一種抗氧化性膳食纖維的製備方法與流程
2023-09-22 07:03:45 2
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種利用南瓜膳食纖維製備抗氧化性膳食纖維的方法。
背景技術：
南瓜是我國普遍種植的瓜菜，資源豐富。南瓜含有果糖、果膠、甘露醇、多種維生素和胺基酸等營養成分，以及南瓜多糖、膳食纖維、β- 胡蘿蔔素、南瓜籽鹼和葫蘆巴鹼等多種生理活性物質，其多糖和果膠類水溶性膳食纖維含量較高，是極好的水溶性膳食纖維資源，但目前尚未加以利用。
膳食纖維作為一種重要的食品組成成分，被稱為「第七大營養素」，具有順腸通便、調節控制血糖濃度、降血脂等多種生理功能。
按溶解性，膳食纖維可以分為水溶性膳食纖維(SDF) 和水不溶性膳食纖維(IDF)。其中SDF在預防糖尿病、心血管疾病、降低膽固醇等方面具有比IDF 更強的生理活性。
SDF 是由半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等聚合而成的高分子碳水化合物。單糖分子上含有大量的羥基，這些羥基能夠發生酯化反應、醚化反應、羧甲基化及乙醯化反應。研究表明硫酸酯化是一種有效的化學修飾，多糖大分子單糖分子上的羥基被硫酸根所取代，具有抗凝血、抗腫瘤、抗病毒等生理活性，近年來一些硫酸酯化的香菇多糖、靈芝多糖、茯苓多糖等已應用於臨床。
水溶性膳食纖維經硫酸酯化後具有較強的抗氧化性。常用硫酸酯化的方法有：濃硫酸法、氯磺酸- 吡啶法、三氧化硫- 吡啶法、氯磺酸- 甲醯胺法。濃硫酸酯化需要在低溫條件下反應，否則由於濃硫酸的碳化作用使產物顏色較深，操作條件苛刻；三氧化硫- 吡啶法成本高，僅適用於實驗室水平；而氯磺酸- 吡啶法是目前採用較多的方法。氯磺酸- 吡啶法採用的氯磺酸是一種強氧化劑，遇水會發生劇烈分解，酯化試劑需要在-4℃嚴格無水條件下製備，製備條件苛刻，酯化劑穩定性差，易結塊，獲得酯化產物顏色深，無機鹽含量高。
針對上述酯化方法存在的缺陷，硫酸酯化方法不斷地改進。陝西科技大學楊陽等( 南瓜擠壓改性水溶性膳食纖維硫酸酯化修飾，食品與發酵工業，2014，40，61-64) 採用氨基磺酸- 吡啶法硫酸酯化南瓜膳食纖維，獲得硫酸酯化南瓜水溶性膳食纖維取代度為1.29，但是吡啶毒性大，易揮發，並且氣味刺鼻，反應產物在該體系中呈褐色粘稠狀，不易攪拌。
目前，對於氨基磺酸-DMF法硫酸酯化製備抗氧化性南瓜膳食纖維尚未見報導。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種抗氧化性膳食纖維的製備方法。
為達到上述目的，本發明採用了以下技術方案：
1) 將南瓜膳食纖維與南瓜膳食纖維重量20～40％的蒸餾水攪拌混合均勻後靜置30～120min，靜置後進行擠壓改性，然後依次經烘乾、粉粹以及過篩得南瓜膳食纖維擠壓改性物( 即擠壓改性南瓜膳食纖維) ；
2) 向南瓜膳食纖維擠壓改性物中加入蒸餾水後於50～70℃浸提1～2h，南瓜膳食纖維擠壓改性物與蒸餾水的質量比為1:20～1:40，浸提結束後抽濾並收集濾液，將濾液真空濃縮後加入1～4 倍體積的95％乙醇並靜置過夜( 水提醇沉法)，然後離心並收集沉澱，將沉澱烘乾得南瓜水溶性膳食纖維；
3) 將南瓜水溶性膳食纖維懸浮於N,N- 二甲基甲醯胺(DMF) 中得混合物A，在條件下向混合物A 中加入氨基磺酸，然後在超聲頻率為20～40kHz、溫度為50～80℃的條件下反應1～3h，反應結束後冷卻至室溫，然後用2～4mol/L NaOH 水溶液調節pH 值為中性，然後加入1～4 倍體積的95％乙醇並靜置過夜，然後離心並收集沉澱，將沉澱溶於蒸餾水並裝入透析袋中，然後用蒸餾水透析2～4 天，然後向透析液( 指透析袋內的液體) 中加入1～4 倍體積的95％乙醇並靜置過夜，然後離心並收集沉澱，將沉澱烘乾得硫酸酯化南瓜水溶性膳食纖維( 命名為SSDF)。
所述擠壓改性是在螺杆擠壓機螺杆轉速為700～900r/min 條件下擠壓膨化。
所述真空濃縮的條件為：溫度為45～60℃，真空度為0.06～0.09MPa，濃縮至濾液體積的1/4～1/6。
所述混合物A 中每1g 南瓜水溶性膳食纖維懸浮於60～90mL N,N- 二甲基甲醯胺中。
所述南瓜水溶性膳食纖維與氨基磺酸的質量比為1:1～1:4。
所述南瓜膳食纖維的製備方法包括以下步驟：將南瓜漿與蒸餾水攪拌混合均勻後用2～4mol/L NaOH 水溶液調節pH 為10～14，南瓜漿與蒸餾水的質量比為1:3～1:5，然後於50～80℃保溫10min 得混合物B，向混合物B 中加入蒸餾水體積1～3％的雙氧水，然後於50～80℃攪拌反應1～3h，攪拌反應結束後用流水洗滌至中性，洗滌後依次烘乾、粉碎以及過篩，得南瓜膳食纖維。
所述烘乾的溫度均為35～60℃ ；所述過篩均採用20～80 目篩。
與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
(1) 本發明選用氨基磺酸為酯化劑，DMF 為反應溶劑，將超聲波用於輔助南瓜SDF硫酸酯化，可以製備獲得具有良好生理活性的南瓜膳食纖維。
(2) 本發明以氨基磺酸為酯化劑，DMF 為反應介質，反應條件溫和、毒性低，且DMF介質易乾燥，性質溫和，不易揮發，南瓜SDF 在其中容易分散，產物顏色淺，在分離純化方面簡單易行。
(3) 本發明將超聲波用於輔助南瓜SDF 硫酸酯化，縮短了酯化時間，降低了酯化溫度，減少南瓜SDF 在強酸環境下的降解，增加酯化反應速率，製得的硫酸酯化南瓜水溶性膳食纖維顏色淺，得率高。
(4) 本發明首次研究硫酸酯化南瓜水溶性膳食纖維的抗腫瘤活性，經試驗證實，本發明製備的硫酸酯化南瓜水溶性膳食纖維對乳腺癌細胞增殖有明顯的抑制作用。
(5) 本發明通過對南瓜漿進行處理，不僅起到脫色作用，還提高了處理產物中南瓜膳食纖維的含量，通過進一步對南瓜膳食纖維進行擠壓改性處理，不僅顯著提高SDF 構成比例，同時提高SDF 持水力、膨脹力等。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明做詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
南瓜膳食纖維的製備：稱取一定質量南瓜漿，按照料液比為1:4(g:mL) 的比例加入蒸餾水，攪拌均勻，用2mol/L 氫氧化鈉水溶液調節pH 為13，於70℃保溫10min，然後加入蒸餾水體積2％的雙氧水，70℃攪拌反應2h，待反應結束後過100 目篩，篩上物用流水洗滌至中性，將其置於65℃真空烘箱中烘乾、粉碎並過40目篩，即得南瓜膳食纖維。
實施例1
1) 稱取一定質量20目南瓜膳食纖維，加入南瓜膳食纖維質量20％的蒸餾水，攪拌均勻，靜置30min，隨後在螺杆轉速為700r/min 條件下擠壓膨化，擠壓處理後將擠出物置於45℃烘箱中烘乾，粉碎並過40目篩，獲得擠壓改性南瓜膳食纖維；
2) 稱取一定質量40目擠壓改性南瓜膳食纖維，按1:20 的料液比(g:mL) 加入蒸餾水，於60℃浸提1h，抽濾並收集濾液，濾液在溫度為60℃，真空度為0.07MPa 下真空濃縮至1/5 體積，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心並收集沉澱，將沉澱置於45℃烘箱中烘乾，即得南瓜SDF ；
3) 準確稱取1.0g 南瓜SDF，將其懸浮於60mL DMF 中，在攪拌條件下加入2.0g 氨基磺酸，隨後於超聲頻率為20kHz、溫度為50℃下反應3h，反應結束後冷卻至室溫，隨後用2.5mol/L 氫氧化鈉水溶液調節pH 值為中性，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，然後離心並收集沉澱，將沉澱溶於蒸餾水並裝入透析袋中，蒸餾水透析3 天，透析液加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心並收集沉澱，將沉澱置於45℃烘箱中烘乾，即得到0.763g的SSDF。
實施例2
1) 稱取一定質量40目南瓜膳食纖維，加入南瓜膳食纖維質量30％的蒸餾水，攪拌均勻，靜置60min，隨後在螺杆轉速為800r/min 條件下擠壓膨化，擠壓處理後將擠出物置於50℃烘箱中烘乾，粉碎並過60 目篩，獲得擠壓改性南瓜膳食纖維；
2) 稱取一定質量60 目擠壓改性南瓜膳食纖維，按1:25 的料液比(g:mL) 加入蒸餾水，於70℃浸提1.5h，抽濾並收集濾液，濾液在溫度為50℃，真空度為0.06MPa 下真空濃縮至1/5 體積，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心並收集沉澱，將沉澱置於50℃烘箱中烘乾，即得南瓜SDF ；
3) 準確稱取1.0g 南瓜SDF，將其懸浮於70mL DMF 中，在攪拌條件下加入3.0g 氨基磺酸，隨後於超聲頻率為30kHz、溫度為60℃下反應2h，反應結束後冷卻至室溫，隨後用2.5mol/L 氫氧化鈉水溶液調節pH 值為中性，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，然後離心並收集沉澱，將沉澱溶於蒸餾水並裝入透析袋中，蒸餾水透析3 天，透析液加入4倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心並收集沉澱，將沉澱置於50℃烘箱中烘乾，即得到0.612gSSDF。
實施例3
1) 稱取一定質量40目南瓜膳食纖維，加入南瓜膳食纖維質量40％的蒸餾水，攪拌均勻，靜置90min，隨後在螺杆轉速為900r/min 條件下擠壓膨化，擠壓處理後將擠出物置於65℃真空烘箱中烘乾，粉碎並過80 目篩，獲得擠壓改性南瓜膳食纖維；
2) 稱取一定質量80 目擠壓改性南瓜膳食纖維，按1:30 的料液比(g:mL) 加入蒸餾水，於60℃浸提2h，抽濾並收集濾液，濾液在溫度為55℃，真空度為0.08MPa 下真空濃縮至1/6 體積，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心並收集沉澱，將沉澱置於65℃真空烘箱中烘乾，即得南瓜SDF ；
3) 準確稱取1.0g 南瓜SDF，將其懸浮於80mL DMF 中，在攪拌條件下加入3.0g 氨基磺酸，隨後於超聲頻率為35kHz、溫度為70℃下反應2h，反應結束後冷卻至室溫，隨後用2.5mol/L 氫氧化鈉水溶液調節pH 值為中性，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，然後離心並收集沉澱，將沉澱溶於蒸餾水並裝入透析袋中，蒸餾水透析3 天，透析液加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心並收集沉澱將沉澱置於65℃真空烘箱中烘乾，即得到0.609g的SSDF。
實施例4
1) 稱取一定質量40目南瓜膳食纖維，加入南瓜膳食纖維質量20％的蒸餾水，攪拌均勻，靜置120min，隨後在螺杆轉速為800r/min 條件下擠壓膨化，擠壓處理後將擠出物置於60℃烘箱中烘乾，粉碎並過40 目篩，獲得擠壓改性南瓜膳食纖維；
2) 稱取一定質量40 目擠壓改性南瓜膳食纖維，按1:40 的料液比(g:mL) 加入蒸餾水，於70℃浸提1.5h，抽濾並收集濾液，濾液在溫度為45℃，真空度為0.09MPa 下真空濃縮至1/5 體積，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心並收集沉澱，將沉澱置於60℃烘箱中烘乾，即得南瓜SDF ；
3) 準確稱取1.0g 南瓜SDF，將其懸浮於90mL DMF 中，在攪拌條件下加入4.0g 氨基磺酸，隨後於超聲頻率為30kHz、溫度為80℃下反應1h，反應結束後冷卻至室溫，隨後用2.5mol/L 氫氧化鈉水溶液調節pH 值為中性，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，然後離心並收集沉澱，將沉澱溶於蒸餾水並裝入透析袋中，蒸餾水透析3 天，透析液加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心並收集沉澱，將沉澱置於60℃烘箱中烘乾，即得到0.543g的SSDF。
本發明首先在鹼性環境下製備南瓜膳食纖維；其次對南瓜膳食纖維進行擠壓改性處理，經擠壓改性處理後水溶性膳食纖維含量從原料中的4.7％增加到27.3％；隨後採用水提醇沉法提取水溶性膳食纖維；然後採用氨基磺酸-N,N- 二甲基甲醯胺法對南瓜水溶性膳食纖維進行硫酸酯化修飾，獲得硫酸酯化南瓜SDF 取代度為0.23～0.97，酯化反應條件溫和，產物顏色淺，產率高。
本發明對製得的抗氧化性南瓜SDF（硫酸酯化南瓜SDF，簡稱SSDF） 分別進行自由基清除能力的測定及對人乳腺癌細胞MM231 的增殖抑制作用研究。自由基清除能力測定結果表明，與未酯化南瓜SDF 相比，硫酸酯化南瓜SDF 對羥自由基、超氧陰離子自由基及氧自由基清除能力顯著增強，當濃度為5mg/mL，對自由基清除能力分別提高22.04％、51.86％、38.98％。對乳腺癌細胞MM231的增值抑制作用研究結果表明，硫酸酯化南瓜SDF 對乳腺癌細胞MM231 的增值具有明顯抑制作用，利用Graphpad 軟體計算IC50 得到南瓜SDF、SSDF 對MM231 細胞48h 的IC50 分別為265.4mg/L，16.58mg/L。由此說明，本發明製得的抗氧化性南瓜膳食纖維具有良好的生物活性。