特基拉芽孢桿菌JN369及其應用的製作方法

2023-09-22 04:31:15 2

本發明涉及生物防治
技術領域：
，具體地說，涉及一種特基拉芽孢桿菌JN369及其在防治水稻稻瘟病中的應用。
背景技術：
：水稻(Oryzasativa)是最重要的糧食作物之一，全球有半數以上人口以水稻為食。稻瘟病(病菌為Magnaportheoryzae，其無性世代為Pyiculariaoryzae)是水稻最嚴重要的真菌性病害之一。稻瘟病菌(M.oryzae)是一種半活體寄生，在感染最初階段具有很明顯的活體營養階段。稻瘟病根據其發病部位和發病時期不同可以分為苗瘟、葉瘟、節瘟、穗瘟、穀粒瘟、枝梗瘟等。目前生產上主要利用抗病品種和使用化學殺菌劑控制稻瘟病。主要使用的殺菌劑有三環唑、稻瘟靈、咪鮮胺、稻瘟醯胺、異稻瘟淨、稻瘟淨、敵瘟磷(克瘟散)、丙環唑、嘧菌酯、戊唑醇、烯丙苯噻唑、氯溴異氰尿酸、三氯異氰尿酸、四氯苯酞、肟菌·戊唑醇(拿敵穩)、硫磺·三環唑、甲硫·三環唑(稻津)、異稻·稻瘟靈、丙環唑·咪醯胺等；生物產品化學有效成分或活體微生物如春雷黴素、乙蒜素、氨基寡糖素、特基拉芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌等。由於稻瘟病菌的遺傳背景複雜，易變異，加上抗瘟品種單一化，主栽品種的遺傳同質性高，抗病品種難保持持久抗稻瘟病，常常導致一個新的抗瘟品種在大面積種植幾年後喪失抗性，而感病化。在抗病品種不能滿足生產需要的情況下，化學防治是防治稻瘟病的有效手段，但由於用藥不合理，給生態安全帶來潛在的不利影響，也值得人們關注。生物防治即利用有益微生物活體或代謝產物殺滅或者降低病原微生物的數量以控制植物病害發生和危害。從植物病害的可持續控制來考慮，生物防治是一類綠色安全有效的防治措施。然而，生物防治領域中常會遇到拮抗微生物在田間自然條件下定殖力差、對病害防治效果不穩定等問題。大量的研究也表明，室內篩選出的拮抗微生物在溫室中對病原菌有較強的抑制作用，而在大田防治中效果不理想，這可能是由於一方面菌株不適應大田生態環境而不能很好的定殖到植物的根圍，另一方面與大田土壤中複雜的微生物種類與拮抗菌株之間出現相互作用，導致拮抗微生物防效降低，因此，選擇篩選生物菌株的田間適應能力強或高效代謝產物應用於大田病害防治是解決上述問題的重要途徑。技術實現要素：本發明的目的是提供一株新分離的生防菌-特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)JN369。本發明的另一目的是提供所述特基拉芽孢桿菌JN369在防治水稻稻瘟病中的應用。為了實現本發明目的，本發明的特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)JN369是從湖南省桃江石牛江鎮花田村(N28°42′55.56″，E112°15′74.24″)感稻瘟病水稻品種湘早秈24號的病叢中選取健康稻株分離獲得的，採用與稻瘟病菌平板對峙法篩選出的對稻瘟病菌菌絲抑制率達79.95％的拮抗菌株，同時該菌株對多種病原菌都有良好拮抗作用，如對菸草赤星病菌(Alternariaalternata)、葡萄灰黴菌(Botrytiscinerea)、辣椒膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、黃瓜疫病菌(Phytophthoramelonis)的菌絲抑制率分別達到69.31％、35.80％、70.83％和51.32％。現已保藏於中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢，武漢大學，郵編430072，保藏編號CCTCCNO：M2016340，保藏日期2016年6月22日。菌株JN369在NA平板上培養對其菌落形態進行觀察及對其菌體的掃描電鏡圖觀察，菌落形態不規則，邊緣光滑，中間粗糙不透明、有褶皺，菌落汙黃色。JN369菌體呈杆狀，大小為(0.6～1.0)μm×(2.0～4.0)μm，芽孢橢圓到柱狀，長0.5～1.0μm，形態如圖1所示。菌株JN369能使澱粉水解、明膠液化，接觸酶試驗、VP試驗、甲基紅試驗、硝酸鹽還原試驗呈陽性，使硫化氫試驗、吲哚試驗和苯丙氨酸脫氨酶試驗呈陰性，能利用D-果糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、玉米粉、D-甘露醇、D-阿拉伯糖。菌株JN369的16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。本發明還提供由所述特基拉芽孢桿菌JN369製備的菌劑。本發明還提供所述特基拉芽孢桿菌JN369或由其製備的菌劑在防治水稻稻瘟病中的應用。前述的應用包括將所述特基拉芽孢桿菌JN369或由其製備的菌劑施用於水稻作物。其中，所述菌劑中特基拉芽孢桿菌JN369的活菌濃度≥1×107cfu/mL。本發明進一步提供一種防治水稻稻瘟病的方法，將所述枯草芽孢桿菌JN369的培養液進行離心，得到活體菌沉澱與上清液(含代謝產物)，將活體菌配製菌懸液施用於水稻作物，或將上清液施用於水稻作物。可選的，所述上清液(代謝產物)的製備方法包括：菌株JN369在NA固體培養基(蛋白腖5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂17g/L，pH7.0，蒸餾水配製)平板上活化後，用打孔器打取直徑5mm的2個菌餅接入裝有150mLNB液體培養基(蛋白腖5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，pH7.0，蒸餾水配製)的250mL三角瓶中，28℃、180r/min條件下，搖床振蕩培養6d，用細菌過濾器過濾，獲得特基拉芽孢桿菌JN369代謝產物。進一步地，所述施用方法優選為葉面噴施。即將菌株JN369代謝產物或活體菌(濃度≥1×107cfu/mL)在稻瘟病菌侵染前或侵染後1-3d，採用葉面噴霧法施用於水稻作物上，能夠起到較好的防效效果，也證明了該菌株具有良好的治療稻瘟病效果。預防時，可在水稻抽穗初期施用，施用方法同上。作為優選，施用量為菌體4.5×1012cfu/hm2～4.5×1013cfu/hm2；根據權利要求6和8所述菌體與代謝產物混合使用4.5×1011cfu/hm2～4.5×1012cfu/hm2。。此外，採用平板對峙培養法發現菌株JN369對多種病原指示菌，例如菸草赤星病菌(A.alternata)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、辣椒膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、黃瓜疫病菌(P.melonis)生長的抑菌率分別為69.31％、35.80％、70.83％和51.32％。本發明的有益效果在於：本發明經篩選得到一種特基拉芽孢桿菌JN369並對其進行了保藏，利用本發明提供的特基拉芽孢桿菌JN369對水稻稻瘟病進行防治，避免了化學防治對環境和稻米安全的潛在不良影響及抗病品種利用的感病化風險。菌株JN369活體菌及其代謝產物對稻瘟病均有較好的防效，保護和治療作用兼具，可將其作為活體菌劑和代謝產物的劑型加工開發。附圖說明圖1為本發明特基拉芽孢桿菌JN369的菌株掃描電鏡下菌體形態。圖2為本發明實施例1中特基拉芽孢桿菌JN369在NA平板上培養結果；其中，A為菌落形態，B為劃線培養結果。圖3為本發明實施例1中特基拉芽孢桿菌JN369對不同病原指示菌的生長抑制效果；其中，A1為菸草赤星病菌(A.alternata)；A2為JN369對菸草赤星病菌菌絲生長抑制效果；B1為棉花枯萎病菌(F.oxysporum)；B2為JN369對棉花枯萎病菌菌絲生長抑制效果。圖4為本發明實施例2中特基拉芽孢桿菌JN369及其代謝產物對稻瘟病菌(M.oryzae)的菌絲生長抑制效果；其中，A為菌株JN369對稻瘟病菌生長抑制效果，CK為稻瘟病菌；B為菌株JN369的代謝產物對稻瘟病菌菌絲生長抑制效果，CK為稻瘟病菌。具體實施方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。實施例1特基拉芽孢桿菌JN369的分離獲得從湖南省桃江石牛江鎮花田村(N28°42′55.56″，E112°15′74.24″)感稻瘟病水稻品種湘早秈24號的病叢中選取健康稻株，共分離出517株菌株，採用與稻瘟病菌平板對峙法篩選出1株對稻瘟病菌(M.oryzae)菌絲抑制率達79.95％的拮抗菌JN369。通過在NA固體培養基(蛋白腖5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂17g/L，pH7.0，蒸餾水配製)平板上培養菌株JN369(圖2A和圖2B)，對其菌落形態進行觀察，對其菌體的掃描電鏡圖觀察，並結合該菌的生理生化、微生物學檢測結果，以及16SrDNA測序結果(見SEQIDNO.1)，最終確定菌株JN369為特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)。此外，採用平板對峙培養法發現菌株JN369對多種病原指示菌具有抑制效果(圖3)，例如菸草赤星病菌(A.alternata)、棉花枯萎病菌(F.oxysporum)、辣椒膠孢炭疽(C.gloeosporioides)、黃瓜疫病(P.melonis)生長的抑菌率分別為69.31％、35.80％、70.83％和51.32％。實施例2特基拉芽孢桿菌JN369在水稻稻瘟病防治中的應用菌株JN369在NA固體培養基平板上活化後，用打孔器打取直徑5mm的2個菌餅接入裝有150mLNB液體培養基(蛋白腖5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，pH7.0，蒸餾水配製)的250mL三角瓶中，28℃、180r/min條件在搖床中振蕩培養6d，用細菌過濾器過濾，獲得特基拉芽孢桿菌JN369代謝產物。將菌株JN369代謝產物和PDA培養基以體積(mL)1:8的量混勻，接直徑為7mm的稻瘟病菌菌餅於配好的培養基上，以無菌水代替拮抗菌培養液為對照，28℃培養，10d後測量稻瘟病菌的菌餅的大小，3次重複，結果顯示對稻瘟病菌菌絲的抑制率為79.95％。溫室盆栽試驗包括JN369菌株不同濃度活體菌和代謝產物對水稻高感稻瘟病品種湘晚秈12號的稻瘟病防治效果試驗兩部分，試驗在組培控溫光照培養室內進行。JN369活體菌對水稻高感品種湘晚秈12號的稻瘟病防治效果：採用噴霧法接種稻瘟病菌(分生孢子濃度為1×105個/mL)誘發稻瘟病。將JN369活菌濃度梯度設計為：1×1010cfu/mL、1×109cfu/mL、1×108cfu/mL、1×107cfu/mL共4個濃度梯度。試驗包括3種處理方式，分別為：A組先噴稻瘟病菌孢子液，第3d噴4個濃度梯度的JN369菌株活菌液；B組接種稻瘟病菌孢子懸浮液前1d分別噴4個濃度梯度的JN369菌株活菌液；C組接種稻瘟病菌孢子液前3d先分別噴4個濃度梯度的JN369菌株活菌液；設置清水、20％三環唑WP(×400倍液)和40％稻瘟靈EC(×500倍液)為對照，每種處理方式3缽，每缽30株。接種後7-10d對稻瘟病抗性進行分級調查和防治稻瘟病效果評價。JN369菌株代謝產物對水稻高感品種湘晚秈12號的稻瘟病防治效果評價：採用水稻活體接種法接種稻瘟病菌分生孢子懸浮液(濃度為1×105個/mL)誘發稻瘟病。具體試驗包括3種處理方式，分別為：A組先噴稻瘟病菌孢子液，第3d噴代謝產物；B組先噴代謝產物，1d後噴稻瘟病菌孢子液；C組先噴代謝產物，3d後噴稻瘟病菌孢子液。設置清水、殺菌劑40％稻瘟靈EC(×500倍液)和20％三環唑WP(×400倍液)為對照，每種處理方式3缽，每缽30株。接種後7-10d對稻瘟病抗性進行分級調查和防治效果評價。溫室盆栽試驗結果：JN369活體菌對水稻高感品種湘晚秈12號的稻瘟病防治效果見表1，JN369菌株代謝產物對水稻高感品種湘晚秈12號的稻瘟病防治效果見表2。表1JN369活體菌對湘晚秈12號的稻瘟病治療效果處理及菌體濃度(cfu/ml)病株率(％)病情指數相對防效(％)1×107(A組)64.4418.0271.811×108(A組)44.448.8886.101×109(A組)43.3310.2483.971×1010(A組)66.6715.3076.0640％稻瘟靈(A組)85.5529.8753.28三環唑(A組)85.5536.4243.05清水(A組)97.7863.95/1×107(B組)83.3338.9039.891×108(B組)62.2220.7467.941×109(B組)60.0019.0170.611×1010(B組)84.4440.8636.8340％稻瘟靈(B組)91.1142.1034.9220％三環唑(B組)81.1137.4142.18清水(B組)100.0064.69/1×107(C組)67.7829.6354.201×108(C組)66.6724.3262.401×109(C組)61.1118.8070.801×1010(C組)74.4433.3348.4740％稻瘟靈(C組)86.6739.8838.3620％三環唑(C組)87.7840.7437.02清水(C組)100.0064.69/註：以上數據均為3次重複結果。表2JN369菌株代謝產物對湘晚秈12號的稻瘟病防治效果處理病株率(％)病情指數相對防效(％)JN369(A組)45.558.5286.6740％稻瘟靈(A組)85.5529.8753.28三環唑(A組)85.5536.4243.05清水(A組)97.7863.95/JN369(B組)84.4437.9041.4140％稻瘟靈(B組)91.1142.1034.9220％三環唑(B組)81.1137.4142.18清水(B組)100.0064.69/JN369(C組)76.6727.9056.8740％稻瘟靈(C組)86.6739.8838.3620％三環唑(C組)87.7840.7437.02清水(C組)100.0064.69/註：以上數據均為3次重複結果。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp