生菜hpt蛋白編碼序列的製作方法

2023-09-22 14:35:20 3

專利名稱：：生菜hpt蛋白編碼序列的製作方法
技術領域：
：本發明涉及的是一種基因工程
技術領域：
的蛋白編碼序列，具體地，本發明涉及一種生菜HPT蛋白編碼序列。
背景技術：
：自1922年維生素E的生物學功能被發現後,長期醫學研究表明，維生素E不僅僅與生殖系統有關，而且與中樞神經系統、消化系統、心血管系統和肌肉系統的正常代謝都有密切關係(TraberandSies，1996)。維生素E是一種脂類維生素，其天然產物依結構的不同分為八種類型，分別是a、e、Y、S-生育酚(toc叩herol)和a、e、Y、S-生育三烯酚(tocotrienol)，其中a-生育酚的生物活性最高，被認為是維生素E的主要活性成分。維生素E參與細胞膜的構建和維持，是動物和人體內重要的抗氧化物質。維生素E是治療冠心病、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的重要輔助性藥物，有助於降低血脂和血膽固醇含量，抗凝血、抗氧化並且消除自由基，從而起到預防及治療血管栓塞的作用。維生素E對於提高機體免疫能力有著重要的影響，具有抗衰老的功能，可以消除細胞色素沉澱，改善皮膚彈性，減弱性腺萎縮，因而在大量保健品和美容用品中廣泛使用。維生素E可以預防和治療多種婦科疾病，治療早產兒溶血性貧血和蠶豆病，治療營養不良兒童的巨幼紅細胞性貧血。維生素E可以促進膽汁分泌、膽管形成和膽紅素分泌，對急慢性肝炎和肝硬化有著治療作用。維生素E可以預防癌症發生，對於癌症患者的治療也有重要的輔助作用。維生素E對於人類和動物健康有重要作用，但維生素E的合成途徑只存在於綠色光合植物中，包括低等單細胞植物藍藻和高等植物；人體和動物體內不存在維生素E合成途徑，故而日常營養所需的維生素E攝取自綠色植物，特別是各種油類作物的種子，以及由種子所搾取的植物油。直接由植物油脫臭餾出物中獲得的生育酚混縮液的生物活性很低，a-生育酚的含量較低。工業生產維生素E主要是以上述生育酚混縮液為原料，經過半合成法，將其中的非a-生育酚成分轉變為a-生育酚。但是成本較高，而且產生的a-生育酚消旋性與天然a-生育酚不同，活性也低於天然a-生育酚。因此，提高植物天然生育酚含量及其a-生育酚比例具有很重要的應用價值。隨著近年來植物基因組學的發展，DellaPenna於1999年提出了營養基因組學(nutritionalgenomics)的概念，即充分的利用基因組學的研究成果，分離植物營養代謝途徑的關鍵酶基因，解析植物微量營養素代謝途徑，深入了解代謝途徑的調控方式，從而利用代謝工程的方法和手段改良作物品質，提高作物營養價值。基於基因組學的基礎，維生素E合成途徑的基因分離、克隆和功能性研究已經取得了突破性的進展。人們已經初步完成了對參與維生素E合成途徑關鍵基因的分離和功能驗證工作，初步分析了維生素E(生育酚)合成途徑概貌。維生素E(生育酚)合成途徑主要由以下五個步驟組成。(1)4-羥苯丙酮酸(HPP)在4-羥苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的催化下，生成尿黑酸(HGA)(Norrisetal.，1998);(2)尿黑酸在尿黑酸植基異戊烯轉移酶(HPT)催化下，與植基二磷酸(PDP)發生縮合，生成2-甲基-6-植基-苯醌(CollakovaandDellaPenna,2001);(3)2-甲基-6-植基-苯醌在甲基植基苯醌甲基轉移酶(MPBQMT)的催化下，生成2，3-二甲基-6-植基-苯醌(vanEenennaametal.，2003);(4)2，3-二甲基-6-植基-苯醌在生育酚環化酶(TC)的催化下，生成Y-生育酚(Porfirovaetal.，2002);(5)Y-生育酚在Y-生育酚甲基轉移酶(Y-TMT)的催化下，生成a-生育酚。在對現有技術文獻的分析中，至今尚未發現有利用基因工程技術對生菜提高植物中維生素E含量的技術措施，也未發現與本發明提及的生菜HPPD蛋白序列及其核酸序列相關的報導。
發明內容本發明的目的在於克服現有技術中的不足,提供一種生菜HPT蛋白編碼序列。該基因編碼尿黑酸植基異戊烯轉移酶(HPT)，它參與維生素E的合成代謝途徑；生菜HPT蛋白在利用轉基因技術提高植物維生素E上的應用。本發明是通過以下技術方案實現的在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有生菜HPT蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列由SEQIDNO.34中第299-1483位的核苷酸序列構成，至少70%的同源性。所述的核苷酸序列由SEQIDNO.4胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物構成。所述的多肽是具有SEQIDNO.4序列的多肽。在本發明的另一方面，還提供了一種利用具有生菜HPT蛋白核苷酸序列轉化入植物提高植物維生素E含量的方法，其步驟如下(1)將編碼具有生菜HPT蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列連於植物表達調控序列，形成含生菜HPT蛋白基因的植物表達載體；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入農桿菌，將含表達載體的農桿菌通過浸花法轉化擬南芥；(3)再通過抗生素篩選，獲得含有生菜HPT蛋白基因的轉化細胞並最終再生轉基因植株及其包括植物種子及植物組織的後代。含有生菜HPT蛋白基因的轉基因植株中維生素E的含量有了顯著提高。較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQIDNO.3中第299-1483位的序列。在本發明中，"分離的"、"純化的"DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。在本發明中，術語"生菜HPT蛋白(或多肽)編碼序列"指編碼具有生菜HPPD蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.3中第299-1483位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQIDNO.3序列的編碼框第299-1483位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。該術語還包括能編碼具有與天然的生菜HPT相同功能的蛋白的SEQIDNO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為l-90個，較佳地1-60個，更佳地卜20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。在本發明中，術語"生菜HPT蛋白(或多肽)"指具有生菜HPT活性的SEQIDNO.4序列的多肽。該術語還包括具有與生菜HPT相同功能的、SEQIDNO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-IO個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。本發明的生菜HPT蛋白的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與編碼生菜HPT蛋白的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗生菜HPT蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。在本發明中，"生菜HPT蛋白保守性變異多肽"指與SEQIDN0.4的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行替換而產生。如下表l:tableseeoriginaldocumentpage6發明還包括生菜HPT蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然的生菜HPT相關多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如e、Y-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括:體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，可選用本領域巳知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產本發明的生菜HPT蛋白多肽時，可以將生菜HPT蛋白編碼序列可操作地連於表達調控序列，從而形成生菜HPT蛋白表達載體。如本文所用，"可操作地連於"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，"可操作地連於"意味著相鄰，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發明中，術語"宿主細胞"為真核細胞。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、擬南芥細胞和其它植物細胞。此外，根據本發明的生菜HPT的核苷酸序列和胺基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質的同源性基礎上，篩選生菜HPT蛋白相關同源基因或同源蛋白。本發明的生菜HPT相關核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技7術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工化學合成的方法來合成有關序列。在本申請之前，現有技術已完全可以通過先合成多個多核苷酸小片段，然後再進行連接而獲得編碼本發明中生菜HPT相關蛋白的核酸序列。然後，可將該核酸序列引入本領域中各種現有的DNA分子(如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。除了用重組法產生之外，本發明蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產(Stewart等人，(1969)Solid-PhaseP印tideSynthesis,冊FreemanCo.,SanFrancisco;MerrifieldJ.(1963)J".AmChem.Soc85:2149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity,CA)來自動合成肽。可以分別化學合成本發明蛋白的各片段，然後用化學方法加以連接以產生全長的分子。利用本發明的生菜HPT蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與HPT蛋白發生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。本發明中所涉及的農桿菌為根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV3101，該菌株可以從市場上公開購買(來源於澳大利亞CAMBIA公司，菌株編號為Gambar3)。圖1為本發明的生菜HPT蛋白的胺基酸序列與其他物種中HPT相關蛋白的胺基酸序列的同源比較列表。其中，相同的胺基酸在不同多肽序列之間用胺基酸單字符標出。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，8通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1生菜HPT基因的克隆1.RNA的提取(RNAextraction)取生菜葉片組織，置於液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEppendorf(EP)離心管中，充分振蕩後，按照TIANGEN試劑盒的說明書抽提總RNA。用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量，然後在分光光度計上測定RNA含量。2.基因的全長克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根據擬南芥中相關基因所編碼的胺基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，採用RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)方法(Clontech)試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)首鏈cDNA的合成利用Clontech試劑盒所提供的5'-CDSprimerA和SMART2Aoligo引物，以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉錄酶的作用下合成5'-RACE-ReadycDNA;利用Clontech試劑盒所提供的3'-CDSprimerA為引物，以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉錄酶的作用下合成3，-RACE-ReadycDNA。(2)3'-RACE:用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用擬南芥同源區設計的基因特異引物2(GSP2)(SEQIDNO.l)進行3'-RACEPCR反應。用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測並對產物進行膠回收，將膠回收的目的片段連接到pMD18-T載體上進行測序。(3)5，-RACE:用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用擬南芥同源區設計的基因特異引物l(GSPl)(SEQIDN0.2)進行5'-RACEPCR反應。用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測並對產物進行膠回收，將膠回收的目的片段連接到pMD18-T載體上進行測序。將測序結果的重疊區拼接，得到該基因的完整編碼區序列。BLAST分析及測序結果證明從生菜中得到的基因確為HPT基因。通過上述步驟，獲得了生菜中參與維生素E合成的HPT蛋白的全長編碼序列(SEQIDNO.3)。其中，(ATG)與終止密碼子(TGA)在SEQIDN0.3中用下劃線標出。實施例2生菜HPT相關基因的序列信息與同源性分析本發明中得到的新的生菜HPT的全長cDNA長度為1670bp，詳細序列見SEQIDNO.3，其中開放閱讀框位於299-1483位核苷酸(1185個核苷酸)。根據所獲得的cDNA推導出生菜HPT的胺基酸序列，共395個胺基酸殘基，分子量為44kD，等電點為9.66。詳細序列見SEQIDNO.4。利用vectorNTI9.0軟體對來源於各種植物的HPT的相關胺基酸序列進行同源比對，結果發現，克隆到的生菜HPT基因與擬南芥Ura&WoASi'sMah'a朋)，紫花苜蓿(ifeWca《。satJ'ra)，大豆(67yc/"e鵬力，玉米(Zea鵬ys0，綠藻(fl7〃c^arz7w50禾口兩禾中藍藻(5y/7ec力ococc〃s，5)77ec/oc/5^'s)中同源基因所編碼的胺基酸序列相似性分別為66%，62%，61%，61%，36%，36%和33%(圖1)。由此可見，生菜HPT基因與擬南芥等物種中的HPT相關基因在所編碼的胺基酸水平上存在較高的同源性，可以認為它們的產物在功能上也有很高的相似性。實施例3生菜HPT相關蛋白或多肽在擬南芥細胞中進行真核細胞表達及轉基因植株的維生素E含量鑑定l.含目的基因(生菜HPT基因)的表達載體的構建根據生菜HPT的全長編碼序列(SEQIDNO.3)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，並在正反引物上分別引入BamHI和SacI限制性內切酶位點，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的5'-RACE-ReadycDNA為模板，經PCR擴增後，將生菜HPT的編碼區序列連接至中間載體pMD18-T中進行測序，再將測序正確的HPT的編碼區序列進一步克隆到表達載體pHB中，接著將其轉入根癌農桿菌(如GV3101，本實施例中所用為英國諾丁漢大學所贈)，並進行PCR驗證。結果表明，含生菜HPT基因的植物表達載體已成功構建到根癌農桿菌菌株中。採用浸花10(floral-dip)法轉化擬南芥。2.採用浸花(floral-dip)法轉化擬南芥1)取生長一個月左右、生長狀況良好的植株(轉化前可以提前一個星期將植物去頂，使植物產生較多的花苞，提高轉化效率)，轉化前一天澆水；2)將含有轉基因載體的農桿菌於28。C培養過夜，至0D6。。"2.0，4，500rpm離心10min;3)菌體沉澱懸浮於新鮮配製的轉化液中，至終濃度0D6。。&0.8;4)轉化時小盆倒置，確保擬南芥地上部分全部花苞都被浸沒入事先用轉化Buffer懸浮好的菌液中約5sec;5)用吸水紙吸去多餘的液體，將植物平放於一個密封的小盒內以保持溼度，避光過夜；6)第二天將植物取出，豎直，轉移到正常條件下生長。待植物長至一定程度後，將其依附竹籤綁好，以便更好地結實；7)T。代種子成熟後將其整株剪下，過篩。種子鋪於含50pg/mL潮黴素(Hyg)的篩選培養基上，4。C春化48h，移到人工氣候室24h連續光照條件下生長一周；8)待長出綠色的轉基因抗性幼苗(轉化子為綠色的幼苗且根較長；非轉化子基本為黃化苗，或綠色無根幼苗)後移栽入土繼續生長；9)單株收穫轉基因植株(因轉基因的插入位點不同，每個都是不同的)標成不同的株系；10)單株收穫的L代種子已經出現性狀分離。將種子均勻地鋪到9cm平板上，因要確定是否是單位點插入，所以不加抗生素。待長至6-7片真葉後，噴除草劑，篩選3:1單位點插入的株系，單株收穫。繼續篩選直至獲得純合的轉基因植株。3.轉基因擬南芥植株的PCR檢測根據CaMV35S的序列設計正向引物，根據HPT的序列設計反向引物對目的基因進行檢測。結果表明，用CaMV35S正向引物和HPT反向引物能擴增出目的基因大小的特異DNA片段。而以非轉化擬南芥基因組畫A為模板時，沒有擴增出任何片段。實施例4利用HPLC-UVD測定轉基因擬南芥中維生素E含量1.HPLC-UVD條件及系統適用性以及標準溶液的配製HPLC:採用Waters2695s印arationsmodule系統，色譜柱為C-18反相矽膠柱(CalesilODS-100C18，4.6mmI.D.X250國length)，流動相為甲醇水，甲醇水的體積比為98:2，柱溫為30。C，流速1.0mL/min，進樣量30唚。UVD:採用Waters2996photodiodearraydectector系統，紫外光檢測器檢測波長292nm。精密稱取生育酚標準品(Sigma公司)2.0mg用lmL甲醇完全溶解，得到2mg/mL生育酚標準品溶液，保存於-2(TC備用。本發明中流動相為甲醇(methanol):水，比例為98%:2%時，生育酚的出峰時間為26.3min，峰型良好。2.標準曲線的製作將所述對照品溶液在相應色譜條件下分別進樣5pL,10HL，15pL，20pL，3(VL記錄圖譜及色譜參數，分別以峰面積(Y)對標準品含量(X，pg)進行回歸分析。通過研究，本發明中生育酚在10-60叫範圍內呈現良好的log-log線性關係。生育酚對照品的log-log線性回歸方程為Y=7.26e+002X+1.09e+004;R=0.999740。3.樣品的製備和生育酚含量的測定生育酚的提取過程如下取少量新鮮的擬南芥葉片(1-2g鮮重)，液氮研磨，用4mL正己烷提取，超聲30分鐘。離心，收集上清液，用氮吹儀吹乾，用適量甲醇溶解提取物，用於HPLC檢測。採用HPLC-UVD測定生育酚含量，樣品進樣體積為30|al，根據峰面積代入線形回歸方程計算出樣品中的生育酚含量(mg)，折合成物質的量(pmol)，再除以樣品的擬南芥葉片鮮重(mg)，從而計算出擬南芥植株中生育酚的含量。在本發明中HPT基因的轉化顯著提高了擬南芥葉片中維生素E含量，這使得轉基因植株中維生素E的含量超過對照的5(^以上。由此可見，HPT基因可作為一種提高植物營養價值的候選基因。用於利用轉基因技術提高作物維生素E含量的研究和產業化生產中。本發明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQIDNO.1的信息(i)序列特徵(A)長度26bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述:SEQIDNO.15'-GGTGTCTTTGAGGCGATTGTTGCTGC-3'(2)SEQIDN0.2的信息(i)序列特徵(A)長度:28bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQIDNO.25'-GGCCATGAACCAACMTCCATCCAAGAG-3(3)SEQIDNO.3的信息(i)序列特徵(A)長度1670bp(B)類型核苷酸(C)鏈性:單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核苷酸(iii)序列描述:SEQIDNO.313TTTTTTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(4)SEQIDN0.4的信息(i)序列特徵(A)長度395胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性:單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(iii)序列描述SEQIDNO.4MKSLIIGSFTSNVsVHsPPLPNSPSVFVSAGSHVSRSSKGNRVIRcEssLVRHNLSSFNESFFSRKRNTNHVANAVSEQpIEpEsSSPQKLLPNAFDAFYRFSRPHTVIGTVLSILSVSAIQKLSDFSPFFIGVFEAIVAAFFMNIYIVGNQLSDIEIDKVNKPYLP14ASGEYSVKTGVIALFISFGTAYRAVIVQIAFYLHSFFSVVIAFKDVFWICIEVAHAILGMLWGRAAEYEIPVRIVSSFAFMSFTLSINMPMLRWKRFIQTFVYGRLAVFIPDIVGDKIFGIYGVAILVGASSPKSTDLESKSAITGWIVGSWPLFWALVAAMCILAVPKPVIFATGFMQSFTVRGQKRFWSRYITVMGSFYMFI沐QLFY權利要求1.一種生菜HPT蛋白編碼序列，其特徵在於，包括編碼具有生菜HPT蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列由SEQIDNO.3中第299-1483位的核苷酸序列構成，至少70％的同源性。2.如權利要求1所述的生菜HPT蛋白編碼序列，其特徵是，所述的核苷酸序列由SEQIDNO.4胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物構成。3.如權利要求1所述的生菜HPT蛋白編碼序列，其特徵是，所述的多肽是具有SEQIDNO.4序列的多肽。4.如權利要求1所述的生菜HPT蛋白編碼序列轉化入植物提高植物維生素E含量的方法，其特徵是，步驟如下(1)將編碼具有生菜HPT蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列連於植物表達調控序列，形成含生菜HPT蛋白基因的植物表達載體；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入農桿菌，將含表達載體的農桿菌通過浸花法轉化擬南芥；(3)再通過抗生素篩選，獲得含有生菜HPT蛋白基因的轉化細胞並最終再生轉基因植株及其包括植物種子及植物組織的後代。全文摘要本發明涉及一種基因工程
技術領域：
的生菜HPT蛋白編碼序列。它包括編碼具有生菜HPT蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列由SEQIDNO.3中第299-1483位的核苷酸序列構成，至少70％的同源性。本發明轉化入植物提高植物維生素E含量的方法將編碼具有生菜HPT蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列連於植物表達調控序列，形成含生菜HPT蛋白基因的植物表達載體；將步驟(1)中的表達載體轉入農桿菌，將含表達載體的農桿菌通過浸花法轉化擬南芥；再通過抗生素篩選，獲得含有生菜HPT蛋白基因的轉化細胞並最終再生轉基因植株及其包括植物種子及植物組織的後代。本發明將所說的基因在植物中表達，所獲得的轉基因植物中維生素E的含量有了顯著的提高。文檔編號C12N15/82GK101586110SQ20081020344公開日2009年11月25日申請日期2008年11月27日優先權日2008年11月27日發明者任薇薇,唐克軒,唐嶽立申請人:上海交通大學