人胚腎293細胞亞克隆細胞株的製作方法
2023-09-15 12:15:10 1
專利名稱：人胚腎293細胞亞克隆細胞株的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子和細胞生物學，細胞克隆和基因工程技術，更具體地說是涉及一種由來源於經5型腺病毒(Ad5)DNA轉染的人胚腎293細胞亞克隆細胞株。
背景技術：
原代人胚胎腎上皮(The primary human embryonic kidney，HEK)293細胞系，是一種經5型腺病毒(Ad5)DNA片段轉染，含有Ad55』端的11％的基因組包括E1a的原代人胚胎腎細胞，該細胞特別對人腺病毒敏感，並對腺病毒DNA是高度許可的，其含有和表達Ad5的轉染基因(transforminggenes)。目前，美國細胞培養庫(American Type Culture Collection，ATCC)已將該細胞系開發成商業化，並廣泛用於體外(in vitro)檢測和生產重組蛋白質和病毒。然而，ATCC 293細胞在細胞生長周期和細胞貼壁生長方面存在周期長，貼壁不牢固，易脫落被衝洗掉的弱點，並直接影響該細胞廣泛應用，尤其是大規模生產重組病毒體和蛋白質。應用基因工程技術和分子克隆技術，改進293細胞系的培養方法，特別是建立一種新型的、適合於規模化生產用的人胚胎腎293細胞已變得愈來愈必要和可行。
發明內容
本發明旨在解決上述問題，而提供一種應用基因工程技術和分子克隆技術改進的人胚腎293細胞亞克隆細胞株，使其具有明顯增強細胞貼壁生長的功能和細胞生長倍增時間短的優點，並得到更廣泛的應用。
為實現上述目的，本發明提供一種用於生產重組腺病毒製品的人胚腎293細胞亞克隆細胞株，該細胞株是由ATCC 293細胞經亞克隆方法製得，它含有下列序列的人三磷酸甘油醛脫氫酶(humanglyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPD)1 ctctctgctc ctcctgttcg acagtcagcc gcatcttctt ttgcgtcgcc agccgagcca61 catcgctcag acaccatggg gaaggtgaag gtcggagtca acggatttgg tcgtattggg121 cgcctggtca ccagggctgc ttttaactct ggtaaagtgg atattgttgc catcaatgac181 cccttcattg acctcaacta catggtttac atgttccaat atgattccac ccatggcaaa241 ttccatggca ccgtcaaggc tgagaacggg aagcttgtca tcaatggaaa tcccatcacc301 atcttccagg agcgagatcc ctccaaaatc aagtggggcg atgctggcgc tgagtacgtc361 gtggagtcca ctggcgtctt caccaccatg gagaaggctg gggctcattt gcagggggga421 gccaaaaggg tcatcatctc tgccccctct gctgatgccc ccatgttcgt catgggtgtg481 aaccatgaga agtatgacaa cagcctcaag atcatcagca atgcctcctg caccaccaac541 tgcttagcac ccctggccaa ggtcatccat gacaactttg gtatcgtgga aggactcatg601 accacagtcc atgccatcac tgccacccag aagactgtgg atggcccctc cgggaaactg661 tggcgtgatg gccgcggggc tctccagaac atcatccctg cctctactgg cgctgccaag721 gctgtgggca aggtcatccc tgagctgaac gggaagctca ctggcatggc cttccgtgtc781 cccactgcca acgtgtcagt ggtggacctg acctgccgtc tagaaaaacc tgccaaatat841 gatgacatca agaaggtggt gaagcaggcg tcggagggcc ccctcaaggg catcctgggc901 tacactgagc accaggtggt ctcctctgac ttcaacagcg acacccactc ctccaccttt961 gacgctgggg ctggcattgc cctcaacgac cactttgtca agctcatttc ctggtatgac1021 aacgaatttg gctacagcaa cagggtggtg gacctcatgg cccacatggc ctccaaggag1081 taagacccct ggaccaccag ccccagcaag agcacaagag gaagagagag accctcactg1141 ctggggagtc cctgccacac tcagtccccc accacactga atctcccctc ctcacagttg1201 ccatgtagac cccttgaaga ggggaggggc ctagggagcc gcaccttgtc atgtaccatc1261 aataaagtac cctgtgctca acc其中，(1)自76-1083是編碼GAPD1-335胺基酸序列(如下所示)的基因組序列MGKVKVGVNGFGRIGRLVTRAAFNSGKVDIVAINDPFIDLNYMVYMFQYDSTHGKFHGTVKAENGKLVINGNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEYVVESTGVFTTMEKAGAHLQGGAKRVIISAPSADA
PMFVMGVNHEKYDNSLKIISNASCTTNCLAPLAKVIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQKTVDGPSGKLWRDGRGALQNIIPASTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMAFRVPTANVSVVDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKQASEGPLKGILGYTEHQVVSSDFNSDTHSSTFDAGAGIALNDHFVKLISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE(2)自1261-1266為多聚腺苷腺尾polyA。
該細胞株由下列方法培養製得a、將ATCC 293細胞(P32)復甦後進行細胞擴增傳代至第33代次(P33)，然後將P33細胞懸液用FACS流式細胞儀進行亞克隆；b、用2個96孔板，每孔中0.2ml培養基中放置一個細胞，在36～38℃、3～6％CO2條件下培養6～10天；c、挑選出細胞形態均一、生長良好的、已達到不低於60％鋪滿生長的克隆；d、重複上述步驟四次，最後挑選出1個亞克隆的細胞柱(P37)，繼續培養擴增並製成原代細胞庫(P38)，置於-80℃凍存；e、以原代細胞庫(P38)為基礎製備主代細胞庫及工作細胞庫。
所述培養基是DMEM(GIBCO/BRL)與胎牛血清(GIBCO/BRL)的混合物。
用於細胞培養的ATCC 293細胞的傳代次數在55代次以下。
該細胞的倍增時間為18小時。
本發明通過基因工程技術和分子克隆技術的改造，有效改進了ATCC 293細胞結構和功能。通過定性並鑑定該細胞中的蛋白與多肽的組成，特別是應用雙向電泳(2D-Ge)和質譜技術研究了蛋白在該細胞中的的表達情況，可清楚地表明，與ATCC 293細胞相比，本發明的細胞具有明顯增強細胞貼壁生長的功能和細胞生長倍增時間短的優點。本發明還同時發現了僅在亞複製人胚腎293細胞中檢測到的蛋白三磷酸甘油醛脫氫酶(humanglyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPD)，它在本發明的細胞中的表達量較高，而由於GAPD參與糖酵解的過程，並參與細胞的多項調節功能特別是與細胞周期的調節功能有關，因而具有重要意義。本發明的人胚腎293細胞亞克隆細胞株可用於研究和生產重組腺病毒製品。
圖1是本發明的人胚腎293細胞亞克隆細胞株與ATCC 293細胞2-D圖譜比較示意圖。
圖2是MALDI-MS檢測本發明的人胚腎293細胞亞克隆細胞株中蛋白點(編號144)的肽質量指紋圖譜示意圖。
圖3是本發明的人胚腎293細胞亞克隆細胞株與ATCC 293細胞細胞倍增時間檢測比較示意圖。
圖4是本發明的人胚腎293細胞亞克隆細胞株與ATCC 293細胞細胞貼壁功能比較示意圖。
具體實施例方式
一、細胞株來源及培養條件(一)、細胞株的來源本發明的人胚腎293細胞亞克隆細胞株來源於亞克隆的ATCC 293細胞系。293細胞系(ATCC CRL-1573，第32代次，1997年6月13日從ATCC訂購)，來源於經5型腺病毒(Ad5)DNA片段轉染的原代人胚胎腎細胞，含有Ad5 5端的11％的基因組，包括E1a。該細胞對幹人病毒的感染和生長是高度許可的。經亞克隆篩選後建立人胚腎293細胞亞克隆細胞庫，主代細胞庫為傳代40次(P40)的細胞，工作細胞庫為傳代43次(P43)的細胞，而生產細胞為第46代次(P46)。
(二)、培養細胞株所用的成分及條件培養人胚腎293細胞亞克隆細胞株和ATCC 293細胞所需用的培養基成份包括DMEM(GIBCO/BRL)，胎牛血清(GIBCO/BRL)，青黴素及鏈黴素(GIBCO/BRL)。在37℃，5％ CO2的條件下進行培養。
(三)、細胞株生長的穩定性293細胞傳代生長的穩定性研究表明用於生產的293細胞的傳代次數在55代次以下為好，其中以P37-P47代次最好。傳代次數大於55代次以上後，細胞生長的密度(cell/cm2)與每個細胞內病毒顆粒數(VP/cell)不成正比，會導致病毒產量下降，形成RCA的機率上升。
(四)、質量控制主代細胞庫及工作細胞庫已由中國藥品和生物製品檢定所檢定合格，符合國家藥品和食品監督管理局(SFDA)的規定。
二、人胚腎293細胞亞克隆細胞株按如下具體方法培養製得1、將從ATCC購入的293細胞(P32)在37℃化凍復甦，在室溫離心1100rpm，1分鐘，沉澱細胞。
2、真空吸除上清液，向沉澱細胞內加入1.0mlPBS並懸浮細胞，再1100rpm離心1分鐘。棄上清後，向沉澱細胞加入1.0mlDMEM培養介質(含10％FBS，1％青黴素和鏈黴素)，懸浮細胞。轉移懸浮細胞到75cm2平皿中，補加新鮮介質10ml。
3、置於37℃，5％ CO2孵育箱，培養二天。
4、待第三天時，可見除約有5-10％的細胞死亡漂浮外，細胞已貼壁生長良好，形態較均一。吸除上清介質，用PBS洗滌細胞一次，再加入1mlTrypsin-EDTA液，並使其履蓋細胞30秒鐘，吸除Trypsin-EDTA液。靜置30秒鐘後，輕拍打平皿，使細胞脫離平皿壁。進入10ml新鮮培養介質，充分勻散細胞。該細胞為第33代次(P33)。
5、將P33細胞懸液用FACS流式細胞儀進行亞克隆。預先準備好2個96孔板，向每一孔中0.2ml培養介質中放置一個細胞。共放置192個孔(細胞)。
6、在37℃，5％ CO2條件下培養8天，在顯微鏡下觀察。第一次挑選出54個細胞形態均一、生長良好的、已達到60％鋪滿生長的克隆。在這些培養孔中，外觀培養介質已變。另外的138個孔，其中101個克隆生長較為緩慢，37個孔中無細胞生長。這138個孔的培養介質仍為紅色。從生長較為緩慢到克隆中，我們亦篩選出一株慢長293株，稱之為293s。在研究中，293s主要用於做空斑形成實驗。
7、吸除上述的54個孔的培養介質，用200μlPBS洗滌一次，加入20μlTryps in-EDTA液作用1分鐘後，加入200μl新鮮培養介質。用吸管上下吹打以懸浮細胞(P34)。
8、將亞克隆的懸浮細胞(P34)移入預盛有1ml新鮮介質/孔的24孔板中，每孔一株亞克隆的細胞。37℃，5％ CO2條件下培養三天。
9、第二次挑選出生長良好，細胞形態均一的克隆細胞31株，製成第35代次(P35)細胞懸液。
10、將P35細胞移入6孔板中繼續培養三天。
11、第三次挑選生長良好，細胞形態均一的克隆細胞株14株，移入14個75Gm2平皿中，繼續培養三天(P36)，每平皿1株細胞。
12、最後，第四次挑選出1個亞克隆的細胞柱(P37)，移入12個150cm2平皿(2個平皿/株)中，培養三天，當達到90％鋪商生長狀態時，用Trypsin-EDTA處理，使細胞脫離平皿。然後向每一平皿中加入12ml凍存液(5％DFMO-95％FBS)，將同一克隆的2個平皿的細胞懸液混合，然後分裝，2ml/支凍存管，共11管。該細胞為第38代次(P38)細胞，將其編號並置於-80℃凍存。
13、選取在-80℃凍存管(1×107/2ml/管)進行復甦，在2個75cm2平皿和5個150cm2平皿各擴增傳代一次(即從38代傳代為第40代)。然後，進行凍存。從5個150cm2中共獲得約3×108個細胞。每個凍存管分裝1ml，3×106個細胞，共分裝100管，在液氮保存。該細胞(第40代次，P40)即為主代細胞庫。
14、從主代細胞庫中取出1管凍存細胞，復甦後在1個75cm2平皿，2個150cm2平皿和4個225cm2培養瓶中傳遞3代，即從P40傳代至P43，凍成100管，2×106個細胞/管，製成工作細胞庫。
15、在每次通過CellCube系統進行生產時，從工作細胞庫由取出1管，再經3代次擴增，即從第43代(P43)培養至第46代(P46)，共獲得6×108個細胞，稱之為生產細胞。
三、人胚腎293細胞亞克隆細胞株與ATCC 293細胞在功能上的差異(一)、細胞倍增時間檢測
1、材料ATCC 293細胞，人胚腎293細胞亞克隆細胞株，胰酶(GIBCO)，DMILD萊卡顯微鏡，T25細胞培養瓶(CORNING)。
2、方法2.1、分別接種等量1×104細胞於21個T25瓶中，分為7組(分別觀察培養24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h)，每組3瓶。
2.2、從次日起，每隔24小時，取一組細胞(3瓶)用胰酶消化後，進行計數。計算每一瓶細胞的總數，取3瓶計算均值，如此至第7組結束。為提高細胞計數精確性，每瓶細胞數量應計算2-3次取均值。
測試結果如圖3所示，圖中，以日期為橫坐標，以細胞數目為縱坐標，在坐標圖紙上繪製細胞生長曲線，確定細胞倍增時間(細胞倍增時間，即細胞數量增加1倍的時間)。
3、結果如表1所示，表124h48h 72h 96h 120h 144h 168hATCC29323.4±1.1 36.9±0.673.3±0.6125.9±6.4 260.8±7.7 399.5±18.4 838.7±22.0本發明細胞35.2±2.7 96.7±3.8263.1±20.7 669.6±61.7株通過換算，ATCC293細胞倍增時間為25.8小時，人胚腎293細胞亞克隆細胞株倍增時間為18小時。
4、結論人胚腎293細胞亞克隆細胞株較ATCC293細胞倍增時間短。
(二)細胞貼壁功能細胞生長狀態對比實驗1、目的通過培養ATCC293細胞、人胚腎293細胞亞克隆細胞株，觀察兩組細胞生在長狀態上的差異。
2、材料2.1、細胞人胚腎293細胞亞克隆細胞株(來源工作細胞庫細胞，復甦後第4代)，ATCC293細胞(來源工作細胞庫細胞，復甦後第4代)2.2、培養液DMEM+10％FBS
2.3、細胞消化液Typsin-EDTA2.4、儀器CO2培養箱、生物工作檯、顯微鏡。
3、步驟將已預熱的Typsin-EDTA、DMEM+10％FBS，移液管、T75培養瓶置生物工作檯內。分別取ATCC293、人胚腎293細胞亞克隆細胞株各1個T75瓶細胞，顯微鏡下觀察細胞生長至80％～90％。在超淨臺內操作，分別吸出細胞培養瓶內的培養基。加入3mlTypsin-EDTA，消化3分鐘，輕輕拍擊瓶壁，細胞成粉沫狀脫落時，加入10ml DMEM+10％FBS終止消化。上下吸打細胞懸液10次，使細胞呈單個存在。分別將兩瓶細胞懸液移至無菌離心管，1000rpm離心10min。吸去上清液，各加10ml新鮮DMEM+10％FBS，反覆吹打5次，使細胞散在。分別取2.5ml細胞懸液置新的T75培養瓶，補加適量新鮮培養基。置37℃二氧化碳培養箱內培養。24小時後，顯微鏡下觀察細胞生長狀態。
人胚腎293細胞亞克隆細胞株與ATCC293細胞細胞貼壁功能比較如圖4所示。
4、結論由圖4(其中圖4A為人胚腎293細胞亞克隆細胞株，圖4B為ATCC293細胞)可見，人胚腎293細胞亞克隆細胞株單層無圓細胞，ATCC293細胞單層可見有少量圓細胞，故人胚腎293細胞亞克隆細胞株較ATCC293細胞貼壁能力強。人胚腎293細胞亞克隆細胞株單層細胞分布均勻，ATCC293細胞單層細胞分布不均勻，故在細胞貼壁生長時，人胚腎293細胞亞克隆細胞株較ATCC293細胞分布更均勻。
(三)病毒產率試驗1、材料人胚腎293細胞亞克隆細胞株、ATCC293細胞，培養液DMEM(GIBCO)、FBS(HYCLON)，T75培養瓶、(CORENING)CO2培養箱、(法瑪西亞)離心機、(SIGMA)WATERS2690分離系統及996PDA檢測器。
2、方法2.1、取同代次人胚腎293細胞亞克隆細胞株及ATCC293細胞分別接種T75培養瓶，CO2培養箱培養48小時後，細胞數增至1.5×107個。
2.2同時感染病毒，感染量7.5×109/瓶，置CO2培養箱培養。
2.3培養51小時，細胞完全CPE，各收集5ml細胞懸液。
2.4將細胞懸液置-80℃，37℃凍融2次，3000rpm離10min，取上清。
2.5用HPLC檢測收穫上清液中病毒濃度。
3、結果見表2表2本發明細胞株 ATCC293病毒產量 12×1010vp 9×1010vp病毒產率 8000vp/cell 6000vp/cell4、結論相同條件下，人胚腎293細胞亞克隆細胞株較ATCC293細胞生產病毒產量高。
四、人胚腎293細胞亞克隆細胞株與ATCC293細胞在蛋白質表達模式的差異我們研究了人胚腎293細胞亞克隆細胞株和ATCC293細胞，分別抽提處理，將10mg處理的樣品懸浮於1ml樣品緩衝液中，樣品緩衝液成份為40MmTrisbase、7Murea、2Mthiourea、4％CHAPS、10mM 1、4-dithioerythritol、1mM EDTA。懸浮液超聲約30s後15000xg室溫離20min。
雙向電泳約1mg樣品用杯上樣的方法在IPG膠條陽極端上樣，(pH3-10NL，24cm)，蛋白在500V聚焦1分鐘，然後電壓逐漸上升到3500V聚焦1.5小時，並維持3500V，14小時。第二向對高分子量蛋白和低分子量蛋白分別使用12.5％和14.0％的聚丙烯醯胺凝膠分離。電泳後凝膠在室溫下固定1小時(40％ methanol，10％ acetic acid)，用考馬氏亮藍法染色。
凝膠成像樣品電泳後的凝膠用ImageScanner掃描後，檢測點並作比較，選中的點用自動切膠儀切出並轉移到96孔板中。
蛋白酶解和脫鹽蛋白用胰蛋白酶進行酶解，然後用50％乙睛，1％TFA萃取酶解後的肽段，用C18填充的微量吸液管(ZipTipTM)脫鹽，最後用dried-droplet法點樣至MALDI樣品靶上，採用的基質為被50％乙睛、0.5％TFA溶液飽和的a-氰基-4-羥基肉桂酸。
質譜採用反射MALDI-TOF(EttanTM，Amersham Biosciences)質譜測肽質量指紋圖譜，胰蛋白酶自酶解的肽片段峰用作圖譜測量的內標，用Mascot搜尋引擎進行蛋白鑑定。
(一)、人胚腎293細胞亞克隆細胞株和ATCC293細胞的蛋白組份的雙向圖譜的比較由圖1(其中圖1A為2D-gel分離人胚腎293細胞亞克隆細胞株蛋白圖譜，圖1B為2D-gel分離ATCC293細胞蛋白圖譜)可見，分別在二塊膠內用圖像軟體分析得出約有800個離散的蛋白點，主要表現出明顯差異的其中一個蛋白，為圖1A中編號為144點，此蛋白點僅在人胚腎293細胞亞克隆細胞株樣品中出現，圖1B中ATCC293細胞樣品中無此蛋白點。
(二)、用胰蛋白酶酶解後的肽質量指紋譜及資料庫搜索結果結果如圖2所示，該圖為MALDI-MS檢測人胚腎293細胞亞克隆細胞株中蛋白點(編號144)的肽質量指紋圖譜。與ATCC293不同，人胚腎293細胞亞克隆細胞株樣品存在明顯差異點(編號144蛋白)，經用胰蛋白酶進行水解，進樣後質譜測得肽質量指紋圖譜。圖中所示，胰蛋白酶水解的肽片段峰及該肽片段的分子量(數字代表，單位Dalton)，用Mascot搜索進行蛋白鑑定，圖中所示多個肽段均與庫中三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPD)相匹配。
MALDI-ToF肽質量指紋圖譜顯示人胚腎293細胞亞克隆細胞株樣品中出現並表現明顯的差異的一個蛋白分子量為36kDa蛋白為人三磷酸甘油醛脫氫酶(human glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPD)，GAPD是人們熟知的介導糖酵解過程中的酶，在能量代謝中起關鍵作用，它已被看作「看家蛋白」，並且其正常功能包括核RNA外移(nuclear RNA export)，DNA複製(DNA replication)，DNA修復(DNA repair)，細胞胞吞作用的膜融合(exocytotic membrane fusion)，細胞骨架成份(Cytoskeletalorganization)和磷酸轉移酶活性(phosphotransferase activity)。病理上，GAPD涉及細胞凋亡，神經退行性病變，前列腺癌及病毒性病變。Mansur等報導GAPD基因作為調節細胞周期與DNA合成有關聯的系列表達基因。結合我們的細胞功能學的實驗結果，GAPD可能參與細胞的周期調節功能和細胞的粘壁功能有關。
如上所述，本發明的人胚腎293細胞亞克隆細胞株含有下列序列的人三磷酸甘油醛脫氫酶(human glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase，GAPD)的mRNA全序列1 ctctctgctc ctcctgttcg acagtcagcc gcatcttctt ttgcgtcgcc agccgagcca61 catcgctcag acaccatggg gaaggtgaag gtcggagtca acggatttgg tcgtattggg121 cgcctggtca ccagggctgc ttttaactct ggtaaagtgg atattgttgc catcaatgac181 cccttcattg acctcaacta catggtttac atgttccaat atgattccac ccatggcaaa241 ttccatggca ccgtcaaggc tgagaacggg aagcttgtca tcaatggaaa tcccatcacc301 atcttccagg agcgagatcc ctccaaaatc aagtggggcg atgctggcgc tgagtacgtc361 gtggagtcca ctggcgtctt caccaccatg gagaaggctg gggctcattt gcagggggga421 gccaaaaggg tcatcatctc tgccccctct gctgatgccc ccatgttcgt catgggtgtg481 aaccatgaga agtatgacaa cagcctcaag atcatcagca atgcctcctg caccaccaac541 tgcttagcac ccctggccaa ggtcatccat gacaactttg gtatcgtgga aggactcatg601 accacagtcc atgccatcac tgccacccag aagactgtgg atggcccctc cgggaaactg661 tggcgtgatg gccgcggggc tctccagaac atcatccctg cctctactgg cgctgccaag721 gctgtgggca aggtcatccc tgagctgaac gggaagctca ctggcatggc cttccgtgtc781 cccactgcca acgtgtcagt ggtggacctg acctgccgtc tagaaaaacc tgccaaatat841 gatgacatca agaaggtggt gaagcaggcg tcggagggcc ccctcaaggg catcctgggc901 tacactgagc accaggtggt ctcctctgac ttcaacagcg acacccactc ctccaccttt961 gacgctgggg ctggcattgc cctcaacgac cactttgtca agctcatttc ctggtatgac1021 aacgaatttg gctacagcaa cagggtggtg gacctcatgg cccacatggc ctccaaggag1081 taagacccct ggaccaccag ccccagcaag agcacaagag gaagagagag accctcactg1141 ctggggagtc cctgccacac tcagtccccc accacactga atctcccctc ctcacagttg1201 ccatgtagac cccttgaaga ggggaggggc ctagggagcc gcaccttgtc atgtaccatc1261 aataaagtac cctgtgctca acc
其中，(1)自76-1083是編碼GAPD1-335胺基酸序列(如下所示)的基因組序列MGKVKVGVNGFGRIGRLVTRAAFNSGKVDIVAINDPFIDLNYMVYMFQYDSTHGKFHGTVKAENGKLVINGNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEYVVESTGVFTTMEKAGAHLQGGAKRVIISAPSADAPMFVMGVNHEKYDNSLKIISNASCTTNCLAPLAKVIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQKTVDGPSGKLWRDGRGALQNIIPASTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMAFRVPTANVSVVDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKQASEGPLKGILGYTEHQVVSSDFNSDTHSSTFDAGAGIALNDHFVKLISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE(2)自1261-1266多聚腺苷腺尾polyA。
由試驗可知1、我們建立和分析了人胚腎293細胞亞克隆細胞株和ATCC293細胞的蛋白質成份差異，結合雙向電泳和MALDI質譜分析的蛋白組學方法來研究人胚腎293細胞亞克隆細胞株功能。
2、在最初的研究中從2-D膠中鑑定出的蛋白，其中對僅在人胚腎293細胞亞克隆細胞株中檢測到的蛋白三磷酸甘油醛脫氫酶(humanglyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPD)，它在人胚腎293細胞亞克隆細胞株中的表達量較高。GAPD參與糖酵解的過程，並參與細胞的多項調節功能特別是與細胞周期的調節功能有關。
權利要求
1.一種用於生產重組腺病毒製品的人胚腎293細胞亞克隆細胞株，其特徵在於，該細胞株是由ATCC 293細胞經亞克隆方法製得，它含有下列序列的人三磷酸甘油醛脫氫酶(human g1yceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase，GAPD)1 ctctctgctc ctcctgttcg acagtcagcc gcatcttctt ttgcgtcgcc agccgagcca61 catcgctcag acaccatggg gaaggtgaag gtcggagtca acggatttgg tcgtattggg121 cgcctggtca ccagggctgc ttttaactct ggtaaagtgg atattgttgc catcaatgac181 cccttcattg acctcaacta catggtttac atgttccaat atgattccac ccatggcaaa241 ttccatggca ccgtcaaggc tgagaacggg aagcttgtca tcaatggaaa tcccatcacc301 atcttccagg agcgagatcc ctccaaaatc aagtggggcg atgctggcgc tgagtacgtc361 gtggagtcca ctggcgtctt caccaccatg gagaaggctg gggctcattt gcagggggga421 gccaaaaggg tcatcatctc tgccccctct gctgatgccc ccatgttcgt catgggtgtg481 aaccatgaga agtatgacaa cagcctcaag atcatcagca atgcctcctg caccaccaac541 tgcttagcac ccctggccaa ggtcatccat gacaactttg gtatcgtgga aggactcatg601 accacagtcc atgccatcac tgccacccag aagactgtgg atggcccctc cgggaaactg661 tggcgtgatg gccgcggggc tctccagaac atcatccctg cctctactgg cgctgccaag721 gctgtgggca aggtcatccc tgagctgaac gggaagctca ctggcatggc cttccgtgtc781 cccactgcca acgtgtcagt ggtggacctg acctgccgtc tagaaaaacc tgccaaatat841 gatgacatca agaaggtggt gaagcaggcg tcggagggcc ccctcaaggg catcctgggc901 tacactgagc accaggtggt ctcctctgac ttcaacagcg acacccactc ctccaccttt961 gacgctgggg ctggcattgc cctcaacgac cactttgtca agctcatttc ctggtatgac1021 aacgaatttg gctacagcaa cagggtggtg gacctcatgg cccacatggc ctccaaggag1081 taagacccct ggaccaccag ccccagcaag agcacaagag gaagagagag accctcactg1141 ctggggagtc cctgccacac tcagtccccc accacactga atctcccctc ctcacagttg1201 ccatgtagac cccttgaaga ggggaggggc ctagggagcc gcaccttgtc atgtaccatc1261 aataaagtac cctgtgctca acc其中，(1)自76-1083是編碼GAPD 1-335胺基酸序列(如下所示)的基因組序列MGKVKVGVNGFGRIGRLVTRAAFNSGKVDIVAINDPFIDLNYMVYMFQYDSTHGKFHGTVKAENGKLVINGNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEYVVESTGVFTTMEKAGAHLQGGAKRVIISAPSADAPMFVMGVNHEKYDNSLKIISNASCTTNCLAPLAKVIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQKTVDGPSGKLWRDGRGALQNIIPASTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMAFRVPTANVSVVDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKQASEGPLKGILGYTEHQVVSSDFNSDTHSSTFDAGAGIALNDHFVKLISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE(2)自1261-1266為多聚腺苷腺尾polyA。
2.根據權利要求1所述的人胚腎293細胞亞克隆細胞株，其特徵在於，該細胞株由下列方法培養製得a、將ATCC293細胞(P32)復甦後進行細胞擴增傳代至第33代次(P33)，然後將P33細胞懸液用FACS流式細胞儀進行亞克隆；b、用2個96孔板，每孔中0.2ml培養基中放置一個細胞，在36～38℃、3～6％CO2條件下培養6～10天；c、挑選出細胞形態均一、生長良好的、已達到不低於60％鋪滿生長的克隆；d、重複上述步驟四次，最後挑選出1個亞克隆的細胞柱(P37)，繼續培養擴增並製成原代細胞庫(P38)，置於-80℃凍存；e、以原代細胞庫(P38)為基礎製備主代細胞庫及工作細胞庫。
3.根據權利要求2所述的人胚腎293細胞亞克隆細胞株，其特徵在於，所述培養基是DMEM(GIBCO/BRL)與胎牛血清(GIBCO/BRL)的混合物。
4.根據權利要求2所述的人胚腎293細胞亞克隆細胞株，其特徵在於，用於細胞培養的ATCC 293細胞的傳代次數在55代次以下。
5.根據權利要求1所述的人胚腎293細胞亞克隆細胞株，其特徵在於，該細胞的倍增時間為18小時。
全文摘要
一種用於生產重組腺病毒製品的人胚腎293細胞亞克隆細胞株，該細胞株是由ATCC 293細胞經亞克隆方法製得，它含有人三磷酸甘油醛脫氫(human glyceraldehydes－3－phosphate dehydrogenase，GAPD)，該細胞株由下列方法培養製得a、將ATCC 293細胞(P32)復甦後進行細胞擴增傳代至第33代次(P33)，然後將P33細胞懸液用FACS流式細胞儀進行亞克隆；b、用2個96孔板，每孔中0.2ml培養基中放置一個細胞，在36～38℃、3～6％CO
文檔編號C12N15/50GK1513985SQ03126889
公開日2004年7月21日 申請日期2003年6月13日 優先權日2003年6月13日
發明者張曉志, 彭朝暉 申請人:張曉志, 彭朝暉