修飾的人類U1snRNA分子、編碼修飾的人類U1snRNA分子的基因、包括該基因的表達載體及其在基因治療中的用途的製造方法與工藝

2023-09-22 21:31:55 2

本發明涉及修飾的人類snRNA分子（下文定名為外顯子特異性U1——ExSpeU1），其適宜在基因治療方法中使用。具體地，本發明涉及能夠糾正由基因突變導致的並與通常非常嚴重的具有不同病史的人類疾病相關的異常剪接過程的snRNA分子。

背景技術：
許多人類遺傳疾病（約15%）由基因突變導致，其通過幹擾正確的信使RNA細胞內成熟，損害隨後準確的蛋白生物合成並誘導無功能的蛋白的合成而引起疾病。通常，造成剪接缺陷的點突變涉及對負責加工初級轉錄物的機器識別該初級轉錄物關鍵的基因序列。位於外顯子-內含子交界處的供體和受體位點，以及外顯子或內含子中的基因特異性調控元件（CartegniL等人,2002；Pagani等人,2004）是其中最重要的序列。這些突變的結果可能引起多種分子事件，其最頻繁地與將一個外顯子排除在成熟轉錄物之外有關，即所謂的外顯子遺漏（exonskipping）。信使RNA的加工中的分子改變是長久已知的，其涉及例如外顯子遺漏，代表多種人類疾病的主要發病機制，所述多種人類疾病其中的乙型血友病、囊性纖維化和脊髓型肌萎縮，其臨床過程的嚴重度一致。不同類型的突變可誘導外顯子遺漏和在供體位點（或5』剪接位點）中特異性的突變，在受體位點（3』剪接位點）中的突變，或外顯子突變。作為引起外顯子遺漏的不同類型的突變的例子，以下為所描述的人類疾病的三種模型。凝血因子IX（FIX）中的缺陷是乙型血友病發病的原因，該病伴隨不同程度的出血表現，有時非常嚴重並使人病廢。在一些情況下，該病由剪接缺陷所導致。具體地，在剪接過程中，外顯子5被排除出mRNA排除由因子IX基因（F9）的外顯子5供體位點中的位置-2處的突變和受體位點中的多嘧啶序列中的位置-8和-9處的突變兩者所導致。目前乙型血友病治療主要基於重組外源性FIX或直接取自血漿的FIX的頻繁輸注，其局限加強了研究以更高效力和長期效果為特徵的替代方法的需要。囊性纖維化（CF）在高加索人群中是最頻繁致死的先天性遺傳病：2500-2700個出生存活嬰兒中就有一個新生兒罹患該病。該病的病理發生續發於定名為CFTR（囊性纖維化跨膜傳導調節因子）的蛋白的異常，該蛋白位於上皮細胞的頂膜並具有調節水電解質交換的功能。作為CFTR改變的結果，鹽通過細胞膜的傳遞被抑制，主要導致可定義為「脫水的」分泌物的產生：非常富集鈉和氯的汗液與傾向於堵塞導管的濃密和粘稠的粘液，損害了多種器官和系統的功能。在一些研究的過程中，鑑定了CFTR基因序列中的許多改變與囊性纖維化相關聯，其引起外顯子遺漏。具體地，外顯子12的遺漏由位於外顯子自身的剪接供體位點中的突變和由外顯子突變所導致。脊髓型肌萎縮（SMA，OMIM253300，253550和253400）是隱性的常染色體神經肌肉病，以脊髓α運動神經元的變性為特徵，具有估計的1/10,000出生兒的患病率。SMA相關聯的臨床症狀範圍從極其嚴重的出生後危險性肌張力低下和肌無力，到較晚在童年或青春期期間發病的較輕微的形式。迄今為止，尚未鑑定對於這種根據病史的嚴重度通常在一定年齡導致死亡的疾病的治療。在95%的病例中，疾病由SMN1基因的缺失所導致。在人類基因組中，存在與SMN1同源的基因，稱作SMN2。然而，SMN2的表達由於外顯子中的同義突變導致信使RNA的異常成熟和隨後外顯子7的遺漏並使基因自身失活而受損。設計的提高含外顯子7的SMN2轉錄物的數目的方法將因此允許使用由於SMN2的正確表達而對於SMN1基因的缺失的補償療法，極大地暗示了為SMA的可能有效的治療。在剪接過程中，微核RNA（snRNA）作為負責介導整個mRNA成熟過程的細胞機器的剪接體的必需組分起主要作用。具體地，微小U1RNA（U1snRNA），長度為164核糖核苷酸，由在人類基因組中出現若干拷貝的基因所編碼，且代表著核粒子U1snRNP的核糖核酸組分。U1snRNA分子具有莖和環三維結構，且其在5』區域包括通常長為9個核苷酸的單鏈序列，該單鏈序列能夠通過互補性鹼基配對結合前mRNA分子上的剪接供體位點（Horowitz等人,1994）。圖1顯示了野生型U1snRNA結構的示意圖。顯示了5』區域中能夠識別剪接供體位點的序列與真核基因的初級轉錄物中的剪接供體位點的共有序列配對。這一序列表現出不同程度的保守，且位於外顯子/內含子連接處。由U1snRNA5』區域介導的識別對於界定初級轉錄物上的外顯子/內含子連接位點和剪接體複合物的正確組裝是關鍵的。漸增數目的與前mRNA剪接缺陷相關聯的人類遺傳疾病，及其臨床過程的常見的嚴重度，在過去幾年刺激著針對在分子水平上糾正剪接缺陷的治療分子的研究。PinottiM等人2008和PinottiM等人,2009中描述了在突變位於5』剪接位點的情況下，能夠在體外引起正確的外顯子增加並恢復凝血因子VIImRNA的正確剪接的修飾的U1snRNA分子的應用。所示的機制基於修飾的U1snRNA在5』突變的剪接位點上的直接識別和結合。然而，由於5』剪接位點的相對保守和隨之而來的幹擾從其他功能性野生型基因生成的轉錄物的成熟的風險，該方法出現治療snRNA分子對靶基因的一定程度的非特異性作用。並且，其需要使用對5』剪接位點中的每個突變修飾的U1snRNA。

技術實現要素：
本發明表明了與5』剪接位點的下遊內含子序列互補的修飾的U1snRNA（且本文定義為外顯子特異性U1，ExSpeU1），在剪接過程中，能夠恢復被不同類型的突變損害的外顯子增加。在三種治療感興趣的不同的人類遺傳疾病模型中（脊髓型肌萎縮，血友病和囊性纖維化），本發明表明了，單獨的ExSpeU1或ExSpeU1的組能夠引起每種疾病模型的相應外顯子的增加。單獨的ExSpeU1或ExSpeU1的組糾正了由供體位點中的突變、受體位點的多嘧啶區域中的突變和調控外顯子序列中的突變導致的外顯子遺漏。利用ExSpeU1獲得的糾正有效性與現有技術中所描述的相同，但其可能保證對治療感興趣的靶基因轉錄物的作用的更高的選擇性。ExSpeU1方法允許使用單獨的修飾的U1-snRNA以用於糾正導致外顯子遺漏的一套組不同的基因突變。這些和其他目的通過如權利要求1中所定義的修飾的人類U1snRNA分子來達到。修飾的人類U1snRNA分子特徵在於野生型人類U1snRNA的5』區域中的部分單鏈核苷酸序列被能夠與治療感興趣的含引起異常剪接的突變的靶基因的初級轉錄物上的靶核苷酸序列雜交的結合單鏈核苷酸序列所替換。U1snRNA分子的靶核苷酸序列位於由外顯子/內含子連接位點（5』剪接位點）的下遊2至50個鹼基對構成的前mRNA的區域，條件是靶核苷酸序列不包括所述外顯子/內含子連接位點。優選地，靶核苷酸序列長度為5至50個核苷酸，更優選地為9至30個核苷酸。與現有技術相比較，本發明的U1snRNA分子主題具有進行靶向的和選擇性的（外顯子特異性的）作用的優點，因為其結合位於剪接供體位點側翼的內含子區域中的初級轉錄物上的靶核苷酸序列，其與外顯子/內含子連接位點的序列相比較表現出較低程度的保守。然而，令人驚奇地是，儘管在不包括外顯子/內含子連接位點的靶序列上運作，本發明的U1snRNA分子仍然能夠在存在包括外顯子突變或受體位點上的突變的不同類型的突變時引起外顯子的增加。本發明的另外的特徵在所附權利要求中定義，其為構成本說明書的技術教導的整體必需的部分。在一個優選的實施方案中，被結合核苷酸序列所替換的野生型U1snRNA的單鏈5』區域的部分長度為9至12個核苷酸。優選地，被ExSpeU1所糾正的和導致外顯子遺漏的突變位於由內含子/外顯子連接位點（3』剪接位點）的上遊3至50個鹼基對構成的序列，外顯子突變和剪接供體位點的共有序列中的突變。通過舉例的方式在治療感興趣的基因中監測凝血因子IX，SMN2和CFTR基因，其為含有與使其利用本發明的ExSpeU1來治療的疾病相關的突變的那些基因。在一個優選的實施方案中，本發明的修飾的人類U1snRNA分子包括選自由SEQIDNO:1至11，更優選地從SEQIDNO:1至10組成的組的結合核苷酸序列。在一個優選的實施方案中，基因包括啟動子序列和聚腺苷酸化信號序列。雖然其他自身已知的容易被本領域中的普通技術人員選擇的啟動子也可被使用，但是本發明人證實了編碼人類U1snRNA的基因的內源性啟動子是尤其適宜的。下文通過舉例的方式敘述了野生型人類U1snRNA編碼基因的正鏈的序列（在序列表中定名為SEQIDNO:12），其中單鏈5』區域在修飾的U1snRNA分子中被結合序列所替換的部分為粗體。用於插入結合序列的獨特的BglII和BclI限制位點的序列以下劃線顯示。除以大寫字母顯示的RNA編碼區域外，SEQIDNO:12基因序列還包括其表達所需的一些調控元件，比如啟動子和聚腺苷酸化信號。5』-taaggaccagcttctttgggagagaacagacgcaggggcgggagggaaaaagggagaggcagacgtcacttccccttggcggctctggcagcagattggtcggttgagtggcagaaaggcagacggggactgggcaaggcactgtcggtgacatcacggacagggcgacttctatgtagatgaggcagcgcagaggctgacgtcttcgccacttgctgcttcaccacgaaggagttcccgtgccctgggagcgggttcaggaccgctgatcggaagtgagaatcccagctgtgtgtcagggctggaaagggctcgggagtgcgcggggcaagtgaccgtgtgtgtaaagagtgaggcgtatgaggctgtgtcggggcagaggcccaagatctgATACTTACCTGGCAGGGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCGAGGCTTATCCATTGCACTCCGGATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCGACTGCATAATTTGTGGTAGTGGGGGACTGCGTTCGCGCTTTCCCCTGactttctggagtttcaaaagtagactgtacgctaa-3』（SEQIDNO:12）明顯地，僅以舉例的方式提供了以上的基因序列。可選地，為構建編碼本發明的修飾的U1snRNA的基因，可使用與SEQIDNO:12同源的任何基因序列，即能夠編碼能夠有效地介導剪接供體位點的識別的U1snRNA的基因序列。在實施例的章節中詳細描述了含有不同的結合序列的本發明的不同的修飾的U1snRNA分子主題的製備方法。本發明的又一個另外的目的是包括如先前所定義的分離的基因的表達載體。雖然本身已是本領域中的普通技術人員熟知的其他類型的表達載體也可使用，但是通常優選的表達載體是腺相關病毒載體。如先前所描述的，修飾的人類U1snRNA分子，編碼所述RNA分子的基因和包括所述基因的載體適用於由異常剪接導致的或與異常剪接相關聯的並以外顯子遺漏為特徵的遺傳疾病的治療性處理。優選地，但非以限制性方式地，所述疾病是囊性纖維化、乙型血友病或脊髓型肌萎縮。為達到該目的，將修飾的U1snRNA分子、所述基因和/或所述載體配製到藥物組合物中，所述藥物組合物除治療活性分子外還包括藥學上可接受的載體。載體和任選的藥物賦形劑的選擇是本領域中的普通技術人員所熟知的。本發明的另一方面是用於在培養的細胞中恢復治療感興趣的含有引起異常剪接的突變的靶基因的正確剪接的體外方法，所述體外方法通過用如先前所定義的表達載體轉染培養的細胞來進行。本發明的修飾的U1snRNA分子主題通過利用本領域中的普通技術人員熟知的常規分子生物學方法來生成。為評估本發明的U1snRNA主題對糾正異常剪接過程的作用，和為鑑定最有效的那種，本發明人廣泛使用了微基因方法，該方法的應用在科學文獻中廣泛記載。這一方法包括將含有導致剪接缺陷的突變的基因部分克隆到表達載體中，且然後將重組載體轉染到體外培養的細胞中。通過RT-PCR對源自感興趣的基因的部分的轉錄物進行分析，從而允許鑑定來源於異常剪接過程的長度異常的mRNA分子。修飾的U1snRNA與微基因的共轉染之後正常長度的感興趣的轉錄物的出現及其測序，代表了U1snRNA分子恢復正確的剪接過程的能力的明確指示。然而，正確信使RNA加工的恢復和具有實際治療意義的最終蛋白水平的恢復之間的類推還不明確。為此，本發明人使用了雜交微基因方法，其允許剪接和所表達的蛋白的研究。該方法由本發明人引入以研究凝血因子VII中的剪接突變（Pinotti等人,2009）。這一方法包括將整個編碼序列中的在含有導致剪接缺陷的突變的區域中包含一些內含子的基因的部分克隆到表達載體中（「剪接勝任cDNA構建體」），並隨後將重組載體轉染到體外培養的細胞中。通過RT-PCR對源自感興趣的基因的部分的轉錄物進行的分析，以及合成的蛋白的水平和活性的測量允許對生物功能的恢復的評估。通過示例的方式提供了以下的實施例，且並不限制所附權利要求中所定義的本發明的範圍。具體實施方式實施例1：修飾的U1snRNA的生成通過以下程序生成修飾的U1snRNA：用BglII和BclI限制酶消化包含野生型U1-snRNA基因的序列，即未修飾的U1-snRNA的質粒。用含有結合序列的雙鏈寡核苷酸替換由該兩個限制位點之間構成的序列。以下表1中描述了每個寡核苷酸的正向序列和反向序列，並以所用的寡核苷酸來命名所得的修飾的U1-snRNA。並且，圖2顯示了U1snRNA基因元件的示意圖。標示了通過其製備不同的修飾的U1snRNA的克隆策略。圖2顯示了插入到質粒載體（pGEM）中的具有啟動子元件DSE和PSE，編碼U1snRNA的區域（在中部），和3』加工盒的U1snRNA基因。轉錄起始位點以箭頭示出。BglII和BclI限制位點之間的序列包括編碼單鏈U1snRNA尾巴的區域，其已被用於特異性生成表1中所示的修飾的U1snRNA的寡核苷酸所替換。表1實施例2：將微基因轉染到培養細胞中並分析剪接產物通過利用Lipofectamine（脂質體）進行瞬時轉染將包含載體插入到細胞中。在用Trizol提取總細胞RNA後，用特異性的引物通過RT-PCR分析RNA。反應在兩步中發生：利用隨機引物作為模板通過逆轉錄酶將RNA逆轉錄為cDNA鏈，和通過DNA聚合酶擴增所得的cDNA。在終體積25μl的混合物中進行PCR反應，該混合物包含：-5μl的AMV/Tfl5x緩衝液，適宜於上述兩種酶正確行使功能；-1μl的10mMdNTP混合物；-50pmol的正向引物和50pmol的反向引物；-2μl的25mMMgSO4；-2μl的細胞提取的RNA；-1μl的AMV-RT（0.1μ/μl），1μl的TflDNA聚合酶；-適量的超純H2O逆轉錄步驟在45℃下進行4...