用於治療肝細胞癌的藥物組合物和藥劑盒的製作方法

2023-09-22 15:01:00

專利名稱：用於治療肝細胞癌的藥物組合物和藥劑盒的製作方法
技術領域：
本發明提供用於治療肝細胞癌(HCC)的包括Notch3抑制劑和化學療法藥劑的藥 物組合物，用於製備所述組合物的方法和包括對有需要的患者施用所述藥物組合物的醫學 治療。
背景技術：
肝細胞癌在全世界所有人類癌症中發病率佔第五位，每年引起一百萬人死亡。盡 管有很多有前途的治療方法可選擇，其包括外科切除、乙醇或射頻消融、化療栓塞、和肝移 植，但在晚期疾病患者中的長期預後依然不足。目前，栓塞是非切除性的HCC最廣泛使用的初級治療，其用於等待肝捐贈的患者 以預防HCC的發展的最常使用的治療，所述HCC的發展會排除移植。栓塞劑通常與選擇性 的內動脈細胞毒素一起施用，其中最常使用的是阿黴素。儘管這種療法明顯推遲腫瘤進程 以及血管入侵，這個方法僅在患者中得到部分響應。儘管有新治療形式的近期發展，發現克服對HCC的化學療法藥劑的抵抗的治療分 子需要依然很緊迫。Notch受體包含在增殖、分化和凋亡中。由於在人類癌症中Notch信號 通路的異常失控的增加的跡象，Notch受體為用於選擇性殺死惡性細胞的潛在標靶。四個已知的Notch受體(Notchl-4)是單次跨膜受體，在發育的所有時期介導信號 從細胞表面至細胞核以調節增殖、分化和凋亡。Notch受體主要由Delta和Serrate/jagged 家族跨膜配體激活，跨膜配體在相鄰細胞表面表達。配體介導的Notch的活化誘導Notch 細胞內區域(Ni⑶)的蛋白水解斷裂和核轉運，NI⑶結合至轉錄因子CBFl/RBP-Jk反式激 活靶基因，包括HESl。已經報導在多種不同的人類腫瘤中失控的Notch受體的表達。已經在人類的乳房 癌、胰腺癌以及霍奇金淋巴瘤中觀察到增加的Notchl蛋白的表達。已經在惡性黑色素瘤、 胰腺癌和乳房癌中發現Notch3和Notch4的過量表達。Notchl信號通路在大白鼠肝臟再生中被激活，並發現Notchl的過量表達抑制體 外和體內的HCC細胞生長。看來Notchl的組成型活化可以通過誘導細胞生長停止，在小細胞肺癌細胞中、前 列腺癌細胞中和小鼠皮膚中，作為腫瘤抑制物起作用。近期發現Notch3在人類H印G2肝癌細胞系中高度表達，但到目前為止，沒有關於 Notch3在HCC中的作用的研究。在腫瘤領域，基因治療代表新的以及有前途的策略，該策略依賴於將基因材料轉 移至細胞中以產生抵抗疾病的有益效果。小幹擾RNA(SiRNA)是利用所有細胞的自然性質， 通過促進目標mRNA的降解或翻譯的消除來指導特定基因沉默的新興技術。在過去的幾年 中，已開發多種手段來表達和傳遞短髮夾環RNA(shRNA)，通過哺乳動物細胞的天然的RNA 加工機制有效地轉化成siRNA。因此，由於已確定的相對於它們靶mRNA的高特異性，研究特 異性shRNA以用於抵抗包括癌症的多種人類疾病的潛在的新療法的開發。
儘管已知Notch受體，依賴於它們在多種細胞環境中的表達水平，在惡性細胞的 凋亡抵抗中起重要作用，它們的作用機理仍然很大程度上未知，因此限制了抵抗與所述受 體相關的腫瘤醫學治療的可能性。關於HCC，抵抗以上列出的所述疾病的醫學限制，在醫學領域，加重了對提供抵抗 HCC惡性細胞的擴散和存在的有效治療的藥物的需要。

發明內容
在本發明中，研究了人類HCC組織樣品和相鄰的無HCC組織中Notch受體的表達； 並且評估了在H印G2細胞中，通過shRNA消除Notch3表達的生理學效果。已發現Notch3 選擇性地在HCC中表達，而在周圍的無HCC組織中不表達。與之前在HCC細胞系中的研究一致，該研究表明Notchl過量表達通過p21上調抑 制細胞生長，本發明的作者通過免疫印跡分析發現，通過目標shRNA敲除的Notchl表達的 缺失極大地減少了 P21蛋白表達(圖6)。但是，與基於已知技術和在HCC中獲得的Notch受體的其它結果相反，令人驚訝地 發現，通過目標shRNA或通過抗Notch3抗體的Notch3活性的抑制，沒有改變IfepG2生長速 率。本文中，細胞生長參數在轉染後一周通過碘化丙啶染色和流式細胞儀估定。獲得的結 果顯示，在H印G2細胞中，Notch3的敲除引起磷酸化的p53的積聚和p21的抑制，對細胞生 長或存活沒有明顯效果。因此，與Notchl相反，Notch3沒有顯現出對人類HCC增殖的貢獻， 至少在這個體外環境中。引入注目地，通過臺盼藍染色排除試驗顯示，穩定表達Notch3shRNA (相比較於熒 光素酶shRNA陰性對照)的HepG2細胞的死亡率用阿黴素(或其它用於癌症治療的分子) 處理6和24小時分別成兩倍和三倍(圖3)。另一方面，如圖10中所示，Notchl的消除對藥物誘導凋亡中沒有可論證的效果。因此，Notch3的表達，通過阻止p53依賴的凋亡的活化，至少部分地作為多藥抗性 的特定的陽性效應物起作用，以及作為結果，造成HCC對化學療法或其它環境脅迫具有抗性。因此，本發明的目的是用於治療肝細胞癌的包括Notch3抑制劑、抗腫瘤化學療 法藥劑和藥物學合適載體的藥物組合物，用於所述組合物製備的方法以及包括向需要的患 者施用所述組合物的醫學治療。


圖1.相對於相鄰的無HCC肝臟組織，在HCC中增加的Notch3免疫反應性。含有 HCC和周圍的無腫瘤肝臟的福馬林固定的石蠟切片用抗Notch3多克隆抗體免疫染色。免 疫反應性用HRP兔子EnVision系統顯示，二氨基聯苯胺作為色原體(褐色沉澱物)。片段 用Mayer的蘇木精復染色。圖片是HCC(A、C)和周圍無HCC肝臟(B、D)用抗Notch3多克隆 抗體免疫染色的典型例子。圖2.蛋白和基因表達。(A)在!fepG2感染細胞中，Notch3、p53、p-p53、p21、 Gadd45 α、p27的Western印跡。密度計量分析顯示在Notch3細胞缺失的細胞中，p21水 平降低5倍，而p27 (2. 3倍)、Gadd45 (2倍)、p53 (5倍)和p-p53 (3. 2倍)的蛋白表達增力口。對於mRNA和蛋白水平，均使用β肌動蛋白作為參考對照。(B)Western印跡表明兩個 Notch3shRNA產生相等的滲透的Notch3敲除。(C)在表達shRNA的!fepG2細胞中，HESU P53和WAF的RT-PCR表達分析。進行了兩次獨立的實驗。CS :GL2陰性對照shRNA，N3S Notch3shRNA。圖3.處理後細胞存活率。感染的細胞用100μ g/ml阿黴素處理預定次數。每次 阿黴素處理後，計算臺盼存活率重複兩次，每個樣品計算至少200個細胞。兩個獨立實驗的 柱狀平均值；條紋，SE。CS :GL2陰性對照shRNA，N3S :Notch3shRNA。圖4.凋亡分析。培養的感染的H印G2細胞用100 μ g/ml阿黴素處理6小時、12小 時、18小時和24小時，然後進行蛋白提取。蛋白通過聚丙烯醯胺凝膠電泳分解，然後用單克 隆抗人分裂的PARP進行western印跡分析。β肌動蛋白用作蛋白水平參考對照。CS :GL2 陰性對照 shRNA，N3S :Notch3shRNA。圖5. DNA損傷和阿黴素吸收的分析。(A)通過彗星實驗檢測DNA損傷。感染的 !fepG2細胞在含有100 μ g/ml阿黴素的完全培養基中培養1、3、6、12、18個小時，隨後用彗 星實驗測量DNA鏈破損量。基礎DNA損傷(沒有阿黴素)顯示陰性對照H印G2細胞具有 與Notch3缺失細胞一樣的損傷(P = 0. 6686)。(B)阿黴素吸收。感染的細胞用100 μ g/ ml阿黴素處理不同次數，通過FACS實驗測量藥物吸收。Notch3缺失細胞比陰性對照吸 收明顯更高水平的阿黴素。兩個獨立實驗的柱狀平均值；條紋，SE。CS 對照shRNA，N3S Notch3shRNA。圖6.在Notchl缺失細胞中減少的p21表達。Western印跡分析證明，相比於陰性 對照(CS)，在Notchl缺失細胞(NlS)中，p21的水平降低和p53及p-p53的水平未變化。圖 7· p53 短幹擾 RNA。感染的細胞用 40nM p53siRNA 或 40nM零亂 siRNA(scRNA)轉 染，轉染後48小時和72小時通過western印跡評估p53的敲除。N3S :Notch3shRNA ；CS :GL2 陰性對照 shRNA ；scRNA 零亂 RNA。1、7 :N3S/scRNA ；2、8 :CS/scRNA ；3、5 :N3S/p53siRNA ；4、 6 :CS/p53siRNA。圖8.在Notch3缺失細胞中，p53siRNA降低對阿黴素的靈敏度。轉染後48和72 小時的細胞用100 μ g/ml阿黴素處理24小時。每次阿黴素處理後，計算臺盼存活率重複兩 次，每個樣品計算至少200個細胞。兩個獨立實驗的柱狀平均值；條紋，SE。CS:GL2陰性對 照 shRNA ；N3S :Notch3shRNA ；scRNA 零亂 RNA。圖 9. HESl 短幹擾 RNA。！fepG2 細胞用 40nM HESlsiRNA 或 40nM 零亂 siRNA 轉染， 轉染後72小時通過RT-PCR和western印跡分別評估HESl的敲除和p21蛋白水平。1 零 亂 RNA ；2、3 不同的 HESlsiRNA。圖10.在Notchl缺失細胞中，阿黴素處理後細胞存活率。250X 103感染的細胞 用100 μ g/ml阿黴素處理24小時，每次阿黴素處理後，計算臺盼存活率重複兩次，每個樣 品計算至少200個細胞。兩次獨立實驗的柱狀平均值，條紋，SE。CS 對照shRNA ；NlS NotchlshRNA。
具體實施例方式根據本發明，Notch3抑制能夠在轉錄後水平被誘導，通過與Notch3mRNA雜交的靶 標siRNA或shRNA或靶標的合成寡核苷酸(即，通過RNA幹擾，RNAi)，因此抑制Notch3受體的合成。短髮夾環RNA (shRNA)是穩定髮夾環形式的、在體內通過RNA幹擾沉默基因表達的RNA分子。shRNA髮夾環結構通過細胞加工機制剪切產生成熟的siRNA，其反義鏈被RNA誘導 的沉默複合體(RISC)特異吸收。之後的複合體結合mRNA並剪切mRNA，mRNA與包含在RISC 中的siRNA序列匹配，因此指導目標RNA降解。因此，所述抑制形成一個特定時期，由於預 先存在的受體將最終用盡而不能有效補充新合成的Notch3受體，導致Notch3受體從目標 細胞中缺失。可選地，受體可由使用抗Notch3抗體或分子抑制，抗Notch3抗體或分子影響 Notch3受體的功能，如，受體配體的拮抗劑。根據本發明的shRNA或siRNA可從已知的Notch3mRNA序列構建，或選自PCT申請 W02004047731中描述的那些或序列號1和2中的序列。這些RNA長度一般是21-23核苷酸，如在現有技術中報導的，長於30個核苷酸的 序列能夠引發抗病毒樣幹擾素反應，導致所有蛋白合成的停止。用於設計siRNA或shRNA的方案和操作可在線利用(例如http //www. genelink. com/sirna/shRNAi. asp、http//www. ambion. com/techlib/misc/psilencer_converter. html)。因此，本領域技術人員在設計適於完成本發明的RNA時沒有問題。所述shRNA可以插入任何適於基因治療的載體。shRNA表達載體已經使用病毒(包 括逆轉錄病毒、腺病毒和慢病毒載體)和質粒系統製造。這些載體使用來自小類別pol. III 啟動子的啟動子以驅動shRNA的表達。所有的載體必須包括人類polIII啟動子。人類U6 啟動子是研究的最好的常用於RNAi的類型III pol啟動子。shRNA由Exportin5從核中輸出，Exportin5識別短RNA環。一旦在細胞質中，通 過另一個術語為Dicer的RNaseIII酶剪切，前體miRNA和shRNA被加工成siRNA雙鏈複合 物。重要地，Dicer結合shRNA基部，在莖上剪切21或22nt，留下另一個3』突出的2nt，並 形成siRNA雙鏈複合物結構。RNA雙鏈複合物由RNAi誘導的沉默複合體(RISC)吸收。RISC 放開雙鏈RNA和含有相關反義鏈的活化複合體。在逆轉錄病毒中的遺傳材料是RNA分子形式，而它們宿主的遺傳材料是DNA的形 式。當逆轉錄病毒感染宿主細胞，將把它的RNA和一些酶一起轉進細胞。在它可以被認作 是宿主細胞遺傳材料的一部分之前，這個來自逆轉錄病毒的RNA分子一定產生來自它的 RNA分子的DNA拷貝。從RNA分子產生DNA拷貝的過程定義為逆轉錄。它通過病毒中攜 帶的一種酶，叫做反轉錄酶實現。在這個DNA拷貝產生以及釋放在宿主細胞核中後，它一 定通過使用另一種攜帶在病毒中被稱為整合酶的酶融合進宿主細胞的基因組中。使用逆 轉錄病毒的基因治療的一個問題是整合酶能夠將病毒遺傳材料插入宿主基因組的任何位 置。如果遺傳材料恰好被插在宿主細胞的一個原始基因的中部，這個基因將被破壞(插入 突變)。如果該基因恰好是調控細胞分裂，將產生不受控制的細胞分裂(如癌症)。本領 域最新的技術已經公開了使用鋅指核酸酶或包括特定序列例如β球蛋白基因座控制區以 指導在特定染色體位點融合的逆轉錄病毒載體的應用。但是，本領域技術人員可以知道， 在本領域發展的水平中從哪裡尋找跡象用於構造適用於本發明的藥物組合物的載體。用 於所述RNA的表達和靶定的載體、試劑盒構建載體和載體構建的操作是本領域公知的，例如，INGENEX GeneSuppressorRetro構造試劑盒，或線上可用的，或在以下文獻中描述的 GJ.等(2003) 「表送用於基因功能的發現和確認的siRNAs的腺病毒載體」，《基因組研究 (Genome Res.)》，13 :2325_2332，證明基於腺病毒的shRNA在多種細胞類型中表達，包括 原始細胞。Matta，H等(2003) 「用於小幹擾RNA傳遞的慢病毒載體的應用」，《癌生物治療 (Cancer Biol. Ther))), 2 :206_210，其中作者用 Invitrogen' spLenti6骨架表達 shRNA盒。 Tiscornia, G.等(2003) 「使用表達小幹擾RNA的慢病毒載體在小鼠中基因敲除的常規方 法」《美國國家科學院院刊》，100 :1844-1848，證明了用於傳遞shRNA至細胞和小鼠的慢病 毒載體的效用。
有利地，本發明的載體可以包括僅在腫瘤中驅動shRNA或SiRNA在細胞中表達的 腫瘤特異性啟動子，或者可以替代地包括現有技術已知的肝臟特異性啟動子，如清蛋白、 α 1抗胰蛋白酶、人類胰島素樣生長因子II。肝臟特異性啟動子的詳細列表可以在肝臟特 異性啟動子資料庫(http://rulai.cshl.edu/LSPD)中找到，以使得本領域技術人員驅動 逆轉錄病毒載體僅在肝臟中表達，即是Notch3抑制劑。這個具體實施方式
是非常有利的， 因為Notch3已經在這裡被證明僅僅在HCC細胞中被表達，在健康或甚至肝硬化肝臟細胞中 不表達。因此，根據本發明的Notch3的抑制可以不引起瘤節周圍無HCC的肝細胞中不想要 的分子改變。這是特別適用，由於在肝細胞癌患者中的高度的肝硬化。本發明的藥物組合 物能夠因此實現靶定的抗癌症治療，與目標為反向推進慢性肝病進程的方法結合，以達到 使多數患者長期生存。本發明包括這樣的載體的藥物組合物的優點在於它能夠僅在腫瘤中增加化學療 法藥物的細胞凋亡效果的事實，從而明顯降低藥物對周圍健康的或甚至患病的非瘤細胞的 副作用。同樣適用於本發明的Notch3抑制劑表示為抗Notch3抗體或由這裡描述的任何其 它實施方式。通常，本發明的藥物組合物非常有利，藥物的當前使用劑量可以由於它僅在表達 Notch3惡性細胞中的效果的增加而減少。合成的寡核苷酸在分子生物學的研究、醫療診斷、 以及新治療藥劑的開發中很有用。事實上，它們在基因治療中的應用產生被定義為反義的 新領域，提供新一代藥物的合成。該過程基於通過寡核苷酸與mRNA的耦合來達到主體所表 達的蛋白被阻斷，因此通過不同途徑抑制基因表達。醫學中，在人類藥物試驗中使用反義技 術已經開始，特別是作為抗病毒和抗白血病藥劑。因此，作為對RNA幹擾的選擇，Notch3可以通過使用合成寡核苷酸而被抑制。這 樣的合成寡核苷酸能夠裝載在脂質體/DNA複合體中，且通過門靜脈注射直接傳遞至肝臟。在本發明的實施方式中，將本發明的合成寡核苷酸傳遞至細胞是通過脂質體/DNA 複合體(lipoplexes)或多聚物(polyplex)的構造完成，由於它們具有保護寡核苷酸在轉 染過程中避免不希望的降解的能力。寡核苷酸，可以在類似膠囊或脂質體的組織結構中用脂質覆蓋。當組織結構與核 酸聯合，它被稱為脂質體/DNA複合體。有三種類型的脂質，陰離子的(負電荷)、中性或陽 離子的(正電荷)。起初，陰離子和中性脂質用於合成載體的脂質體/DNA複合體的構造。 陽離子脂質，由於它們的正電荷，自然地與負電荷核酸聯合；並且它們比中性脂質的陰離子 消耗少的時間去製備。另外，由於它們的正電荷，它們也與細胞膜相互作用，推動它們的細胞內吞作用和隨後的細胞核向細胞質的釋放。陽離子脂質同樣保護經由細胞的核酸避免降解。本領域技術人員可以很容易在本領域找到實現本發明的脂質體/DNA複合體的方案。脂質體/DNA複合體最常的應用是基因向癌細胞的轉移，其中提供的基因激活細胞中癌抑制劑控制基因和減少致癌基因的活性。新的研究已經顯示脂質體/DNA複合體在 轉染的呼吸道上皮細胞中有作用，所以它們可以用於遺傳性的呼吸道疾病的治療，如囊腫 性纖維化。在本發明的另一個實施方式中，Notch3抑制可以通過使用作為抑制劑的如抗 Notch3抗體或Notch3受體拮抗劑或任何其它能夠阻滯Notch3受體的功能的分子完成。根據本發明，抗腫瘤化學療法藥劑可以從任何合適的已知的引起細胞凋亡或在細 胞增殖中起作用的化學療法藥劑中選擇，但是並不限於這些；化學療法藥劑可以在包括阿 黴素、5氟二氧嘧啶、紫杉醇、伊立替康、Patupilone、依維莫司、多激酶抑制劑(索拉非尼和 舒尼替尼)、EGFR抑制劑(西妥昔單抗、埃羅替尼、吉非替尼、Brivanib、拉帕替尼)的組中 選擇。本發明的藥物組合物可以以適於靜脈內或組織內注射的形式製備，它的製備包括將 Notch3抑制劑與一種或多種如本發明所定義的抗腫瘤藥物和藥物學接受的載體混合的步 馬聚ο可選地，兩種活性化合物從兩個分開的小瓶開始共同施用，或同時，或當抑制劑通 過Notch3mRNA的轉錄後抑制起作用，抑制劑可以在抗腫瘤化學療法藥劑的前6_48小時施用。因此，本發明的目的同樣是用於治療肝細胞癌的、用於共施用Notch3抑制劑、抗 腫瘤化學療法製劑和藥物學可接受的載體的藥劑盒，所述藥劑盒包括兩個小瓶，其中一個 小瓶包含Notch3抑制劑和藥物學可接受的載體，另一個小瓶包含抗腫瘤化學療法藥劑和 藥物學可接受的載體。根據本發明，包含Notch3抑制劑的小瓶包含Notch3抑制劑，Notch3抑制劑從包括 與編碼Notch3的mRNA互補的siRNA、與編碼Notch3的mRNA互補的shRNA、與編碼Notch3 的mRNA互補的合成寡核苷酸或抗Notch3抗體或Notch3拮抗劑的組中選擇。所述siRNA或 shRNA將插入本發明的病毒載體中，而合成寡核苷酸將與合適的脂質聯合形成脂質體/DNA 複合體。包含化學療法藥劑的小瓶將包括化學療法藥劑，化學療法藥劑從包含阿黴素、5氟 二氧嘧啶、紫杉醇、伊立替康、Patupilone、依維莫司、多激酶抑制劑(例如索拉非尼和舒尼 替尼)、EGFR抑制劑(例如西妥昔單抗、埃羅替尼、吉非替尼、Brivanib、拉帕替尼)的組中 選擇。通常，當組合物包括RNA Notch3抑制劑，所述RNA將插在如上描述的合適的病毒載 體中。因此，本發明的藥物組合物將包括上述提到的載體和在本說明書中指出的一種或 多種抗腫瘤藥劑。當由本發明的寡核苷酸完成抑制，所述寡核苷酸將被複合進脂質體/DNA複合體， 所述脂質體/DNA複合體將在藥物學可接受的適於靜脈內注射溶液中與一種或多種抗腫瘤 化學療法藥劑(阿黴素、5氟二氧嘧啶、紫杉醇、伊立替康、Patupilone、依維莫司、索拉非尼、舒尼替尼、西妥昔單抗、埃羅替尼、吉非替尼、Brivanib、拉帕替尼)一起 懸浮。假設是抗Notch3抗體，該抗體將在藥物學可接受的適於靜脈注射的溶液中與一 種或多種所述的抗腫瘤藥劑一起懸浮。同樣用於當Notch3拮抗劑或任何其它能夠封閉Notch3作用的分子被用作Notch3 抑制劑。本發明的抗腫瘤化學療法成分的劑量可以減少2-3倍，由於在Notch3抑制的環境 中所述藥物的效果2-3倍增加。本發明的藥物組合物可以有利地進一步包括用於其它肝臟疾病治療的化合物，所 述其它肝臟疾病與HCC並存，例如用於肝硬化治療的化合物和其它。用於本發明的組合物的製備的方法因此包括以下步驟a.選擇功能性Notch3抑 製劑，所述抑制劑的特徵為抑制Notch3受體的合成或抑制Notch3受體的功能；b.將a.中選擇的抑制劑與一種或多種抗腫瘤化學療法藥劑和藥物學可接受的載 體混合。當抑制劑是RNA，所述RNA將插在之前指出的合適的載體中，以使得所述RNA在肝 細胞中表達。本發明還包括上述藥劑盒製備的方法，包括步驟a.製備包含Notch3抑制劑和藥物學可接受的載體的第一個小瓶；b.製備包含一種或多種抗腫瘤化學療法藥劑和藥物學可接受的載體的第二個小瓶。抑制劑和化學療法藥劑將是本說明書中描述的那些。本發明的目的同樣是HCC的醫學療法，包括對需要的患者施用上述藥物組合物， 以治療上有效的劑量或共施用本發明的藥劑盒的小瓶的內含物，其中第二個小瓶可以與第 一個小瓶一起施用或在第一個小瓶施用的6-48小時內施用。在本發明的有利的實施方式中，醫學治療將通過注射本發明的藥物組合物或本發 明的藥劑盒的第一和第二個小瓶至門靜脈中以直接傳遞至肝臟而實現。本發明的HCC的治療同樣有利地與上面解釋的肝硬化的治療結合。實施例1、患者和方法20名進行HCC手術的患者(12名男性和8名女性)進入該研究。根據NIH的指導 方針和最新版的赫爾辛基宣言從每名患者處獲得知情同意。在分析之前，所有患者標識符 從所有組織樣品中移除。組織樣品在10%福馬林中混合，並包埋在石蠟中用於組織病理 學檢查和免疫組織化學。20個例子中13個存在肝硬化(CE)；剩餘的例子表現出正常肝臟 (2個例子)或慢性活動性肝炎(CAH，5個例子)。慢性肝炎的原因，9個例子歸結於HCV，5 個例子歸結於HBV，4個例子歸結於HBV和HCV共感染。由其它正常肝臟產生的HCC的2個 例子中沒有發現病毒標記。根據埃德蒙森和斯坦納的標準(31)評價HCC的組織病理學等 級。1個例子被評估為G1，5個例子為G2，12個例子為G3，剩下2個例子為G4。2、免疫組織化學將福馬林固定、石蠟包埋的HCC及相鄰的無腫瘤肝臟切片(4i!m厚)免疫染 色，以探測Notch受體。識別Notch3、Notch4的一抗從SantaCruz生物技術(Santa Cruz,CA)中獲得，而用於Notchl的一抗從Abcam(Ab8925)中獲得。將多克隆一抗稀釋如下 Notchl(l 600)、Notch3(l 300)以及 Notch4(l 400)。用 HRP (辣根過氧化物酶)兔 子En Vision系統(DAKO，Denmark)和DAB (二氨基聯苯胺)作為色原體(Sigma，聖路易， 美國)顯示免疫反應。固定好的載玻片通過光顯微鏡法檢查，並使用3級系統評估免疫反 應，其中0表示沒有著色，1表示最小著色，2表示均質和強烈著色。僅具有第2級免疫反應 的樣品被認為是陽性。3、細胞培養HCC IfepG2細胞系從美國標準培養物收集所(HB-8065，ATCC，洛克維爾，馬裡蘭州， 美國)中獲得。細胞在補充有10%胎牛血清(FBS)、100U/ml的青黴素和100mg/ml的鏈黴 素(所有試劑均來自ATCC)的Eagle極限必需培養基(MEM)中，在37°C，5% C02培養器中保存。4、shRNA的逆轉錄病毒轉導以shOligo表示的shRNA(短髮夾環RNA)根據生產商的說明(OligoEngine， Seattle, WA) (32)插入在pSuper. pure表達載體中。對於Notch3和Notchl受體中 的每一個，我們製備了兩個shOligos，以排除非靶shRNA效應的可能性。在Notch3和 Notchl 中兩對革巴序列如下Notch3(#l) :5，一ctcccctcaccacctaataaa—3，；Notch3 (#2) 5，-gggggacctgccgccgtggctata-3，；Notchl (#1) :5，-ggccgtcatctccgacttca-3，； Notchl (#2) :5』 -gcctcttcgacggctttga-3'。對於陰性對照，我們製備包含表達GL2螢光素 酶特異的shRNA的pSuper. puro前病毒的HepG2細胞群(33)。通過使用磷酸鈣沉澱方法(34)通過將pSuper. puro表達載體轉染進Phoenix A 包裝細胞(由Gary Nolan博士友情提供)中製備逆轉錄病毒。在轉染後48小時和72小時收集病毒上清液，匯集、過濾(孔尺寸0.45i!m)並保 存在_80°C。感染前一天，每個平板6孔，每孔接種50-70，000個H印G2細胞。為達到 有效的逆轉錄病毒轉導，將未稀釋的病毒在8 yg/ml聚凝胺(Sigma)存在下，通過 spinoculation(32°C、2200RPM離心45分鐘)施加於細胞，然後在32°C孵育5小時。病毒 上清液隨後用新鮮的完全培養基代替，細胞在37°C恢復48小時。在含有1. 8 u g/ml嘌呤黴 素的生長培養基中篩選穩定感染的細胞群。嘌呤黴素的抗性通常在篩選4天後獲得，其中 變換兩次培養基。5、小幹擾RNA的轉染轉染前24小時，Notch3shRNA和GL2感染的細胞接種在無抗生素的MEM 的6孔板中。生長至40 %匯集的H印G2細胞用40nM的有效的p53siRNA和零亂 RNA(scRNA) (Invitrogen)轉染。轉染前，馬上將培養基移除，根據生產商的建議，使用 Lipofectamine2000和Opti-MEM培養基(invitogen)完成轉染。轉染後5小時，培養基用 新鮮的包含培養基的血清代替。通過用螢光素標記的siRNA(Invitrogen)的轉染測定轉染 效率是90%以上。在轉染後48小時和72小時收集細胞，通過Western印跡或採用阿黴素 處理24小時以檢查p53蛋白的表達。隨後通過臺盼藍染色評估細胞的存活率。雙向合成用於沉默人類HES1的兩條siRNA序列，用40nM每種siRNA瞬時轉染 HepG2細胞後72小時，評估HES1抑制。
6、阿黴素處理HepG2細胞的穩定轉染的細胞群接種在6孔器皿中，並附著24小時，清洗並培養 在含有100 ii g/ml阿黴素(Sigma)的新鮮的完全培養基中1、3、6、12、18和24小時。通過 FACS計算10，000個結果探測阿黴素融合。7、細胞死亡和細胞毒性分析用所附的阿黴素處理後，在培養基中收集懸浮H印G2細胞，離心成球，通過臺盼藍 染色估計細胞死亡程度。通過標準的、臨床LDH(乳酸脫氫酶)釋放試驗估定細胞壞死，該 試驗用未處理和阿黴素處理的細胞的培養基完成。8、RNA 分析根據生產商的說明，用Triazoldnvitrogen，Paisley，蘇格蘭)製備總細胞RNA。 4微克的總RNA用DNAsel (Invitrogen)處理以消除汙染的基因組DNA。在30 yl反應體系 中完成反轉錄至cDNAs，反應體系包括1XRT緩衝液、0. 4mM dNTPs、5mM二硫蘇糖醇(DTT)、 0. 5iiM 寡聚 dT、3iiM 隨機引物、240U Superscript II (所有試劑均來自 Invitrogen)。RT 反應在42°C、1小時下完成，然後95°C、5分鐘滅活酶。通過半定量終點PCR擴增測定P53、 WAF1、Notchl、HES1和0肌動蛋白基因的相對表達。PCR產物在用溴化乙錠染色的2%瓊 脂糖凝膠中分辨，通過螢光分析(Quantity one，Biorad，CA，美國)進行分析。PCR引物如 T" :WAF1 ( JE(n] 5' -aagaccatgtggacctgtca-3『以U^t^l 5' _ggcttcctcttggagaagat_3，)； P53 ( IE (n] 5' -gacccaggtccagatgaagct-3' Jk 5' -accgtagctgccctggtaggt-3')； HES1 (正向 5，-gctggtgctgtctggatg-3，以及反向 5，-cattcctgctctcgccttc-3，)。9、蛋白分析培養的細胞溶解在裂解緩衝液中，裂解緩衝液包括10mM Tris_HClpH7. 4、2. 5mM MgCl2U% TritonX lOOUmM DTT、0. ImM 苯甲基磺醯氟(PMSF)、lmM Na3V04、lmM NaF 和蛋白 酶抑制劑(Sigma化學公司，聖路易，M0)。溶解產物在4°C、15，000 X g離心15分鐘，通過 Bio-Rad蛋白試驗(Bio-Rad)分析上清液的蛋白濃度。蛋白在1 XSDS(十二烷基硫酸鈉) loading buffer (65mM Tris_HCl、pH7. 5，65mM 2-巰基乙醇，1 % SDS，10%丙三醇和0. 003% 溴酚藍)中95°C煮10分鐘，用聚丙烯醯胺凝膠分辨，點在硝化纖維膜(Hybond C Extra, Amersham Pharmacia, Little Chalfont，英國)上。膜用麗春紅溶液(Sigma)染色，在PBS 中 用5%脫脂奶粉封閉50分鐘，然後用適當的一抗孵育。一抗和稀釋物如下抗Notch3多克 隆抗體(sc-5593，Santa Cruz 生物技術)1 300，抗Gadd45 多克隆抗體(AB3863，Chemicon International, Temecula, CA) 1 1000，抗 p21 單克隆抗體(克隆 SX118，Dako) 1 100， 抗P53單克隆抗體(克隆D0-7，Dako)l 500，抗Kipl/p27單克隆抗體(克隆57，BD生 物科學，San Jose, CA) 1 2300，分裂的PARP單克隆抗體(9546，細胞信號技術，Beverly， MA) 1 200，抗 p-p53 多克隆抗體(sc-18079-R，Santa Cruz 生物技術)1 300，抗 Notchl 多克隆抗體1 200和抗3肌動蛋白單克隆抗體(克隆AC-40，Sigma) 1 1000。在含有0. 吐溫20的PBS(PBST)中反覆清洗後，使用EnVision右旋糖酐多聚 體顯示系統(Dako)將膜用抗鼠或抗兔的HRP結合的二抗孵育。將膜清洗，通過化學發光 反應(ECL試劑，Amersham)獲得放射能照相。用Fluor-S多重圖像掃描儀(BioRad)獲 得放射能照相的數字圖像，信號以使用參考放射能照相的光標度之後的吸收率單位、使用 Quantity-one密度計量學軟體(BioRad，Hercules, CA)測定數量。
10、彗星實驗通過鹼性彗星實驗定量DNA鏈的斷裂。主要地，在接觸阿黴素之後的不同的時間 點，將105細胞植入0.7%低熔點瓊脂糖中，並轉移至蓋有顯微鏡載玻片的瓊脂糖上。隨 後，將載玻片在新鮮的裂解緩衝液(2. 5MNaCl、100mM Na2 EDTAUOmM Tris-HCl、1 % Triton X-100、pH 10. 0)中4°C孵育1小時。然後將載玻片置於充滿冷凍的鹼性解鏈/電泳緩衝液 (300mM NaOH、lmM Na2EDTA、pH 13. 0)的水平凝膠電泳槽上，25 分鐘。電泳後(25V，300mA 25分鐘)，用0.4M Tris(pH 7. 5)清洗載玻片，在純乙醇中乾燥2分鐘，然後用溴化乙錠 染色。使用螢光顯微鏡(尼康，美國)分析彗星，並通過使用CASP軟體測量「尾距」( ) (『tailmoment』( ))測定數量。每個度量分析50個細胞以計算平均值。11、統計分析使用StatView 5. 0 (SAS Institute Inc，Cary NC)的統計功能分析數據。結果表 示為兩個獨立實驗的原始數據的平均值+標準差(S.E.)。結果的統計顯著性使用Student 的t-檢驗評價。P值小於0. 05被認為是具有統計顯著性。12、Notch3蛋白表達的評價NotchUNotch 3和Notch 4受體的表達已通過免疫組織化學在20對HCC和周圍 組織的樣品中評價。正常的肝臟和慢性肝炎樣品不表達這三個Notch受體中的任何一個。 在CE和HCC肝臟樣品中，Notchl和Notch4的免疫反應沒有顯著差異。但是，在HCC的20 個中的15個(75% )腫瘤肝細胞中發現Notch3陽性表達，而在所有例中CE樣品被認為是 陰性，因為偶爾可以在分離的肝細胞中看到Notch3(圖1)。沒有發現腫瘤等級、病毒感染和 Notch3表達之間存在聯繫，即使分析的例子大多數是高等級腫瘤。這個評估提供了第一個體內證據，即上調的Notch3表達與肝細胞腫瘤特異性相 關聯，同樣顯示至少與Notchl和Notch4相比，Notch3可以選擇性地參與到HCC存活信號 和/或進展中。13、在IfepG2細胞中Notch3的缺失對特定調節因子的影響HepG2細胞中Notch3的表達已經通過穩定的逆轉錄病毒轉導用Notch3特異的 shRNA消除，並檢查對細胞生長和阿黴素敏感性的相應效果。相比較於不相關的GL2螢光特 異shRNA對照病毒，在H印G2細胞中Notch3蛋白水平通過兩個不同的Notch3特異shRNA 反轉錄病毒大幅度減少(見圖2A的Western印跡)。兩個Notch3的shRNA產生相等地滲 透 Notch3 敲除(圖 2A-B)。Notch3敲除有差別地影響了與細胞增殖、DNA修復和凋亡相關的特定細胞蛋白的 水平。如圖2A所示，p27和GADD45 a、P53和活性的p_P53的內在水平在Notch3缺失後提 高2-5倍，而p21蛋白水平降低4倍。圖2C中呈現的RNA分析顯示p53和p21基因轉錄的 比較結果。此外，Notch細胞內區域的直接目標的HES1的表達，同樣通過Notch3敲除而減 少。14、在阿黴素處理的H印G2細胞中Notch3敲除效果已經研究過是否Notch3賦予H印G2肝癌細胞抗阿黴素誘導的細胞死亡的抗性。通 過在感染一周後用碘化丙啶染色和流式細胞儀評價(數據沒有顯示)，用任一 Notch3shRNA 的感染沒有改變H印G2生長率。但是，在對阿黴素分別處理6和24小時的反應中，通過臺盼 藍染色排除顯示，穩定表達Notch3shRNA的H印G2細胞的死亡率(與螢光素酶shRNA陰性對照比較)成兩倍和三倍(圖3)。阿黴素處理還引起了 PARP的分裂。PARP是包含在DNA 修復中的115kDa核蛋白，是在細胞凋亡反應中分裂的最早的蛋白之一。在阿黴素處理6小 時後，在Notch3缺失細胞中，觀察到PARP細胞凋亡特異的89kDa分裂片段的積聚明顯增加 (圖 4)。彗星實驗已大量用於測量對不同DNA破壞試劑的應答中的DNA損傷。在這個實驗 中，分裂的DNA從核中移動形成顯現為具有圓形頭部和尾巴的細胞的彗星。通過彗星實驗 測量的基礎DNA損傷顯示GL2對照細胞與Notch3缺失細胞具有相同的內在DNA損傷度(P =0. 6686)。做時間過程分析以檢測在GL2對照和Notch3不足的細胞中由阿黴素誘導的 DNA鏈斷裂。這個分析顯示了在Notch3不足的細胞中，與明顯更高的DNA損傷水平一同獲 得的「TM」值有時間依賴性增加(圖5A)。在用阿黴素處理24小時後，Notch3缺失的細胞 強烈地損傷以至於不可能定量DNA分裂程度。FACS分析同樣顯示Notch3缺失細胞比GL2 陰性對照細胞獲得和/或保持更高的阿黴素水平，在阿黴素處理僅3小時後對阿黴素吸收 具有明顯不同(圖5B)。15、在阿黴素處理的IfepG2細胞中的Notchl缺失儘管不同的研究已證明高p21水平保護人類癌症細胞在化學療法和放射療法治 療中免於凋亡，我們研究了在Notch3缺失細胞中下調的p21是否會涉及H印G2細胞對阿黴 素的敏感性。在先的HCC細胞系研究顯示Notchl的過量表達通過p21上調抑制細胞生長。 與這個觀察一致，通過免疫印跡分析已發現通過目標shRNA敲除的Notchl表達的損失極大 地減少了 P21蛋白的表達(圖6)。但是，NotchlKD對p21表達的抑制效果與P53和p_P53 表達無關，因為它們的水平沒有被Notchl缺失影響(圖6)。重要地，不同於Notch3的消 除，Notchl的損失未能使HepG2細胞對阿黴素介導的細胞死亡敏感(圖10)。因此我們在 HepG2細胞中的發現不能支持p21在HepG2細胞對阿黴素依賴的細胞凋亡的敏感性中的作 用。16、在阿黴素處理的Notch3缺失細胞中P53的消除在Notch3敲除細胞中消除P53的表達，以測定在對阿黴素處理的Notch3缺失細 胞增強的細胞凋亡反應中P53的重要性。在Notch3KD和GL2對照IfepG2細胞中消除內源 P53表達，通過有效的陽離子脂質介導的轉染雞尾酒p53特異性siRNA對照不相關的siRNA 的零亂混合物(scRNA)。Western印跡顯示相比於scRNA陰性對照，轉染P53特異siRNA後， P53蛋白水平引人注意地分別在48小時減少，在72小時無法檢測到(圖7)。轉染的細胞用100ii g/ml的阿黴素處理24小時。有趣地，P53的下調明確地排 除了 Notch3缺失細胞的多數增強的細胞凋亡反應。如圖8所示，在阿黴素處理後，在轉染 p53siRNA的Notch3缺失細胞中細胞存活率為40%，相比於轉染scRNA的Notch3缺失細胞 中細胞存活率為75%。但是，P53的損耗沒有影響GL2感染細胞對阿黴素的敏感性(圖8)， 因此說明內源Notch3阻止內源P53擴大阿黴素的死亡促進效果的能力。
權利要求
一種用於治療肝細胞癌的藥物組合物，包括Notch3抑制劑、一種或多種抗腫瘤化學療法藥劑和藥物學可接受的載體。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其特徵在於，所述的Notch3抑制劑從包括與編 碼Notch3的mRNA互補的siRNA、與編碼Notch3的mRNA互補的shRNA、與編碼Notch3的 mRNA互補的合成寡核苷酸、抗Notch3抗體和Notch3拮抗劑的組中選擇。
3.根據權利要求2所述的藥物組合物，其特徵在於，所述的siRNA或shRNA插在包含腫 瘤特異啟動子或肝臟特異啟動子的病毒載體中。
4.根據權利要求2所述的藥物組合物，其特徵在於，所述的合成寡核苷酸插入在脂質 體/DNA複合物中。
5.根據前述權利要求任何一項所述的藥物組合物，其特徵在於，所述的抗腫瘤化學療 法藥劑是引起細胞凋亡或在細胞增殖中起作用的藥劑。
6.根據前述權利要求任何一項所述的藥物組合物，其特徵在於，所述的抗腫瘤化學療 法藥劑在包括阿黴素、5氟二氧嘧啶、紫杉醇、伊立替康、Patupilone、依維莫司、多激酶抑制 劑、EGFR抑制劑的組中選擇。
7.根據權利要求6所述的藥物組合物，其特徵在於，所述的多激酶抑制劑選自包括索 拉非尼和舒尼替尼的組，以及所述的EGFR抑制劑選自包括西妥昔單抗、埃羅替尼、吉非替 尼、Brivanib和拉帕替尼的組。
8.一種用於治療肝細胞癌的用於共施用Notch3抑制劑、抗腫瘤化學療法藥劑和藥物 學可接受的載體的藥劑盒，所述藥劑盒包括含有Notch3抑制劑和藥物學可接受的載體的 第一個小瓶，含有一種或多種抗腫瘤化學療法藥劑和藥物學可接受的載體的第二個小瓶或 更多小瓶，每一個小瓶包含抗腫瘤化學療法藥劑和藥物學可接受的載體。
9.根據權利要求8所述的藥劑盒，其特徵在於，所述的Notch3抑制劑從包括與編碼 Notch3的mRNA互補的siRNA、與編碼Notch3的mRNA互補的shRNA、與編碼Notch3的mRNA 互補的合成寡核苷酸、抗Notch3抗體和Notch3拮抗劑的組中選擇。
10.根據權利要求9所述的藥劑盒，其特徵在於，所述的siRNA或shRNA插在包含腫瘤 特異啟動子或肝臟特異啟動子的病毒載體中。
11.根據權利要求9所述的藥劑盒，其特徵在於，所述的合成寡核苷酸插在脂質體/DNA 複合物中。
12.根據權利要求8-11任何一項所述的藥劑盒，其特徵在於，所述的抗腫瘤化學療法 藥劑在包括阿黴素、5氟二氧嘧啶、紫杉醇、伊立替康、Patupilone、依維莫司、多激酶抑制 劑、EGFR抑制劑的組中選擇。
13.根據權利要求12所述的藥劑盒，其特徵在於，所述的多激酶抑制劑選自包括索拉 非尼和舒尼替尼的組，以及所述的EGFR抑制劑選自包括西妥昔單抗、埃羅替尼、吉非替尼、 Brivanib和拉帕替尼的組。
14. 一種用於權利要求1-7任何一項所述的藥物組合物的製備的方法，包括步驟a、選擇功能性Notch3抑制劑，所述的抑制劑的特徵為抑制Notch3受體的合成或抑制 Notch3受體的功能，b、將a中選擇的抑制劑與一種或多種抗腫瘤化學療法藥劑和藥物學可接受的載體混合。
15.一種用於權利要求8-13任何一項所述的藥劑盒的製備的方法，包括步驟a、選擇功能性Notch3抑制劑，所述抑制劑的特徵為抑制Notch3受體的合成或抑制 Notch3受體的功能，並將所述抑制劑與藥物學可接受的載體等分至第一個小瓶中，b、向第二個小瓶等分一種或多種抗腫瘤化學療法藥劑和藥物學可接受的載體。
16.一種HCC的醫學療法，包括對需要的患者施用治療上有效量的權利要求1-7任何一 項所述的藥物組合物。
17.—種HCC的醫學療法，包括對需要的患者共施用治療上有效量的權利要求8-13任 何一項所述的藥劑盒的第一個和第二個小瓶的內含物或第一個和更多個小瓶的內含物。
全文摘要
本發明提供用於治療肝細胞癌(HCC)的包括Notch3抑制劑和化學療法藥劑的藥物組合物，用於製備所述組合物的方法和包括對有需要的患者施用所述藥物組合物的醫學療法。
文檔編號A61P35/00GK101808648SQ200780100794
公開日2010年8月18日 申請日期2007年7月25日 優先權日2007年7月25日
發明者卡蒂亞·焦萬尼尼, 帕斯誇萊·基耶科, 肯尼思·馬爾庫, 路易吉·博倫迪 申請人:博洛尼亞大學阿爾瑪母校研究室