化妝品中氫化可的松的高效液相色譜檢測方法

2023-09-15 04:23:05 1

專利名稱：化妝品中氫化可的松的高效液相色譜檢測方法
技術領域：
本發明是一項利用高效液相色譜儀檢測化妝品中禁用成分一氫化可的松(Hydrocortisone)的新技術， 尤其適用於化妝品中氫化可的松的定性及定量分析。
背景技術：
氫化可的松屬於糖皮質激素類藥物，具有抗菌、消炎的作用。國家衛生部頒布的2002年版《化妝品 衛生規範》規定，化妝品中不得添加氫化可的松。氫化可的松由於其廣譜高效的殺菌作用，被添加到祛痘 類產品以達到消炎、祛痘、除蟎及抗粉剌的目的。但這類藥物的不良反應較多，如體重增加、下肢浮腫、 紫紋、易出血傾向、創口癒合不良、肱或股骨頭缺血性壞死、骨質疏鬆或骨折、肌無力、肌萎縮、低血鉀 症候群、胃腸道刺激(噁心、嘔吐)、胰腺炎、消化性潰瘍或腸穿孔，兒童生長受到抑制、青光眼、白內 障、良性顱內壓升高等症候群。長期使用添加有氫化可的松的化妝品或皮膚性接觸此種藥物可嚴重影響人 體健康。
目前關於氫化可的松檢測的文獻報導大都是針對氫化可的松原料和藥品中氫化可的松的檢測方法，主 要有螢光光度法、分光光度法、褶合光譜法、雙波長分光光度法、三波長分光光度法、薄層色譜法、高效 液相色譜法等。螢光光度法雖然靈敏度高，但反應時間較長，操作繁瑣；分光光度法呈色反應的時間和溫 度影響較大，致使方法的重複性較差；褶合光譜法、雙波長分光光度法、三波長分光光度法容易受基質成 分的幹擾；薄層色譜法可以用來進行定性檢測，不適用於定量檢測；高效液相色譜方法是近幾年檢測氫化 可的松較常用的方法，但也僅僅局限於原料藥和各種藥品製劑中含量的檢測，由於藥品組分較少，基質簡 單，幹擾因素較少，且樣品預處理簡單目標檢測物損失小，因此藥品中氫化可的松的含量容易檢測。而化 妝品、飼料、肉類中的氫化可的松含量的檢測國家還沒有制定相關的檢測標準和方法，並且到目前為止化 妝品中氫化可的松的檢測也沒有相關的文獻報導。與藥品不同，化妝品種類繁多有膏、霜、乳、粉、水、 啫喱、凝膠等多種劑型，並且基質複雜，各成分的理化性質差別較大，幹擾因素較多，尤其是氫化可的松 作為化妝品禁用成分添加到化妝品中，其含量較低，用上述的螢光光度法、分光光度法、薄層色譜法等光 學分析方法很難準確的檢測出化妝品中微量的氫化可的松成分。因此，針對現有氫化可的松檢測技術上的 不足，我們設計了一種用高效液相色譜方法檢測化妝品中氫化可的松的方法，該方法操作簡單，專屬性好， 靈敏度高，且適宜化妝品中氫化可的松的微量檢測。

發明內容
本發明的目的是提供一種檢測化妝品中氫化可的松的分析方法，該項技術利用高效液相色譜儀不僅可 以對化妝品中的氫化可的松進行準確的定性分析，而且還可以進行微量的定量分析。
本發明是用一定濃度的甲醇一鹽酸混合液或乙腈_鹽酸混合液提取化妝品中的氫化可的松，然後將提 取液過濾，濾除固體雜質，直至濾液澄清，取製備好的樣液上機，用甲醇一水溶液或乙腈一水溶液進行洗
脫分離。所用高效液相色譜儀的主要配置包括十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑的C18柱或C8柱、二極體 陣列檢測器或紫外檢測器。
本發明方法的主要分析步驟如下
1樣品預處理
稱取一定量的化妝品(乳、膏、霜或水劑)於10ml刻度離心管中，加入4一7ml提取液(甲醇0. 01 1. 00mol/ml鹽酸-20 80X : 80 20%或乙腈0. 01 1. 00mol/ml鹽酸=20 80% : 80 20%)，渦旋混 勻使基質充分分散，定容至刻度，再超聲提取15—30min，將提取液轉移至Eppendorf管中冰浴30min使 基質析出，12000rpm/min離心5min，如果有必要可以再用0. 45 u m濾膜過濾。
2色譜條件
(1) 色譜柱以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑的反相色譜柱C18或C8柱；
(2) 檢測器紫外檢測器或二極體陣列檢測器；
(3) 檢測波長選用190-380nm波K:作為檢測波長；
(4) 流動相釆用甲醇水=20 80% : 80 20%或乙猜水=20 80% : 80 20%混合液作為流 動相，平衡色譜柱約20min，使基線平穩，該條件下保留時間適合，峰形對稱，分離度好(R〉1.5)。
(5) 流速0,5 1. 5ml/niin;
(6) 柱溫15 35°C。 3濃度計算方法
用氫化可的松標準物質配製成一定梯度濃度的標準液，取20^il進樣，按外標法，以峰面積一濃度作 線性回歸，得出線性回歸方程，利用該方程和樣品中氫化可的松的峰面積計算樣品中的氫化可的松含量。 4樣品檢測
(1) 按照l中的方法進行樣品預處理，取處理好的樣品20(11進樣；然後再取適當濃度的氫化可的松 標準溶液20nl進樣。
(2) 依照2中的檢測條件進行檢測，分別得到樣品的色譜圖和氫化可的松標準品的色譜圖；將樣品 的色譜圖和標準品的色譜圖進行比較，樣品色譜圖中與標準品保留時間相近(誤差範圍:標準品保留時間± 0.5分鐘)的色譜峰即為相應的氫化可的松成分，為了確保檢測結果的準確性，可對初步確定的色譜峰進行 光譜分析(光譜分析僅適用於二極體陣列檢測器)，若與標準品的最大吸收波長及光譜圖特徵相似，可進 一步確定樣品中的氫化可的松成分。
(3) 將樣品中氫化可的松的色譜峰面積帶入3中的線性回歸方程中，計算樣品中氫化可的松的濃度。 由於化妝品種類繁多、基質複雜，不能完全排除幹擾成分與氫化可的松在同一時間出峰的可能。釆用
—極管陣列檢測器可獲得氫化可的松的紫外吸收光譜圖，與標準品的光譜圖對照，通過分析二者的最大吸 收波長和光譜圖特徵，可進一步進行確認。
本發明的分析方法準確、簡便、快捷，靈敏度髙，選擇性、重複性好，適用於任何膏霜劑、乳劑、及 水劑等各種劑型的化妝品。


圖1樣品色譜圖
圖2氫化可的松標準品色譜圖
圖3樣品光譜圖
圖4氫化可的松標準品光譜圖
圖5氫化可的松標準曲線圖
具體實施例方式
下面結合具體實施實例對本發明作進一步的闡述，但不限制本發明
1材料 1.1儀器
島津自動進樣高效液相色譜系統Hypersil-ODS (150mmx4.6mm， 5pm,柱號E1720574)色譜柱， SPD-M20A紫外可見光檢測器，SPD-M20A 二極體陣列檢測器，LC-20AB 二元高壓梯度泵，SlL-20A自動進 樣系統，CTO-20A柱溫箱及LCSolution色譜工作站。
1. 2試劑和樣品
無水甲醇(色譜純)為Merck公司產品；鹽酸(優級純)為天津科密歐試劑廠產品；超純水由Milli-Q system製取。
氫化可的松標準品購於中國藥品生物製品檢定所，批號為100152-200206。 供試樣品為快速祛痘修復菁華。
1. 3標準品儲備液
精密稱取50.00mg氫化可的松標準品置於5(kl容量瓶中，加少許無水甲醇溶解，並用甲醇定容至刻 度，搖勻，配製成濃度為lmg/ml的標準液作為儲備液，於4'C冰箱中存放備用。 2方法
2. 1色譜條件
色譜柱Shim-packVP-ODS (150mmx4.6mm， 5pm)
檢測器SPD-M20A二極體陣列檢測器
流動相採用甲醇水=60% : 40%混合液作為流動相，使用該比例的流動相峰性對稱，分離度好。 檢測波長245nm。經190-400nm波長掃描，氫化可的松在245nm附近有最大吸收，故選擇245nm作
為檢測波長。 流速lml/min 柱溫25°C 2. 2樣品預處理
稱取1.00g的化妝品(快速祛痘修復菁華)於10ml刻度離心管中，加入5ml無水甲醇，渦旋混勻使 基質充分分散，再超聲提取20min,將提取液轉移至Eppendorf管中冰浴30min， 12000rpm/min離心5min， 如果有必要可以再用0. 45拜濾膜過濾，製成供試樣品溶液。
2. 3樣品檢測
取20pl供試液進樣，利用2.1中的色譜條件進行檢測，獲得樣品的色譜圖(圖l)和光譜圖(圖3); 再取1.3中的氫化可的松標準品儲備液稀釋至為50pg/nil濃度，2(^1進樣，同樣檢測條件下，得到氫化可 的松標準品的色譜圖(圖2)和光譜圖(圖4)。
2.4標準曲線
用無水甲醇將氫化可的松儲備液稀釋成如下梯度濃度的標準系列5叫/ml、 1(Hig/ml、 25嗎/ml、 50ng/ml、 75pg/ml、 100pg/ml,取各濃度的標準溶液20nl進樣，得到各濃度的峰面積(見表O，作峰面 積一濃度標準曲線(見圖5),得到其線性回歸方程(由高效液相色譜工作站完成計算工作)。
回歸方程A(axea) =112504046666R2=0. 9999
表1氫化可的松標準曲線各點濃度及峰面積
標曲各點濃度 ((ig/ml)峰面積 (mm2)標準曲線公式
5550381. 7
101128761. 3
252701830. 2
505544948. 1A(area)=U2504 C-46666 (R2=0. 9999)
758375942. 2
10011241634. 3
3結果分析
由氫化可的松標準品的色譜圖(圖2)可以看出，利用2.1中的色譜檢測條件得到氫化可的松標準品 的保留時間為7.538min，將樣品的色譜圖(圖l)和標準品的色譜圖(圖2)進行比較，可見樣品色譜圖中在 7. 515min處有一色譜峰與氫化可的松標準品色譜峰的保留時間7. 538min相近，誤差在土O. 5分鐘範圍之 內，因此可以初步確定樣品色譜圖中7.515min處的色譜峰為氫化可的松，該峰面積為955842. 2min2。將樣 品色譜圖中7.515min處峰的光譜圖(圖3)與氫化可的松標準品的光譜圖(圖4)進行對比，可以發現樣 品的光譜圖與標準品的光譜圖的最大吸收波長相近，並且光譜圖特徵相似，可進一步確定樣品屮保留時間 為7. 515min的組分為氫化可的松。
將樣品中氫化可的松的色譜峰面積955842. 2咖2代入線性回歸方程中，即可得到樣品處理液中氫化可 的松的含量為8.91叫/ml (由髙效液相色譜工作站完成計算工作)，經計算可得快速祛痘修復菁華樣品中氫 化可的松的含量為0. 0891mg/kg。
該發明具有高解析度，高靈敏度，重現性、選擇性好，專屬性強，且樣品預處理方法簡單的特點，適 宜化妝品中氯化可的松的定性、定量分析。
本發明以火量實驗和理論分析，找到了一種利用高效液相色譜儀檢測化妝品中氫化可的松的分析方 法，填補了化妝品中氫化可的松液相色譜分析方面的研究空白。
權利要求
1一種化妝品中氫化可的松的高效液相色譜檢測方法，其特徵在於採用紫外檢測器或二極體陣列檢測器，以外標法定量，採用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑的C18柱或C8柱，以甲醇-水混合液或乙腈-水混合液為流動相，採用190-380nm的檢測波長，採用甲醇-鹽酸混合液或乙腈-鹽酸混合液溶解樣品，超聲萃取，0.45μm濾膜過濾。
全文摘要
本發明是一種採用高效液相色譜儀檢測化妝品中氫化可的松的分析方法。其特點在於採用以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑的C8柱或C18柱；二極體陣列檢測器或紫外檢測器在190-380nm處進行檢測；流動相採用甲醇-水混合液或乙腈-水混合液；樣品經甲醇-鹽酸混合液或乙腈-鹽酸混合液萃取，超聲提取10-30min，再冰浴30min，然後12000rpm/min高速離心5min，取上清備用，如果有必要，可再用0.45μm濾膜過濾後使用；根據樣品的保留時間和光譜圖進行定性分析，根據其峰面積進行定量分析。該發明的優點在於解析度、靈敏度高，重現性、選擇性好，樣品預處理方法簡單，適宜化妝品中氫化可的松的微量分析。
文檔編號G01N30/00GK101169395SQ20071002792
公開日2008年4月30日 申請日期2007年5月10日 優先權日2007年5月10日
發明者鄭偉東 申請人:廣東省保化檢測中心有限公司