌外，其他益生菌均無部頒標準，一般只有企業標準，通常認為菌數越高，質量越好。現有的固態微生態製劑特別是枯草芽胞桿菌固態微生態製劑的方法通常有兩種工藝技術方案，一種是先進行液態深層發酵，最後加入固態載體吸附，乾燥而成；而液態發酵培養雖可得到較純菌體，但成本高，發酵易受產物反饋控制，難以得到高濃度菌株，所以該方法有效菌數含量較低；另一種是常規固態發酵的模式；但現有的這些技術工藝方法普遍存在著工藝步驟複雜，製備成本高，產品收率低、雜菌含量高等缺點。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術存在的缺點，尋求設計一種製備高濃度枯草芽胞桿菌固態微生態製劑的方法，先對枯草芽孢桿菌進行液態發酵至對數生長期，再配用同重量的固體發酵基質相混合，實現大劑量菌液接種，然後再次進行固體發酵而製得高濃度菌體製劑，稱之為液固雙重發酵法；枯草芽胞桿菌從海參腸道和周圍生活環境中分離的在體外對海參腐皮綜合症致病菌有拮抗作用的土著菌株，對海參腐皮綜合症有針對性的作用，其應用有著非常廣闊的市場。為了實現上述目的，本發明的主體工藝步驟包括液體菌液的培養、固體基料的配製和固體基料與液體菌液的混勻三個功能性過程，其具體工藝步驟包括(I)平板培養枯草保存菌種劃線接種至平板培養基，其培養基配料為大豆蛋白腖3g, NaC120g,葡萄糖2. 5g,磷酸氫二鉀2. 5g,胰蛋白腖17g,瓊脂15g,蒸懼水1000ml, pH值為 7，121°C滅菌，37°C培養 24h ；(2)試管接種取生長良好、菌落典型的菌株接種10ml，其培養基配料為大豆蛋白腖3g，NaC120g，葡萄糖2. 5g，磷酸氫二鉀2. 5g，胰蛋白腖17g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH值為7，121°C滅菌，37°C培養40h ；(3)三角瓶接種100ml，其培養基同步驟(2)，121°C滅菌，37°C培養36h ;(4)三角瓶接種1000ml，其培養基同步驟(3)；(5) IOL種子發酵罐，培養液7. 5L，培養基同步驟(3)，pH值為7，121°C滅菌30分鐘，培養溫度為37°C，時間為24h，轉速150r/min，通氣量O. 4vvm,指每分鐘通入單位發酵體積m3的空氣體積m3 ；(6) 100L種子發酵罐，培養液75L，培養基按葡萄糖I. 5g，豆柏粉3g，澱粉lg，30. 8mg/L的硫酸錳lg，磷酸氫二鉀3g，磷酸二氫鉀I. 5g，硫酸鎂O. 5g,酵母膏O. 2g，氯化鈉20g，水IOOOml的比例配製，按步驟(5)方法培養；(7) 2000L發酵罐，培養液為1500L，培養基同步驟(6)，發酵方法同步驟(5)，培養36h ;得發酵液 (8)選擇固體基質為豆柏粉1000kg，蒸煮滅菌，待冷卻至35°C時，加入步驟(7)中的發酵液900kg，固體基質重量與液體發酵液重量比為I :1，攪拌均勻後裝盤，入無菌培養室，恆溫40°C，通風，淺盤發酵36小時，中間翻料3次，發酵結束後提高溫度至60°C，加大風量，乾燥，粉碎即得產品高密度微生態製劑。本發明與現有技術相比，其製備工藝簡單並易於控制，不易染雜菌，菌株濃度高，後加工成本低，生產環境友好。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步說明。實施例I :製備IOOkg枯草芽胞桿菌微生態製劑(I)菌種平板培養枯草菌保存菌，劃線平板培養，平板培養基；大豆蛋白腖3g，NaC120g，葡萄糖2. 5g，磷酸氫二鉀2. 5g，胰蛋白腖17g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH值為7，121°C滅菌，37°C培養 24h ；(2)試管接種菌液10ml，培養基配製大豆蛋白腖3g，NaC120g，葡萄糖2. 5g，磷酸氫二鉀2. 5g，胰蛋白腖17g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH值為7，121°C滅菌，37°C培養40h ；(3)三角瓶接種100ml，培養基及培養方法按照步驟(2)進行；(4)三角瓶接種IOOOmL,培養基及培養方法按照步驟(3)進行；(5)接種IOL種子發酵罐，培養液為7. 5L，培養基同步驟(4)，pH值為7，121。。滅菌，等溫度降至37°C後接種菌種，培養溫度37°C，時間24h，轉速為150r/min，通氣量為
O.4vvm ；(6) 200L種子發酵罐，接種發酵液100L，培養基按葡萄糖I. 5g，豆柏粉3g，澱粉Ig, 30. 8mg/L的硫酸猛Ig,磷酸氫二鉀3g,磷酸二氫鉀I. 5g,硫酸鎂O. 5g,酵母膏O. 2g,氯化鈉20g,水IOOOml的配比配製，121°C滅菌30min,通氣量O. 4vvm,轉速150r/min,溫度37°C，時間24h ;培養製得液體發酵液；(7)固體基料豆柏粉100kg，通蒸汽，121°C滅菌30min，冷卻至35°C;固體基質重量與液體發酵液重量比為I :1，攪拌均勻後裝盤，入無菌培養室，恆溫40°c，通風，淺盤發酵36小時，中間翻料3次，發酵結束後提高溫度至60°C，加大風量，乾燥，粉碎即得枯草芽胞桿菌固態微生態製劑100kg，測得活菌濃度I. 8X109cfu/g。
實施例2 :培養5噸枯草芽胞桿菌固態微生態製劑(I)菌種平板培養枯草芽孢桿菌劃線接種至平板培養基，其培養基配方為大豆蛋白腖3g，NaC120g，葡萄糖2. 5g，磷酸氫二鉀2. 5g，胰蛋白腖17g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH值為7，121°C滅菌，37°C培養24h ；(2)試管接種菌液10ml，培養基配製大豆蛋白腖3g，NaC120g，葡萄糖2. 5g，磷酸氫二鉀2. 5g，胰蛋白腖17g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH值為7，121°C滅菌，37°C培養40h ；(3)接種三角瓶100ml，培養基及培養方法按照步驟(2)進行；(4)接種三角瓶IOOOmL,培養基及培養方法按照步驟(3)進行；(5)接種IOL種子發酵罐，培養液為7. 5L，培養基同步驟(4)，pH值為7，121。。 滅菌，等溫度降至37°C後接種菌種，培養溫度37°C，時間24h，轉速為150r/min，通氣量為
O.4vvm ；(6)100L種子發酵罐，接種發酵液75L，培養基按葡萄糖I. 5g，豆柏粉3g，澱粉lg，30. 8mg/L的硫酸錳lg，磷酸氫二鉀3g，磷酸二氫鉀I. 5g，硫酸鎂O. 5g，酵母膏O. 2g，氯化鈉20g，水IOOOml的配比配製，121°C滅菌30min，通氣量O. 4vvm,轉速150r/min，溫度37°C，時間24h ;培養製得液體菌液；(7)10噸發酵罐，接種發酵液為5噸，培養基按葡萄糖I. 5g，豆柏粉3g，澱粉lg，30. 8mg/L的硫酸錳lg，磷酸氫二鉀3g，磷酸二氫鉀I. 5g，硫酸鎂O. 5g，酵母膏O. 2g，氯化鈉20g，水IOOOml的配比配製，121°C滅菌30min，通氣量O. 4vvm,轉速150r/min，溫度37°C，時間24h ;培養製得液體菌液；(8)固體基料豆柏粉5噸，通蒸汽，121°C滅菌30min，冷卻至35°C ;固體基質重量與液體發酵液重量比約為I :1，攪拌均勻後裝盤，入無菌培養室，恆溫40°C，通風，淺盤發酵36小時，中間翻料3次，發酵結束後提高溫度至60°C，加大風量，乾燥，粉碎即得枯草芽胞桿菌固態微生態製劑100kg，測得活菌濃度I. 7X109cfu/g。
權利要求
1.一種液固雙重發酵製備高密度微生態製劑的方法，其特徵在於包括液體菌液的培養、固體基料的配製和固體基料與液體菌液的混勻三個功能性過程，其具體工藝步驟包括 (1)平板培養枯草保存菌種劃線接種至平板培養基，其培養基配料為大豆蛋白腖3g，NaC120g,葡萄糖2. 5g，磷酸氫二鉀2. 5g，胰蛋白腖17g，瓊脂15g，蒸餾水IOOOml，pH值為7，121°C滅菌，37°C培養 24h ； (2)試管接種取生長良好、菌落典型的菌株接種10ml，其培養基配料為大豆蛋白腖3g, NaC120g,葡萄糖2. 5g,磷酸氫二鉀2. 5g,胰蛋白腖17g,瓊脂15g,蒸懼水1000ml, pH值為 7，121°C滅菌，37°C培養 40h ； (3)三角瓶接種100ml，其培養基同步驟(2)，121°C滅菌，37°C培養36h； (4)三角瓶接種1000ml，其培養基同步驟(3)； (5 ) IOL種子發酵罐，培養液7. 5L，培養基同步驟(3 )，pH值為7，121°C滅菌30分鐘，培養溫度為37°C,時間為24h,轉速150r/min,通氣量O. 4vvm,指每分鐘通入單位發酵體積m3的空氣體積m3 ； (6)100L種子發酵罐，培養液75L，培養基按葡萄糖1.58，豆柏粉38，澱粉lg，30. 8mg/L的硫酸錳lg，磷酸氫二鉀3g，磷酸二氫鉀I. 5g，硫酸鎂O. 5g,酵母膏O. 2g，氯化鈉20g，水IOOOml的比例配製，按步驟(5)方法培養； (7 ) 2000L發酵罐，培養液為1500L，培養基同步驟(6 )，發酵方法同步驟(5 )，培養36h ；得發酵液 (8)選擇固體基質為豆柏粉1000kg，蒸煮滅菌，待冷卻至35°C時，加入步驟(7)中的發酵液900kg，固體基質重量與液體發酵液重量比為I :1，攪拌均勻後裝盤，入無菌培養室，恆溫40°C，通風，淺盤發酵36小時，中間翻料3次，發酵結束後提高溫度至60°C，加大風量，乾燥，粉碎即得產品高密度微生態製劑。
全文摘要
本發明屬於生物工程製備技術領域，涉及一種液固雙重發酵製備高密度微生態製劑的方法，包括液體菌液的培養、固體基料的配製和固體基料與液體菌液的混勻三個功能性過程，先對枯草芽孢桿菌進行液態發酵至對數生長期，再配用同重量的固體發酵基質相混合，實現大劑量菌液接種，然後再次進行固體發酵而製得高濃度菌體製劑，稱之為液固雙重發酵法；枯草芽胞桿菌從海參腸道和周圍生活環境中分離的在體外對海參腐皮綜合症致病菌有拮抗作用的土著菌株，對海參腐皮綜合症有針對性的作用，其應用有著非常廣闊的市場；其製備工藝簡單並易於控制，不易染雜菌，菌株濃度高，加工成本低，生產環境友好。
文檔編號C12N1/20GK102823716SQ20121033128
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月9日 優先權日2012年9月9日
發明者張 浩, 李超, 徐權漢, 夏偉 申請人:青島中仁藥業有限公司