一種滇南杜鵑的組培繁殖方法
2023-10-06 04:04:09
一種滇南杜鵑的組培繁殖方法
【專利摘要】本發明公開了一種滇南杜鵑的組培繁殖方法，該方法適用於杜鵑花科滇南杜鵑的組培快繁，屬植物生物【技術領域】。本發明以開花後的新嫩莖段為外植體，通過外植體消毒、叢生芽誘導、繼代及壯苗、瓶外生根一系列步驟，有效解決了因滇南杜鵑分布區域窄、引種馴化難造成的植株量少，由種子播種開花時間長而導致的無法滿足商業提取香料的需求問題。本發明提供的組培快繁方法，在1個月內增殖係數為10-20，生根率為80％-90％，移栽成活率為95％-98％，極大地提高了滇南杜鵑的繁殖係數，為該物種的引種馴化、保存和商業生產提供了技術支撐。
【專利說明】一種滇南杜鵑的組培繁殖方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物生物技術中植物組織培養方法，具體地說，涉及杜鵑花滇南杜鵑 的組織培養快繁方法。
【背景技術】
[0002] 滇南杜醇隸屬於杜醇花科（Ericaceae)杜醇花屬（Rhododendron L.)馬銀花亞屬 (Subgen. Azaleastrum)長蕊組（Sect. Azaleastrum),常綠灌木。滇南杜醇花白色，有濃鬱 的香味，是香料提取的良好材料，具有較高的經濟利用價值。由於滇南杜鵑分布地域狹窄， 材料有限，難以滿足香料生產的原材料供應。
[0003] 目前，組培快繁已成為中藥材、花卉、瀕危物種苗木生產的重要手段。據研究報導 杜鵑對培養基的適應性與杜鵑的基因型密切相關，不同品種的杜鵑對培養基的適應程度不 同。對於杜醇花科植物，目前已經報導適合組織培養使用的基本培養基有Read、Anderson、 WPM等，但由於杜鵑花科植物種類豐富、種間差異較大，應用時還需結合不同的杜鵑花亞屬 甚至亞組進行調整。
[0004] 迄今，滇南杜鵑沒有相關生物技術方法繁殖的研究與報導，為了使滇南杜鵑能廣 泛應用於香料生產，解決滇南杜鵑自然匱乏、引種馴化難的問題，以更大的量和更快的速度 供應市場的需求，需要研究該種的組織培養，並形成一套專門的組織培養繁殖技術體系。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供滇南杜鵑的組織培養方法，使之在野外分布區域狹窄，引種 馴化難度大的情況，加快種苗繁殖，使之為香料市場提供足夠的原材料，為滇南杜鵑的可持 續利用奠定組培種苗繁育基礎。
[0006] 為了實現本發明的目的，本發明提供了如下的技術方案：
[0007] -種滇南杜鵑的組培繁殖方法，該方法包括以下步驟：
[0008] 1)外植體選擇與消毒：取滇南杜鵑開花後嫩莖段為外植體，衝洗乾淨後消毒；
[0009] 2)改良培養基：改良Anderson培養基：將其中的NH4NO3由400mg/L減少為350mg/ L，KNO3由480mg/L減少為380mg/L，其餘元素不變；
[0010] 3)叢生芽誘導：叢芽誘導培養基為步驟2)的改良Anderson培養基+3. Omg/ L2-iP+0. 5mg/L ΖΤ+0. 8mg/L ΙΑΑ+0. 5g/L AC，蔗糖 30g/L，瓊脂 7g/L，ρΗ5· 1-5. 2,暗培養 7 天后進行光照培養30天；
[0011] 4)繼代培養：繼代培養基為步驟2)的改良Anderson培養基+2mg/L 2-iP+O. 4mg/ L IAA，蔗糖 30g/L，瓊脂 7g/L，pH5. 1-5. 2,繼代培養 30 天；
[0012] 5)壯苗培養：壯苗培養基為步驟2)的改良Anderson培養基+lmg/L IAA，蔗糖 35g/L，瓊脂 7g/L，ρΗ5· 1-5. 2 ;
[0013] 6)移栽：選取3cm高，莖粗達到I. 進行瓶外生根，用lmg/LNAA泡根1小 時後移栽。
[0014] 根據所述的組培繁殖方法，其中所述叢生芽誘導為全黑暗誘導7天後進行人工輔 助光誘導，光強度為2000LUX，溫度為20-23°C ;繼代及壯苗培養的光照條件為人工輔助光 2500LUX-3000LUX，溫度為 18-23 °C。
[0015] 根據所述的組培繁殖方法，其中所述移栽是壯苗在瓶內生長至3cm高，莖粗達 I. 後經瓶內煉苗後分離，移到瓶外，生根時，將切口泡入lmg/LNAA 1小時後移栽至 大棚。
[0016] 根據所述的組培繁殖方法，其中所述移栽之前，移栽基質用800倍多菌靈進行噴 施消毒，所述移栽基質為底層為碎石，中層為體積比為1份珍珠巖+2份腐殖土 +1份紅土， 上層為體積比為1份珍珠巖+1份腐殖土，PH為5. 1-5. 2,大棚溫度為20-30°C，空氣溼度 50?60%，基質溼度70?80%。
[0017] 本發明的方法可以更具體地表述如下：
[0018] 滇南杜鵑的組培繁殖方法，包括選擇外植體、消毒、叢生芽誘導，瓶外移栽生根步 驟，取滇南杜鵑的開花後的新嫩莖段為外植體，消毒先用5ml洗潔精定容於IL水溶液中進 行浸泡清洗20min，再用無菌水衝洗至無泡沫後採用75 %的酒精滅菌20s，無菌水衝洗3遍 後，用0. 1 %升汞溶液添加2滴表面活性劑吐溫-20進行表面消毒6min，分兩次進行，第一 次消毒4min，不斷震蕩後用無菌水清洗3-5遍，再用0. 1 %升汞消毒2min後用無菌水清洗 3-5 遍。
[0019] 改良Anderson培養基的製備：因滇南杜醇花生存環境土壤為坡地酸性土壤，低 鹽分濃度及高比值NH 4+/N(V對滇南杜鵑的生長較利。材料在改良Anderson培養基中褐 變率低、成活率高。改良Anderson培養基，是將原培養基中NH 4N03400mg/L減少為350mg/ L，原培養基中KNO3由480mg/L減少為380mg/L，其餘元素不變。叢芽誘導培養基為改良 Anderson+3. Omg/L 2_iP (2-異戊烯腺噪呤）+0· 5mg/L ZT (玉米素）+0· 8mg/L ΙΑΑ+0. 5g/ L AC (活性炭），pH5. 1-5. 2,蔗糖 30g/L，瓊脂 7g/L，pH5. 1-5. 2 ;誘導期加活性炭 0. 5g/L， 降低材料褐化死亡率，叢芽誘導為全黑暗誘導7天後進行人工輔助光誘導30天，光強度為 2000LUX，溫度為 20-23°C。
[0020] 繼代培養基為改良 Anderson+2mg/l 2-iP+O. 4mg/L IAA，蔗糖 30g/L，瓊脂 7g/L， ρΗ5· 1-5. 2,繼代培養30天；壯苗培養基為改良Anderson+lmg/L IAA，蔗糖35g/L，瓊脂7g/ L，pH5. 1-5. 2 ;瓶外生根為移栽前使用lmg/LNAA泡根1小時候移栽。繼代及壯苗培養的光 照條件為人工輔助光2500LUX-3000LUX，溫度為20-23°C。
[0021] 移栽是瓶外生根，壯苗在瓶內生長至3cm高，莖粗達到I. 後經棚內煉苗後 分離，將切口泡入lmg/LNAA 1小時後移栽。移栽基質為底層為碎石，中層為1份珍珠巖+2 份腐殖土+1份紅土，上層為1份珍珠巖+1份腐殖土（均為體積比，移栽前，移栽基質需用 800倍多菌靈進行噴施消毒），pH為5. 1-5. 2。大棚溫度為20-30度，空氣溼度50?60%， 基質溼度70?80%。
[0022] 本發明技術方案的提出是基於下述的研究基礎：滇南杜鵑為杜鵑花科為數不多的 具有香味的植物，但滇南杜鵑分布區域狹窄，人工引種馴化難，為解決其自然資源少，達到 大量繁殖、保存和可持續利用，故此發明滇南杜鵑的組織培養技術。組培擴繁不僅可以在短 時間內獲得大量的再生植株，而且以成年植株為原材料，縮短開花年限，為供應充足的原材 料市場，促進香料提取有積極的作用。
[0023] 相比現有技術，本發明存在如下的優益性和有益效果：
[0024] 1.本發明通過改良基礎培養基配方，使得材料成活率較其他常用培養基提高 36% ；
[0025] 2.本發明建立了有效的滇南杜鵑組培快繁方法，解決了其分布狹窄，引種馴化難 的狀況；
[0026] 3.本發明通過組培快繁得到的幼苗，成苗容易，保持了木本優良的性狀；
[0027] 4.本發明利用一年生枝條進行組培快繁的方法大大縮短了開花年限，使其能迅速 的投入到香料生產原材料供應行列。
[0028] 本發明的組培快繁方法繁育的滇南杜鵑在1個月內增殖係數為10-20,生根率為 80% -90%，移栽成活率為95% -98%，極大地提高了滇南杜鵑的繁殖係數，為該物種的引 種馴化、保存和商業價值發揮利用提供了非常有效的繁殖方法。
【具體實施方式】
[0029] 下面用本發明的具體實施例來進一步闡述本發明的實質性內容，但並不以此來限 定本發明。
[0030] 實施例1
[0031] 1.培養基及基質篩選實施例
[0032] 取滇南杜鵑的開花後的新嫩莖段為外植體,消毒為常規組培外植體消毒,先用5ml 洗潔精定容於IL水溶液中進行浸泡清洗20min，再用無菌水衝洗至無泡沫後採用75 %的酒 精滅菌20s，無菌水衝洗3遍後，用0. 1 %升汞溶液添加2滴表面活性劑吐溫-20進行表面 消毒6min，分兩次進行，第一次消毒4min，不斷震蕩後用無菌水清洗5遍，再用0. 1 %升汞消 毒2min後用無菌水清洗5遍。將消毒後的嫩莖段兩端褐化組織切去，並將其切成Icm左右 的莖段，每段上至少帶一個腋芽。將莖段分別接種在WPM、Read、Anderson、改良Anderson 培養基上。
[0033] 各培養基激素及添加物都為 3. Omg/L 2-iP+O. 5mg/L ΖΤ+0. 8mg/L ΙΑΑ+0. 5g/ LAC (活性炭），蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5. 1-5. 2。暗培養基7天後，光照培養30天統計其 誘導率及新稍長。光強度為2000LUX，溫度為18-23°C。
[0034] 表1基本培養基的篩選
【權利要求】
1. 一種滇南杜鵑的組培繁殖方法，其特徵在於該方法包括以下步驟： 1) 外植體選擇與消毒：取滇南杜鵑開花後嫩莖段為外植體，衝洗乾淨後消毒； 2) 改良培養基：改良Anderson培養基：將其中的ΝΗ4Ν03由400mg/L減少為350mg/L， ΚΝ03由480mg/L減少為380mg/L，其餘元素不變； 3) 叢生芽誘導：叢芽誘導培養基為步驟2)的改良Anderson培養基+3.0mg/ L2-iP+0. 5mg/L ΖΤ+0. 8mg/L ΙΑΑ+0. 5g/L AC，蔗糖 30g/L，瓊脂 7g/L，ρΗ5· 1-5. 2,暗培養 7 天后進行光照培養30天； 4) 繼代培養：繼代培養基為步驟2)的改良Anderson培養基+2mg/L 2-iP+O. 4mg/L IAA，蔗糖 30g/L，瓊脂 7g/L，pH5. 1-5. 2,繼代培養 30 天； 5) 壯苗培養：壯苗培養基為步驟2)的改良Anderson培養基+lmg/L IAA，蔗糖35g/L， 瓊脂 7g/L，ρΗ5· 1-5. 2 ; 6) 移栽：選取3cm高，莖粗達到1. 進行瓶外生根，用lmg/LNAA泡根1小時後 移栽。
2. 根據權利要求1所述的組培繁殖方法，其特徵在於所述叢生芽誘導為全黑暗誘導7 天后進行人工輔助光誘導，光強度為2000LUX，溫度為20-23°C;繼代及壯苗培養的光照條件 為人工輔助光2500LUX - 3000LUX，溫度為18-23°C。
3. 根據權利要求1所述的組培繁殖方法，其特徵在於所述移栽是壯苗在瓶內生長至 3cm高，莖粗達1. 後經瓶內煉苗後分離，移到瓶外，生根時，將切口泡入lmg/LNAA 1 小時後移栽至大棚。
4. 根據權利要求1所述的組培繁殖方法，其特徵在於所述移栽之前，移栽基質用800倍 多菌靈進行噴施消毒，所述移栽基質為底層為碎石，中層為體積比為1份珍珠巖+2份腐殖 土+1份紅土，上層為體積比為1份珍珠巖+1份腐殖土，pH為5. 1-5. 2,大棚溫度為20-30°C， 空氣溼度50?60 %，基質溼度70?80 %。
5. 根據權利要求1所述的組培繁殖方法，其特徵在於該方法包括取滇南杜鵑開花後嫩 枝，浸泡於清水中，將材料泡入洗潔精中清洗，然後將其用無菌水衝洗至無泡沫產生，將材 料用潔淨的容器帶至超淨臺上，採用75%的酒精滅菌20s，無菌水衝洗3遍後，配置0. 1 %升 汞溶液添加2滴表面活性劑吐溫-20進行表面消毒6min，分兩次進行，第一次消毒4min，不 斷震蕩後用無菌水清洗5遍，再用0. 1 %升汞消毒2min後用無菌水清洗5遍待用； 將材料切去兩端後，將帶芽莖段斜插入叢芽誘導培養基即改良Anderson+3. Omg/ L2-iP+0. 5mg/L ΖΤ+0· 8mg/l IAA+0. 5g/L AC，蔗糖 30g/L，瓊脂 7g/L，ρΗ5· 1-5. 2,先進行黑 暗誘導7天後進行人工輔助光誘導，光強度為2000LUX，溫度為18-23°C ; 待培養25-35天後，將叢生芽在超淨臺上分離，接入繼代培養基為改良 Anderson+2. 5mg/l 2-iP+O. 8mg/l IAA，鹿糖 30g/L，瓊脂 7g/L，ρΗ5· 1-5. 2,進行繼代培養； 待繼代30天後將苗分離，轉接至壯苗培養基改良Anderson+lmg/lIAA，鹿糖35g/L，瓊脂7g/ L，pH5. 1-5. 2中培養；繼代及壯苗培養的光照條件為人工輔助光2500LUX -3000LUX，溫度為 18-23。。； 培養25-35天後，選取3cm高，莖粗達1. 進行瓶外生根，移栽前用lmg/L NAA泡 根1小時，然後移栽入裝有移栽基質的盆內，所述移栽基質為底層為碎石，中層為體積比為 1份珍珠巖+2份腐殖土 +1份紅土，上層為體積比為1份珍珠巖+1份腐殖土，pH為5. 1-5. 2， 移栽基質使用前用800倍多菌靈進行噴施消毒，移栽盆放在大棚內，培養溫度為20-30度， 空氣溼度50?60 %，基質溼度70?80 %。
【文檔編號】A01H4/00GK104285819SQ201410612891
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年11月4日 優先權日:2014年11月4日
【發明者】馬永鵬, 田曉玲, 羅桂芬, 黃承林 申請人:中國科學院昆明植物研究所