柴胡總多糖在製備防治急性呼吸窘迫症候群藥物中的用途的製作方法

2023-10-04 00:31:44 2

專利名稱：柴胡總多糖在製備防治急性呼吸窘迫症候群藥物中的用途的製作方法
技術領域：
本發明屬中藥領域，涉及中藥柴胡總多糖新的藥用用途。具體涉及柴胡總 多糖在製備防治急性呼吸窘迫症候群藥物中的用途。
技術背景-
急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是指 心源性以外的各種肺內外致病因素所導致的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭，其臨 床特點為急性呼吸窘迫和難治性低氧血症，是臨床上較為常見的危急、重症之一， 病死率很高。Davidson TA (Davidson TA, Caldwell ES, et al. J纖，1999, 281:354.)等報導在過去十年ARDS的死亡率高達30X-40% 。重症非典型肺炎 (SARS)病人也可出現呼吸窘迫，且肺部病理改變與ARDS相似，主要表現為肺泡 的損傷。SARS並發ARDS死亡率極高。糖皮質激素、抗生素、抗細胞因子治療藥物 等常被用於ARDS的治療，但到目前為止仍無一種特效藥物。研究表明免疫損害是 ARDS的另一重要發病機制。而補體系統的過度激活與ARDS的發生與預後有顯著聯 系。通過特異性抑制補體組成成分激活可能提高治療ARDS的臨床療效。因此急需 高效低毒的補體抑制劑來防治急性呼吸窘迫症候群。
柴胡為常用中藥，為傘形科柴胡屬(Bupleurum)多種植物的根,具有疏散退 熱、舒肝、昇陽的功效，主治感冒發熱、寒熱往來、瘧疾、胸肋脹痛、月經不調 及子宮脫垂等症。柴胡的化學成分相當複雜，迄今為止，已報導含有皂甙、揮發 油、黃酮、甾醇、香豆素、糖類、木質素、有機酸、多炔及生物鹼等。現代藥理 研究證明柴胡具有解熱、鎮痛、鎮靜、抗炎、免疫調節、抗菌、抗病毒及抗腫瘤 等作用。
文獻(張興權，陳鴻珊.中國藥理學與毒理學雜誌，1989,3(1) :31.)報導 柴胡(^;p7e"/7朋c力i'/7e/^e DC)多糖能顯著增加脾係數;提高巨噬細胞和天然殺傷 細胞功能;能提高病毒特異抗體滴度；能明顯增加淋巴細胞轉化率和皮膚遲發超敏 反應，顯示免疫促進作用。從狹葉柴胡(A^e"r卿scor^we/7'/b^柳Willd) 中分離出的黃酮和皂苷顯示良好的免疫抑制活性(Wen JC,Li WC， Jenn HL, et al.
Phytochmistry, 2003, 64:1375.)。從其他柴胡(仇，p7e〃r柳/k cat鵬L)中分出 的柴胡多糖IIb能抑制補體系統經典途徑激活所致的溶血反應，顯示免疫抑制作用 (Yamada H, Ra KS， Kiyohara H， et al. Carbohydr Res, 1989, 189:209.)。但未 涉及對急性呼吸窘迫症候群的作用。
綜觀國內外的研究，均未見報導柴胡總多糖的防治急性呼吸窘迫症候群藥效及 其藥物。

發明內容
本發明的目的是提供柴胡總多糖在製備防治急性呼吸窘迫症候群藥物中的新 的藥用用途及柴胡總多糖的製備方法。
本發明從中藥柴胡中分離提取得到總多糖提取物。所述總多糖提取物經體外 實驗證實有較強抗補體活性，整體動物模型試驗證實其具有很強的防治實驗性急 性呼吸窘迫症候群作用。
本發明所述的中藥柴胡包括柴胡(5"/^e"r"歷c/7J'/7e/7w DC)，狹葉柴胡 (^/p7ei/zzffl7 scorzo/ e/7'/b7itw; Willd)禾口小葉黑柴胡(ft;/ 7ei/ri/OT 5vw't/w7 Wolff)。
本發明的目的通過下述方法實現
1、 製備柴胡總多糖
柴胡藥材以95%乙醇冷浸提取，濾過，藥渣於室溫下置通風處晾乾，然後 用熱水提取3次，濾過，合併提取液，濃縮，離心，上清液以三氯醋酸去游離 蛋白，離心，上清液用水透析3天，透析液濃縮至小體積後加乙醇至含醇量80 % ，離心，沉澱冷凍乾燥即得總多糖提取物，收率達3%以上，多糖含量超過 65%。
2、 柴胡總多糖用於抗補體和防治急性呼吸窘迫症候群試驗-1)抗補體激活經典途徑細胞溶血試驗
採用豚鼠(購自復旦大學實驗動物部)血清1: 32稀釋液作為補體，抗 原激活補體經典途徑導致羊紅細胞溶血，結果顯示，測得柴胡總多糖可抑制細 胞溶血。
柴胡(5"/ 7ew鵬c/w7 e/we DC): IC5。 =232^g.mr' (n=4)。 狹葉柴胡(S"p7e〃r鵬scoj^o/7eW/b乃'鵬Willd): IC50 =284^g.mr'
(n=4)。
小葉黑柴胡(5〃p7e"r"歷s肌't/^i'Wolff): IC5。 =162^g.mr' (n=4)。
2) 抗補體激活旁路途徑細胞溶血試驗
採用健康人血清l: IO稀釋液作為補體，激活補體旁路途徑導致兔紅細胞
溶血，結果顯示，測得柴胡總多糖可抑制溶血。
柴胡(萬"/ 7e〃r鵬c/wV e/7se DC): AP5。 =1.336mg.mr' (n=4)。
狹葉柴古月 (5"/ 7e"i-"/77 5ror加/7e"'/b7/6W7Willd ) : AP5o =
1. 156mg.ml一1 (n=4)。
小葉黑柴胡(5"p7e〃/Y^s肌't/w7 Wolff): AP50 =0. 925mg. ml—1 (n=4)。
3) 防治急性呼吸窘迫症候群體內試驗
選用SD大鼠，以缺血再灌注+內毒素(LPS) 二次打擊，建立與補體過度 激活相關的急性呼吸窘迫症候群模型。柴胡總多糖灌胃給藥。觀察動物的血清 中總補體活性及二氧化碳指標。
將試驗大鼠在實驗結束後放血處死，取出肺，石蠟固定，切片，顯微鏡下 觀察病理改變。結果證實口服柴胡總多糖後，對大鼠急性呼吸窘迫症候群引起的 肺損傷有明顯的保護作用。
經體外試驗證實柴胡總多糖對在經典和旁路途徑激活所引發的細胞溶血 均有抑制，對體內大鼠的急性呼吸窘迫症候群有防治作用。 表l是動物血清補體活性測定的OD值變化率(％， X±SD) (n=5)。 表2是動物血清C02濃度變化率(％， X±SD) (n=5)。 表l
Time(h)ARDS空白對照偽手術陽性對照柴胡多糖(10mg/kg)
0100. 00 ±0100. 00±0100. 00±0100, 00±0100. 00±0
0.588. 62±5.8188. 30±1.4198. 39 ±2. 03**87.02±7. 5982. 58±4. 05
186. 42±5. 4686. 50±5. 6094. 87±4, 33*74. 44 ±6. 08*73. 73 ±6. 84*
1.579. 64 ±3. 7580.61±5.3388. 77±6. 52*61.43±4.37**64. 03 ±10. 04*
2.573. 10±2. 8773.08±8.6181.43±5. 0*47. 62 ±2. 33**52. 58±8. 39**
其中，*與ARDS模型組比較P〈0.05; **與ARDS模型組比較P〈0.01。
表2
Time (h)ARDS空白對照偽手術陽性對照柴胡多糖(10mg/kg)
0100. 00 ±0100. 00 ±0100. 00 ±0100. 00 ±0100. 00±0
0.5123. 6±5. 55120.8±5. 63103. 6±5. 58**100. 2 ±2. 26**110. 5 ±2. 28**
1129. 6±5. 15128, 2±7.81103. 1±3. 97林104. 8±4. 98**107. 8±2, 02**
1.5145. 0±4. 71149. 9±5. 46120. 2±3. 65**106. 1±4. 64林111. 3±4. 62**
2.5182. 0± 13. 8169. 3±5. 54138. 5±3. 55**112. 5 ±5. 32**122. 8±7.87**
其中，*與ARDS模型組比較P〈0.05; **與ARDS模型組比較P〈0. 01。


圖l是ARDS大鼠血清補體活性測定的OD值變化率
圖2是ARDS大鼠血清C02濃度變化率
圖3是ARDS大鼠肺切片圖。
圖4是空白對照組大鼠肺切片圖
圖5是偽手術組大鼠肺切片圖。
圖6是陽性對照(氫化潑尼松)大鼠肺切片圖。
圖7是柴胡總多糖給藥組大鼠肺切片圖。
具體實施例方式
實施例1
取柴胡藥材100g，以95%乙醇冷浸提取，藥渣於室溫下置通風處晾乾，然 後用熱水提取3次，濾過，合併提取液，濃縮，離心，上清液以S三氯醋酸去遊 離蛋白，離心，上清液用水透析3天，透析液濃縮至小體積加乙醇至含醇量80 % ，離心，沉澱冷凍乾燥即得總多糖，產物收率達3%以上，多糖含量超過65%。 表3是柴胡總多糖收率及含量。
所述的柴胡藥材可選自柴胡(5";^e"r鵬c/^'/ e/7se DC)，狹葉柴胡( scor加/7e/^/bh'柳Willd)或小葉黑柴胡(5"; 7e〃/，湖s肌't/ // Wolff)。
產物產量(克) 總多糖量(克) 產物收率％ 多糖含量％
批號
實施例2
將柴胡(5"p7ei/n加c力y/7e/we DC)總多糖(約3.0mg.mL—')用巴比妥緩衝液 (barbitol buffer solution, BBS)對倍稀釋得八個濃度的溶液，各取0. 2ml各 濃度樣品加入0. 2ml補體(豚鼠血清1: 32稀釋液)，0. lml 2%羊紅細胞(she印red blood cell, SRBC)和0. lrall: 1000溶血素(抗SRBC血清)，將每管37。C水浴 30分鐘後放置入低溫高速離心機2500G、4。C離心，20min後分別取每管上清0. 25mL 於酶標儀405nm下測定吸光度。再僅僅將0. 2ml各濃度樣品溶液與0. 4mlBBS混合， 放置入低溫高速離心機以2500G、 4。C離心10min,取每管上清0. 25mL於酶標儀 405nm下測定吸光度，作為樣品吸光本色值。再將每種不同濃度的樣品效價測定吸 光度減去相應濃度下樣品吸光本色值為加入藥物後的溶血吸光度，並附加補體正 常溶血管作為體系全溶血對照，計算藥物抑制溶血的半數抑制濃度(IC5。)為 232Mg.mr1 (n=4)。
將狹葉柴胡(5"p7e"r鵬sco^o"eri7b"咖Willd)總多糖(約3. Omg. mL—') 用巴比妥緩衝液(barbitol buffer solution, BBS)對倍稀釋得八個濃度的溶液， 各取0.2ml各濃度樣品加入0.2ml補體(豚鼠血清l: 32稀釋液)，0. lml 2%羊紅 細胞(she印red blood cell, SRBC)和0. lmll: 1000溶血素(抗SRBC血清)， 將每管37。C水浴30分鐘後放置入低溫高速離心機2500G、 4。C離心，20min後分別 取每管上清0. 25mL於酶標儀405nm下測定吸光度。再僅僅將0. 2ml各濃度樣品溶 液與0.4mlBBS混合，放置入低溫高速離心機以2500G、 4'C離心10min，取每管上 清0.25mL於酶標儀405nm下測定吸光度，作為樣品吸光本色值。再將每種不同濃 度的樣品效價測定吸光度減去相應濃度下樣品吸光本色值為加入藥物後的溶血吸
實施例3
光度，並附加補體正常溶血管作為體系全溶血對照，計算藥物抑制溶血的半數抑 制濃度(ICso)為28叫g.mr' (n:4)。
實施例4
將小葉黑柴胡(說^7e"r鵬柳/t/u7 Wolff)總多糖(約3. Omg. ml/')用巴比 妥緩衝液(barbitol buffer solution, BBS)對倍稀釋得八個濃度的溶液，各取 0.2ml各濃度樣品加入0.2ml補體(豚鼠血清1: 32稀釋液)，0. lml 2%羊紅細胞 (she印red blood cell, SRBC)和0. lmll: 1000溶血素(抗SRBC血清)，將每 管37'C水浴30分鐘後放置入低溫高速離心機2500G、 4。C離心，20min後分別取每 管上清0. 25mL於酶標儀405nm下測定吸光度。再僅僅將0. 2ml各濃度樣品溶液與 0.4mlBBS混合，放置入低溫高速離心機以2500G、 4'C離心10min，取每管上清 0.25mL於酶標儀405nm下測定吸光度，作為樣品吸光本色值。再將每種不同濃度 的樣品效價測定吸光度減去相應濃度下樣品吸光本色值為加入藥物後的溶血吸光 度，並附加補體正常溶血管作為體系全溶血對照，計算藥物抑制溶血的半數抑制 濃度(IC5。)為162^g.mr' (n-4)。
實施例5
將柴胡(5"; 7e"r"歷c/ //7e/we DC)總多糖(約5. Omg. mL—')用含Mg"的明膠一 巴比妥緩衝液[GVB/Mg (10 mM) EGTA]對倍稀釋得八個濃度的溶液，取0. 15ml各 濃度樣品加入O. 15ml補體(人血清l: 10稀釋液)，0.2ml 2%兔紅細胞，將每管37'C 水浴30分鐘後放置入低溫高速離心機2500G、 4'C離心，20min後分別取每管上清 0. 25mL於酶標儀405nm下測定吸光度。再僅僅將O. 15ml各濃度樣品溶液與0. 35ml GVB/Mg (10 mM) EGTA混合，放置入低溫高速離心機以2500G、 4'C離心10min，取 每管上清0.25mL於酶標儀405nm下測定吸光度，作為樣品吸光本色值。再將每種 不同濃度的樣品效價測定吸光度減去相應濃度下樣品吸光本色值為加入藥物後 的溶血吸光度，並附加補體正常溶血管作為體系全溶血對照，計算藥物抑制溶血 的半數抑制濃度(AP5。)為1.336mg.mr' (n=4)。
實施例6
將狹葉柴胡(5"p7e"r鵬scorzo"erjYbi7鵬Willd)總多糖(約5. Omg. mL-1) 用含MgW的明膠一巴比妥緩衝液[GVB/Mg (10 mM) EGTA]對倍稀釋得八個濃度的 溶液，取O. 15ml各濃度樣品加入0. 15ml補體(人血清l: IO稀釋液)，0. 2ml 2% 兔紅細胞，將每管37。C水浴30分鐘後放置入低溫高速離心機2500G、 4。C離心， 20min後分別取每管上清0.25mL於酶標儀405nm下測定吸光度。再僅僅將O. 15ml 各濃度樣品溶液與0.35ml GVB/Mg (10 mM) EGTA混合，放置入低溫高速離心機以 2500G、 4。C離心10min，取每管上清O. 25mL於酶標儀405nm下測定吸光度，作為樣 品吸光本色值。再將每種不同濃度的樣品效價測定吸光度減去相應濃度下樣品吸 光本色值為加入藥物後的溶血吸光度，並附加補體正常溶血管作為體系全溶血對 照，計算藥物抑制溶血的半數抑制濃度(AP5。)為1.156rag.mr1 (n=4)。
實施例7
將小葉黑柴胡(i9"p7e"r"/z/柳it&7 Wolff)總多糖(約5. Omg. mL—')用含Mg2 +的明膠一巴比妥緩衝液
對倍稀釋得八個濃度的溶液，取 0.15ml各濃度樣品加入0. 15ml補體(人血清l: IO稀釋液)，0. 2ml 2%兔紅細胞， 將每管37'C水浴30分鐘後放置入低溫高速離心機2500G、 4'C離心，20min後分別取 每管上清O. 25mL於酶標儀405nm下測定吸光度。再僅僅將O. 15ml各濃度樣品溶液與 0. 35ml GVB/Mg (10 mM) EGTA混合，放置入低溫高速離心機以2500G、 4。C離心10min， 取每管上清0.25mL於酶標儀405nm下測定吸光度，作為樣品吸光本色值。再將每種 不同濃度的樣品效價測定吸光度減去相應濃度下樣品吸光本色值為加入藥物後的 溶血吸光度，並附加補體正常溶血管作為體系全溶血對照，計算藥物抑制溶血的 半數抑制濃度(APs。)為0.925mg.ml—' (n=4)。
實施例8
SD大鼠25隻(250-300g)，隨機分為5組(A、 B、 C、 D、 E組)。A組為內毒 素致傷ARDS組，B組為陰性對照組，C組為陽性對照組，D組為偽手術對照組，E 組為柴胡多糖組。除了 D組外的所有組動物在20min內自頸部動脈放血至平均動 脈壓為45土5mraHg，室溫下休克lh後回輸血液，在隨後的lh內回輸全部採集血液，
然後氣管內給予LPS200y g.kg—、 E組在給予LPS前半小時灌胃給藥，劑量為 10mg/kg; D組僅實施麻醉和頸動脈插管等手術操作。B組其餘操作與E組相同， 只是以生理鹽水替代了柴胡多糖，作為陰性對照。C組則在給予LPS前半小時以 70mg/kg腹腔注射氫化潑尼松作為陽性對照組。A-E組分別在氣管內注入內毒素前 (T。)及注入內毒素後的0.5h (T0.5 )、 lh a )、 1.5h a.5 )、 2.5h (T2.5 )採 集血樣，分別測定血中C02濃度及補體經典途徑的溶血活性。給予內毒素2.5h後 動物放血處死，取出肺，石蠟固定，切片，顯微鏡下觀察病理改變。結果顯示A 組與B組血樣C02濃度呈現較大幅度的上升，補體活性小幅度下降。C、 E組血樣 C02濃度上升幅度相對較小，補體活性大幅度下降。D組血樣C02濃度與補體活性 略微下降，基本穩定。病理切片按肺部損傷情況A組評級均數為3.67， B組評級 均數為2.33， C組為3.33， D組為1.17， E組別為2.2。由結果可知，柴胡多糖在 體內也有抑制補體的作用，且能不同程度地改善內毒素致傷引起缺氧及肺臟的炎 症，有緩解ARDS大鼠模型肺損傷趨勢。
權利要求
1、柴胡總多糖在製備防治急性呼吸窘迫症候群藥物中的用途。
2、 柴胡總多糖在製備防治重症非典型肺炎藥物中的用途。
3、 柴胡總多糖在製備防治人禽流感藥物中的用途。
4、 柴胡總多糖在製備抗補體藥物中的用途。
5、 權利要求1或2或3或4的用途，其中所述的柴胡總多糖通過下述方法和步 驟製備柴胡藥材以95%乙醇冷浸提取，濾過，藥渣於室溫下置通風處晾千，然後用 熱水提取3次，濾過，合併提取液，濃縮，離心，上清液以三氯醋酸去游離蛋白， 離心，上清液用水透析3天，透析液濃縮至小體積後加乙醇至含醇量80% ，離心， 沉澱冷凍乾燥即得總多糖提取物，收率達3%以上，多糖含量為68. 2-78. 6 %。
6、 權利要求5用途，其中所述的製備方法中柴胡藥材選自柴胡(^^^〃/77歷 c力i/7e/ se DC)，狹葉柴胡(^/p7ew""/z scorzo/7erj'/b""歷Willd)或小葉黑柴胡(S"jo/ei/n/fl 5777"/ j7 Wolff)。
全文摘要
本發明屬中藥領域，具體涉及柴胡總多糖在製備防治急性呼吸窘迫症候群藥物中的用途。本發明從中藥柴胡中分離提取得到總多糖提取物，平均產物收率3.32％，多糖含量為68.2-78.6％。所述總多糖提取物經體外實驗證實，對在經典和旁路途徑激活所引發的細胞溶血均有抑制，有較強抗補體活性；整體動物模型試驗顯示，對大鼠急性呼吸窘迫症候群引起的肺損傷有明顯的保護作用，證實對急性呼吸窘迫症候群有防治作用。可製備防治急性呼吸窘迫症候群藥物和防治人禽流感等藥物。
文檔編號A61P31/16GK101095707SQ20061014602
公開日2008年1月2日 申請日期2006年11月1日 優先權日2006年6月30日
發明者捷 周, 張建文, 晗 徐, 章蘊毅, 陳道峰 申請人:復旦大學