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一種檢測空調過濾網灰塵中塵蟎變應原基因的方法

2023-09-22 18:14:55 1

專利名稱:一種檢測空調過濾網灰塵中塵蟎變應原基因的方法
技術領域:
本發明涉及變應原基因檢測的方法,具體地說是一種檢測空調過濾網灰塵中塵蟎變應原基因的方法。
背景技術:
過敏性疾病(如哮喘、過敏性鼻炎等)是臨床上的常見病、多發病,據2000年WHO/IAACI報告指出近些年來哮喘的發病率和死亡率呈上升趨勢。全國部分城市對青少年哮喘流行病學統計(ISSAC調查)哮喘發病率為3.3%-5.1%,遠較10年前(約1%)升高;目前全國至少有一千萬以上兒童患哮喘。
過敏性疾病是由於各種接觸或吸入變應原引起的,變應原大部分為蛋白質,也可為多肽或糖類以及人工合成的物質如藥物等。最常見的變應原是塵蟎。塵蟎是強烈的變應原之一,可引起的全身性變態反應疾病包括變應性哮喘、變應性鼻球結膜炎、特應性溼疹/皮炎、變應性蕁麻疹等。蟎性變應疾病佔各種變態反應疾病的70%左右。在我國和世界的大部分地區,分布最廣泛的、研究最深入的兩種引起全身性變態反應疾病的塵蟎包括戶塵蟎和粉塵蟎。它們喜好在溫暖、潮溼環境中繁衍,經調查空調過濾網也是它們嗜好的棲居場所之一。人們在密封空調室內工作、生活和學習時間越來越多,因而室內空調過濾網灰塵中塵蟎變應原可成為室內主要的致敏因素之一。
蟎體雖小,但生理器官系統俱全,成分非常複雜,含有數十種變應原,已經確定的塵蟎變應原有十餘類,每一類別的分子量、酶的功能、IgE的結合率和結合力,以及含量等,大部分已測得。其中I類變應原(戶塵蟎的Der p1和粉塵蟎的Der f1)是塵蟎變應原重要的組成部分。該成份於塵蟎糞便顆粒中含量最高(每顆0.1ng),具有巰基蛋白酶的活性。Der pl、Der f1理化性質相似,胺基酸序列高度同源,Mr為25×103,pI為4.5~7.2,最佳溫度條件為37℃,pH6.0。與過敏者血清IgE結合率為80%~100%。其胺基酸序列為一種與木瓜蛋白酶相似的半胱氨酸蛋白酶。
聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重複性好、易自動化等突出優點;能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段於數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,能直接觀察和判斷。PCR技術的基本原理類似於DNA的天然複製過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成①模板DNA的變性模板DNA經加熱至93--95℃左右一定時間後,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;②模板DNA與引物的退火(復性)模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;③引物的延伸DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按鹼基配對與半保留複製原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留複製鏈重複循環變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的「半保留複製鏈」,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
運用PCR的方法檢測塵蟎特異的DNA序列具有簡單、實用、靈敏度和特異性高等優點。只需要少量的樣品即可檢測出屋塵蟎和粉塵蟎變應原基因的存在。本研究為研製防蟎和殺蟎新型空調設備提供了技術基礎。同時,為居家環境中的塵蟎檢測提供了一種技術手段。

發明內容
本發明的目的就是運用PCR的方法檢測空調過濾網灰塵中塵蟎變應原基因的方法,具有簡單、實用、靈敏度和特異性高等優點。只需要少量的樣品即可檢測出屋塵蟎和粉塵蟎變應原基因的存在。本研究為研製防蟎和殺蟎新型空調設備提供了技術基礎。同時,為居家環境中的塵蟎檢測提供了一種技術手段。
具體地說通過玻璃顆粒吸附法是提取空調過濾網灰塵中總的微生物基因組DNA作模板,分別設計Der p1和Der f1各兩套內外擴增引物進行套式PCR,進行套式PCR反應,通過擴增出目的片段來檢測空調過濾網灰塵中塵蟎變應原基因。
具體實施例方式
本發明的內容,通過以下的實施例作具體說明實施例1提取空調過濾網灰塵中的總的微生物基因組DNA
採用玻璃顆粒吸附法提取空調過濾網灰塵中的總的微生物基因組DNA,先配製下列溶液灰塵裂解液5mol/L異硫氰酸胍0.1mol/L EDTA(pH8.0)玻璃顆粒-DNA結合緩衝液(含50mg/ml玻璃顆粒5~25u)6mol/L高氯酸鈉50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)10mmol/L TDTA(Trans-1,2-diaminocyclohexane-N,N,N』,N』,-tetracetic acid)洗脫緩衝液0.2mol/L高氯酸鈉50mmol/L Tris-Cl,pH8.010mmol/L TDTA操作步驟(1)稱取空調過濾網灰塵100mg懸浮於500ul灰塵裂解液中,混勻,55℃放置2小時,離心12000rpm 15min,取上清。
(2)在上清中加入2.5ml玻璃顆粒-DNA結合緩衝液,室溫搖蕩混勻20分鐘。
(3)離心30秒種沉澱結合DNA的玻璃顆粒。
(4)用500ul結合緩衝液再懸浮漂洗沉澱1次,離心30秒,棄上清。
(5)加入1ml洗脫液懸浮玻璃顆粒,室溫搖蕩混勻20分鐘。
(6)離心30秒種,吸出上清轉移至1個新Eppendorf管中。
(7)加入2倍容積100%的乙醇,反覆顛倒Eppendorf管數次,12000g離心5分鐘沉澱DNA。
(8)棄上清,加入500ul 90%乙醇懸浮漂洗DNA沉澱,1000g離心3分鐘,棄上清,室溫蒸發乙醇20分鐘或真空乾燥10分鐘,DNA可直接溶解於200ul TE中,供下面的PCR反應模板之用。
實施例2空調過濾網灰塵中粉塵蟎主要變應原Der f1基因的檢測本發明採用套式PCR技術對空調過濾網灰塵中粉塵蟎主要變應原Der f1基因的檢測。可以採用兩套引物放在一起進行套式PCR反應,也可以採用下面分兩步進行PCR的方法。具體操作如下(1)設計併合成粉塵蟎主要變應原Der f1基因的檢測正向外引物Derfp1,其序列為5』atc aat tcg gtt aac gtt aac 3』(2)設計併合成粉塵蟎主要變應原Der f1基因的檢測反向外引物Derfr1,其序列為5’ttg gtc gtc ggc att gtt gtt 3』(3)先將引物離心,然後分別用滅菌水稀釋,終濃度均為50pmol/ul。PCR反應體積為20ul;10×buffer 2ul;dNTP 1.6ul;引物分別加0.5ul;Taq酶1ul;實施例1提供模板1ul;滅菌水13.4ul。
(4)PCR反應程序為95℃,3分30秒94℃,40秒55℃,50秒 30cycles72℃,50秒72℃,10min。按上述條件進行PCR反應。
(5)PCR產物電泳瓊脂糖膠濃度為2%,每個樣品上樣8ul,120V電泳40min,Marker為DNA 100bp ladder。
(6)從瓊脂糖膠中回收目的DNA片段,其大小約為360bp,按照膠回收試劑盒3S Spin Agrose Gel DNA Purification Kit試劑盒的方法進行提取。回收的DNA溶解於400ul TE中,供第二次的PCR反應模板之用。
(7)設計併合成粉塵蟎主要變應原Der f1基因的檢測正向內引物Der fp2,其序列為5』gaa att gga ttt acg atc act gc 3』(8)設計併合成粉塵蟎主要變應原Der f1基因的檢測反向內引物Der fr2,其序列為5』gta tgg ata gct tct ttc ttc aac 3』(9)先將合成的引物離心,然後分別用滅菌水稀釋,終濃度均為50pmol/ul。PCR反應體積為20ul;10×buffer 2ul;dNTP 1.6ul;引物分別加0.5ul;Taq酶1ul;第一次的PCR反應產物為模板取1ul;滅菌水13.4ul。
(10)PCR反應程序為95℃,3分30秒
94℃,40秒55℃,50秒 30cycles72℃,50秒72℃,10min。
按上述條件進行PCR反應。
(11)PCR產物電泳瓊脂糖膠濃度為2%,每個樣品上樣8ul,120V電泳40min,Marker為DNA 100bp ladder。有大小約為300bp。目的DNA片段即為檢測陽性。
(12)可以按照膠回收試劑盒3S Spin Agrose Gel DNA Purification Kit試劑盒的方法進行目的DNA回收並進行克隆和DNA序列分析與GENEBANK進行比較分析。
實施例3空調過濾網灰塵中屋塵蟎主要變應原Der p1基因的檢測實本發明採用套式PCR技術對空調過濾網灰塵中屋塵蟎主要變應原Der p1基因的檢測。可以採用兩套引物放在一起進行套式PCR反應,也可以採用下面分兩步進行PCR的方法。具體操作如下(1)設計併合成屋塵蟎主要變應原Der p1基因的檢測正向外引物Der p p1,其序列為5』gaa act aac gcc tgc agt atc 3』(2)設計併合成屋塵蟎主要變應原Der p1基因的檢測反向外引物Der pr1,其序列為5』att tgg tcg tcg gca tga ttg 3』(3)先將引物離心,然後分別用滅菌水稀釋,終濃度均為50pmol/ul。PCR反應體積為20ul;10×buffer 2ul;dNTP 1.6ul;引物分別加0.5ul;Taq酶1ul;實施例1提供模板1ul;滅菌水13.4ul。
(4)PCR反應程序為
95℃,3分30秒94℃,40秒55℃,50秒 30cycles72℃,50秒72℃,10min。
按上述條件進行PCR反應。
(5)PCR產物電泳瓊脂糖膠濃度為2%,每個樣品上樣8ul,120V電泳40min,Marker為DNA 100bp ladder。
(6)從瓊脂糖膠中回收目的DNA片段,其大小約為360bp,按照膠回收試劑盒3S Spin Agrose Gel DNA Purification Kit試劑盒的方法進行提取。回收的DNA溶解於400ul TE中,供第二次的PCR反應模板之用。
(7)設計併合成屋塵蟎主要變應原Der p1基因的檢測正向內引物Derpp2,其序列為5』gaa atg ctc cag ctg aaa tcg at 3』(8)設計併合成屋塵蟎主要變應原Der p1基因的檢測反向內引物Der pr2,其序列為5’t cga tag tag ctt tct tgg acg 3』(9)先將合成的引物離心,然後分別用滅菌水稀釋,終濃度均為50pmol/ul。PCR反應體積為20ul;10×buffer 2ul;dNTP 1.6ul;引物分別加0.5ul;Taq酶1ul;第一次的PCR反應產物為模板取1ul;滅菌水13.4ul。
(10)PCR反應程序為95℃,3分30秒94℃,40秒55℃,50秒 30cycles
72℃,50秒72℃,10min。
按上述條件進行PCR反應。
(11)PCR產物電泳瓊脂糖膠濃度為2%,每個樣品上樣8ul,120V電泳40min,Marker為DNA 100bp ladder。有大小約為300bp。目的DNA片段即為檢測陽性。
(12)可以按照膠回收試劑盒3S Spin Agrose Gel DNA Purification Kit試劑盒的方法進行目的DNA回收並進行克隆和DNA序列分析與GENEBANK進行比較分析。
一種檢測空調過濾網灰塵中塵蟎變應原基因的方法.seq一種檢測空調過濾網灰塵中塵蟎變應原基因的方法110深圳大學120一種檢測空調過濾網灰塵中塵蟎變應原基因的方法1608210121121212DNA213人工序列223檢測粉塵蟎主要變應原Der f1基因的正向外引物Der f p14001atcaattcgg ttaacgttcc a 21210221121212DNA213人工序列223檢測粉塵蟎主要變應原Der f1基因的反向外引物Der f r14001ttggtcgtcg gcattgttgt t 21210321123212DNA213人工序列223檢測粉塵蟎主要變應原Der f1基因的正向內引物Der f p24001ggaattggat ttacgatcac tgc 23210421124212DNA213人工序列223檢測粉塵蟎主要變應原Der f1基因的反向內引物Der f R24001gtatggatag cttctttctt caac 24210521121212DNA213人工序列223檢測屋塵蟎主要變應原Der p1基因的正向外引物Der p p14001gaaactaacg cctgcagtat c 21210621121212DNA213人工序列223檢測屋塵蟎主要變應原Der p1基因的反向外引物Der p r14001atttggtcgt cggcatgatt g 21210721123212DNA213人工序列223檢測屋塵蟎主要變應原Der p1基因的正向內引物Der p p24001gaaatgctcc agctgaaatc gat 23210821122212DNA213人工序列223檢測屋塵蟎主要變應原Der p1基因的反向內引物Der p R24001tcgatagtag ctttcttgga cg 2權利要求
1.一種檢測空調過濾網灰塵中塵蟎變應原基因的方法。具體地說通過玻璃顆粒吸附法等方法提取空調過濾網灰塵中總的微生物基因組DNA並作為模板,分別設計Der p1和Der f1各兩套內外擴增引物進行套式PCR反應或分兩步進行PCR,通過擴增出目的片段來檢測空調過濾網灰塵中粉塵蟎主要變應原Der f1基因和屋塵蟎主要變應原Der p1基因。
2.根據權利要求1所述的玻璃顆粒吸附法提取空調過濾網灰塵中的總的微生物基因組DNA。
3.根據權利要求1所述的PCR技術檢測粉塵蟎主要變應原Der f1基因的引物,其特徵在於序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3和SEQ ID NO.4。
4.根據權利要求1所述的PCR技術檢測屋塵蟎主要變應原Der p1基因的引物。其特徵在於序列為SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8。
5.根據權利要求1所述的套式PCR技術檢測空調過濾網灰塵中粉塵蟎和屋塵蟎主要變應原基因的方法。
全文摘要
本發明涉及一種檢測空調過濾網灰塵中塵蟎變應原基因的方法。過敏性疾病是由於各種接觸或吸入變應原引起的,其中,塵蟎引起的變態反應疾病佔70%左右。引起變態反應疾病的塵蟎主要包括戶塵蟎和粉塵蟎。經過調查發現空調過濾網也是它們嗜好的棲居場所之一。本發明運用PCR方法檢測空調過濾網灰塵中塵蟎變應原的基因。具體地說通過玻璃顆粒吸附法等方法提取空調過濾網灰塵中總的微生物基因組DNA作模板,分別設計Der p1和Der f1各兩套內外擴增引物進行套式PCR反應或分兩步進行PCR,通過擴增出目的片段來檢測空調過濾網灰塵中塵蟎變應原基因。只需要少量的樣品即可檢測出空調過濾網灰塵中屋塵蟎和粉塵蟎變應原基因。
文檔編號C12Q1/68GK1597985SQ20041002810
公開日2005年3月23日 申請日期2004年7月16日 優先權日2004年7月16日
發明者劉志剛, 刑苗, 喻海瓊, 吉坤美, 高波, 張紅雲, 洪旭, 肖勇 申請人:深圳大學

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