能同時對多種分析物進行檢測的免疫層析方法

2023-09-22 17:37:55 1

專利名稱：能同時對多種分析物進行檢測的免疫層析方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫層析方法，特別是涉及一種不用對於現有免疫層析裝置進行
較大改變的情況下，能夠同時進行多種分析物檢測的方法，該方法可應用於自身免疫診斷 等方面。
背景技術：
免疫層析法(Imm皿ochromatography)是九十年代興起的一種基於免疫膠體金技 術的快速診斷技術，其原理是將特異的抗體先固定於硝酸纖維膜的某一區帶，當該乾燥的 硝酸纖維素膜一端浸入樣品後，由於毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定 有抗體的區域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發生特異性結合，若用免疫膠體金可使該 區域顯示一定的顏色，從而實現特異性的免疫診斷。 現有的免疫層析法，一般在固相上包被有兩條線，一條作為測試線，一條作為質控 線(如圖l)，但這種處理方法的結果只能針對一種被分析物進行分析，如果需要同時檢測 多種物質，則需要準備多種測試條，並採用多份樣品進行測試。 而目前，能夠同時檢測多種分析物的方法，如自身免疫診斷產品應用的方法，其中 包括免疫印跡法(Westernblot)，其構造為在一條膜條上同時平行包被有多種抗原。進行測 試時，需要使用搖床，鑷子，溫浴槽等輔助工具。在這種情況下，如果使用常規的層析方法進 行測試，在前後兩個條帶含有交叉反應抗原位點的情況下，樣品流經前個條帶後再經過接 下去的條帶，很有可能會影響結果，從而影響判讀，或由於前一條測試帶反應過於強烈，使 剩餘膠體金量不夠進行餘下的反應，從而影響結果。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種能同時對多種分析物進行檢測的免疫層析 方法，該方法可利用一種原理和一種試劑進行多種測試，節約了改換模具的成本及樣品的 使用量，操作更為簡便。 為解決上述技術問題，本發明的一種能同時對多種分析物進行檢測的免疫層析方 法，步驟包括 (1)按常規方法製備顯色劑；
(2)抗原或抗體顯色劑標記製備 將顯色劑與多種樣品分析物相對應的抗原或抗體按比例混合，使顯色劑與抗原或 抗體形成穩定的體系，純化濃縮，形成抗原或抗體顯色劑標記，該標記最終包被於玻璃纖維 上後，製備成顯色劑標記；
(3)測試條製備 測試條由背襯(塑料板或硬化板)、吸水紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜及步驟(2) 製備的顯色劑標記組成，吸水紙、硝酸纖維素膜、固體膠體金片及玻璃纖維膜依次粘貼於背 襯之上，且相互之間有l-2mm的接觸；其中，在硝酸纖維素膜上包被待測分析物相應的抗體或抗原，且該抗體或抗原在垂直方向上不重疊；
(4)樣品分析物檢測 按照常規免疫層析法進行檢測，取30iU 1ml樣品分析物點樣於測試條的加樣 區，在2 30min內觀察並記錄結果。 所述顯色劑包括膠體金、乳膠或螢光等，採用膠體金作為顯色劑時，該膠體金顆粒 粒徑在1 150nm，可以按常規的檸檬酸三鈉還原法製備膠體金顆粒。 在所述步驟(2)中該標記最終包被於玻璃纖維上後，可以再經過冷凍乾燥處理制 備成固體顯色劑片，冷凍乾燥的溫度為0 -S(TC，乾燥時間為2-72小時。
所述步驟(2)中的顯色劑與樣品分析物相對應的抗原或抗體混合的比例範圍是 lml顯色劑比0. 1-500 ii g抗原或抗體。 所述步驟(3)中的硝酸纖維素膜的尺寸是長2 10cm，寬4mm 2cm，該膜上有 2 10個抗原或抗體，相鄰兩個抗原/抗體顯色劑標記梯度位置間的間隔範圍是2mm 8cm。 所述步驟(2)中抗原或抗體膠體金標記以每ml鋪8-40cm2均勻平鋪於玻璃纖維 上。 所述步驟(3)中的背襯是塑料板或硬化板。 所述步驟(3)中硝酸纖維素膜上包被待測分析物相應的抗體或抗原的濃度為
0. 001mg/ml 10mg/ml。 本發明與現有方法的比較 如果採用原先的方法在膜上包被平行多條完整條帶進行多種測試的，當使用含有
二抗的膠體金進行對多種抗原的測試時，經過第一條條帶時，如果此時反應較為強烈，在第
一條帶上就會佔有膠體金中絕大部分的二抗，當反應進行到第二條條帶時，如果反應還是
很強烈，但是由於膠體金在第一條條帶中被佔據了太多，在隨後的反應中，即使反應同樣強
烈，卻由於膠體金的量不夠而顯不出顏色來，從而帶來判讀失誤，造成測試的失敗； 而採用本方法，條帶和條帶之間在垂直方向並不重疊，如果縱向劃分條帶的話，膠
體金等顯色劑並不會在縱向上受到阻礙，所以一條測試條上的所有反應不會產生相互的幹
擾。這樣改進的好處在於可以利用現有的層析法檢測裝置，來進行自身免疫疾病的診斷。這
樣既節約了檢測的時間，又節約了裝置的成本，並且不需要重新進行設計或打造模具等工作。 本發明中，樣品從測試條底部由於毛細作用向上爬，經過各包被條時進行相應的 反應。由於各包被條在垂直方向不重疊，所以所有的反應並不會相互之間有影響。從而可 以達到用一份樣品進行多種測試的目的，並且使所有的反應都能在同樣條件下進行，從而 並不會產生由於條帶和條帶之間的幹擾所產生的錯誤結果。


下面結合附圖與具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明
圖1是現有的免疫層析法的檢測試劑結構示意圖； 圖2是本發明方法操作過程的演示圖，其中紅色部分是膠體金或其他顯色劑的反 應途徑；
圖3是實施例1中HCV的陽性樣品免疫層析圖，其中，a是HCV高濃度陽性樣品，b 是HCV臨界濃度陽性樣品； 圖4是實施例1中HIV高濃度陽性樣品和HCV臨界濃度陽性樣品混合物的免疫層 析圖，a是採用以前方法，b是採用本發明方法；
圖5是實施例2的結果示意圖；
圖6是實施例3的結果示意圖。
具體實施例方式
實施例1同時檢測愛滋病病毒(HIV)和C型肝炎病毒(HCV) (1)按常規的檸檬酸三鈉還原法製備膠體金，顆粒粒徑40nm ; (2)將膠體金與lmg/ml蛋白A(購自Sigma公司)按照體積比為128 : 1混合均
勻，穩定後1000轉/分離心10min，濃縮，每10cm2玻璃纖維上均勻平鋪1ml膠體金，經_20°C
冷凍乾燥12h，製成固體膠體金片； (3)測試條製備 將吸水紙、硝酸纖維素膜、步驟(2)所製備的固體膠體金片及玻璃纖維膜依次粘 貼於塑料板背襯之上； 其中，硝酸纖維素膜長2. 5cm、寬4mm，在硝酸纖維素膜上平行包被HIV和HCV的抗 原(但這2個抗原在垂直方向上不重疊，包被濃度都為lmg/ml ，包被了 0. 4mg) ，HIV抗原比 HCV抗原更臨近加樣區，2個抗原梯度間隔0. 5cm ; (4)按照常規免疫層析法進行檢測，取50iU樣品分析物點樣於測試條的加樣區， 在5min內觀察，參照圖2，其結果見圖3和圖4。 其中，圖3-a中HCV陽性對照的濃度是5mg/ml ，圖3_b中HCV陽性對照臨界濃度是 0. 005mg/ml。 圖4中，HIV高濃度陽性樣品與HCV臨界濃度陽性樣品的混合比是1 : 1，混合後 HIV高濃度陽性樣品的濃度為10mg/ml，混合後HCV臨界濃度陽性樣品的濃度為0. 005mg/ ml。 從圖3、圖4中結果可示，如果按照原來的方法操作(在硝酸纖維素膜上包被平行 2個HIV和HCV抗原進行測試，垂直方向有交叉)，HCV弱陽性由於之前HIV反應過於強烈 而反映不出，但是按照本發明方法操作，就可以真實地反映出試驗的結果。
實施例2同時檢測HIV1、 HIV2、 HCV (1)將FITC(異硫氰酸螢光素)溶解於DMSO( 二甲亞碸)，濃度為lmg/ml ; [OO44] (2)將FITC溶液與0. 2mg/ml蛋白A (購自Sigma公司)按照體積比為1 : 1混合 均勻，緩慢混合8個小時，即完成蛋白A與螢光素的結合； [OO45] (3)測試條製備 將吸水紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜依次粘貼於塑料板背襯之上；
其中，硝酸纖維素膜長2cm、寬5mm，在硝酸纖維素膜上平行包被HIV1、 HIV2、 HCV 抗原和蛋白A(蛋白A作為質控線)(所有的包被線在垂直方向上不重疊，包被濃度都為 0. 001mg/ml，包被了 0. 0005mg)，從加樣區到吸水紙方向依次為HIV1、 HIV2、 、蛋白A，間 隔為4mm ;
(4)按照常規免疫層析法進行檢測，加100 螢光素蛋白A結合物於樣品區，取 30iU樣品(HIV1、2與HCV陽性樣品混合物，1 : 1 : l混合，終濃度皆為5mg/ml)分析物 點樣於螢光素結合物之後，在5min內用520nm波長的紫外光觀察，參照圖2，其結果見圖5。
實施例3同時檢測ToRCH五項 (1)準備乳膠藍色微粒，平均粒徑為100nm，微粒；濃度為lmg/ml (2)將膠體金與10mg/ml蛋白A(購自Sigma公司)按照體積比為1000 : 1混合
均勻，室溫緩慢混勻，反應4小時後，於4t:儲存； (3)測試條製備 將吸水紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜依次粘貼於塑料板背襯之上；
其中，硝酸纖維素膜長10cm、寬2cm，在硝酸纖維素膜上依次平行包被Toxo(弓 形蟲)，HSV1 (單純皰疹病毒1型)和HSV2(單純皰疹病毒2型)，CMV(巨細胞病毒)， Rubella(風疹)5種抗原(但這5個抗原在垂直方向上不重疊，包被濃度都為10mg/ml，包 被了 2mg)，從加樣區到吸水紙方向依次為TOXO， HSV1， HSV2， CMV， Rubella,各抗原梯度間隔 1. 5cm j (4)按照常規免疫層析法進行檢測，取lml乳膠微粒結合物於加樣區，取lml樣品
分析物點樣於乳膠微粒結合物後，在5min內觀察，參照圖2，其結果見圖6。 圖6(A)-(E)是各自的結果，圖6(F)為混合樣品的結果，由圖6可見，混合物測試
與各自測試的結果相同，即本發明方法反映出測試的真實結果。
權利要求
一種能同時對多種分析物進行檢測的免疫層析方法，步驟包括(1)按常規方法製備顯色劑；(2)抗原或抗體顯色劑標記製備將顯色劑與多種樣品分析物相對應的抗原或抗體按比例混合，使顯色劑與抗原或抗體形成穩定的體系，純化濃縮，形成抗原或抗體顯色劑標記，該標記最終包被於玻璃纖維上後，製備成顯色劑標記；(3)測試條製備測試條由背襯、吸水紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜及步驟(2)製備的顯色劑標記組成，吸水紙、硝酸纖維素膜、顯色劑標記及玻璃纖維膜依次粘貼於背襯之上，且相互之間有1-2mm的接觸；其中，在硝酸纖維素膜上包被待測分析物相應的抗體或抗原，且該抗體或抗原在垂直方向上不重疊；(4)樣品分析物檢測按照常規免疫層析法進行檢測，取30μl～1ml樣品分析物點樣於測試條的加樣區，在2～30min內觀察並記錄結果。
2. 如權利要求1所述的能同時對多種分析物進行檢測的免疫層析方法，其特徵在於 所述顯色劑包括膠體金、乳膠或螢光。
3. 如權利要求1所述的能同時對多種分析物進行檢測的免疫層析方法，其特徵在於在所述步驟(2)中該標記最終包被於玻璃纖維上後，再經過冷凍乾燥處理製備成固體顯色 劑片，冷凍乾燥的溫度為0 -S(TC，乾燥時間為2-72小時。
4. 如權利要求1所述的能同時對多種分析物進行檢測的免疫層析方法，其特徵在於 所述步驟(2)中的顯色劑與樣品分析物相對應的抗原或抗體混合的比例範圍是lml顯色劑 比0. 1-500 ii g抗原或抗體。
5. 如權利要求1所述的能同時對多種分析物進行檢測的免疫層析方法，其特徵在於 所述步驟(3)中的硝酸纖維素膜的尺寸是長2 10cm，寬4mm 2cm，該膜上有2 10個 抗原或抗體，相鄰兩個抗原或抗體梯度位置間的間隔範圍是2mm 8cm。
6. 如權利要求1所述的能同時對多種分析物進行檢測的免疫層析方法，其特徵在於 所述步驟(2)中抗原或抗體顯色劑標記以每ml鋪8-40cn^均勻平鋪於玻璃纖維上。
7. 如權利要求1所述的能同時對多種分析物進行檢測的免疫層析方法，其特徵在於 所述步驟(3)中的背襯是塑料板或硬化板。
8. 如權利要求1所述的能同時對多種分析物進行檢測的免疫層析方法，其特徵在於 所述步驟(3)中硝酸纖維素膜上包被待測分析物相應的抗體或抗原的濃度為0.001mg/ ml 10mg/ml。
全文摘要
本發明公開了一種能同時對多種分析物進行檢測的免疫層析方法，步驟包括1)按常規方法製備顯色劑；2)製備抗原或抗體顯色劑標記；3)製備測試條，且在測試條上包被多種分析物相對應的抗體或抗原，且該抗體或抗原在垂直方向上不重疊；4)按照常規免疫層析法進行檢測，觀察並記錄結果。本發明由於條帶和條帶之間在垂直方向並不重疊，所以一條測試條上的所有反應不會產生相互的幹擾，節約檢測時間及改換模具的成本和樣品的使用量，操作更為簡便。
文檔編號G01N33/558GK101738470SQ200810043909
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月6日 優先權日2008年11月6日
發明者姚愷齡, 陳國治 申請人:益思美詮生物科技(上海)有限公司