一組抗冠狀病毒感染及防治非典型肺炎的核苷酸序列及其應用的製作方法
2023-09-15 12:15:25
專利名稱：一組抗冠狀病毒感染及防治非典型肺炎的核苷酸序列及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一組抗冠狀病毒感染及防治非典型肺炎的核苷酸序列及其應用。
背景技術：
近年的研究結果證實短的雙鏈RNA在多種哺乳動物細胞中具有幹擾RNA功能，可以特異抑制特定基因在細胞內的表達。通過該途徑也可抑制病毒基因在細胞內的表達，從而用於病毒感染的預防與治療。
冠狀病毒為正鏈RNA病毒，具有較大的變異性。目前所分離的不同來源的病毒基因組間的相似性小於30％。在流行期間的變異會導致藥物治療和基因治療失效。
本發明通過同源比較，獲得一系列在多種冠狀病毒間保守的RNA序列。使用該序列衍生的雙鏈RNA序列可以有效抑制冠狀病毒基因的表達。使用質粒轉錄的該序列也可在細胞內抑制相應基因的表達。因此也可能用於製備抗SARS感染和非典型肺炎的治療的藥物。
發明內容
本發明的目的是提供一組抗冠狀病毒感染及防治非典型肺炎的核苷酸序列。
本發明的另一個目的是提供上述核苷酸序列的應用。
為實現上述發明目的，本發明採用以下技術方案一組抗冠狀病毒感染及防治非典型肺炎的RNA序列及其片段，該組RNA序列如下(1)ugggauuauccaaaauguga(2)uguuuuggaauuguaacguugau(3)uaacucaaaugaaucuuaaguaugc(4)uauuaucaaaauaauguguu(5)uuuaacauuugucaagcuguu(6)uauauuaaauggccuugguauguuuggcu(7)ggccacgcggaguacgaucgaggguacag一組由所述的RNA序列及其片段和與之互補的序列雜交形成的雙鏈RNA序列。
一組由所述的RNA序列及其片斷在其5』端或3』端加核苷酸修飾的序列。
一組所述的RNA序列及其片段和與之反向互補的序列加上中間非互補連接序列形成的髮夾樣RNA雙鏈。
一組所述序列對應的DNA序列。
包含所述的RNA序列的表達載體。
包含所述的DNA序列的表達載體。
包裹所述的RNA序列的脂質體。
包裹所述的DNA序列的脂質體。
包裹所述的表達載體的脂質體。
將所述的RNA序列在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
將所述的DNA序列在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
將所述的表達載體在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
將所述的脂質體在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
所述的RNA序列及其片段用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
所述的DNA序列及其片段用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
所述的表達載體用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
所述的脂質體用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
所述的方法用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
本發明的優點是通過同源比較，獲得一系列與所有已經發表的冠狀病毒序列高度同源的RNA序列片段，使用該系列片段衍生的雙鏈RNA序列可以有效地抑制冠狀病毒基因的表達；使用質粒轉錄的該系列RNA也可在細胞內抑制冠狀病毒基因的表達；攜帶該片段對應DNA腺病毒伴隨病毒感染細胞後可以轉錄出對應的雙鏈RNA並抑制冠狀病毒基因的表達。
圖1為不同中間冠狀病毒的保守性分析2為報告質粒pSPIKE的構建3為雙鏈幹擾RNA抑制冠狀病毒Spike基因的表達4為雙鏈RNA抑制冠狀病毒核衣殼蛋白Flag-Nuc蛋白的表達5為AAV表達的雙鏈RNA可以抑制病毒的增殖圖具體實施方式
實施例中採用的方法均為本領域常規操作，詳見《分子克隆》第三版。
實施例1不同來源冠狀病毒的同源序列將SARS全序列輸入Blast軟體，與GeneBank庫中所有已知冠狀病毒基因進行同源比較，發現如圖1所示的同源區，其同源序列如下。
表1.通過同源比較發現的冠狀病毒序列中極度保守的RNA序列
實施例2使用合成RNA雙鏈，降低SARS膜蛋白基因(SPIKE基因)的表達根據權利要求1中序列6，選取長19核苷酸的RNA片段，並根據互補原則合成該鏈的互補RNA鏈，並在RNA鏈的3』端用UU修飾，退火後的RNA雙鏈如下5』uggccuugguauguuuggcuu 3』3』uuaccggaaccauacaaaccg 5』質粒pCMV-Myc(Clontech公司)用EcoRI(10單位)和BglII(10單位)，37℃酶切2小時，回收片斷用作載體；合成SARS冠狀病毒膜蛋白基因的引物PS1cggaattcattttattttcttattatttcttactctcactagtggta；PS2 cgggatccttatgtgtaatgtaatttgacacc cttca。以SARS cDNA(1ng)為模板，上述引物各100ng，Pfu高保真DNA聚合酶2.5單位，dNTP 0.25mmol/L，MgCl22.5mmol/L，Tris.HCl(pH8.3)進行PCR反應(94℃ 30秒，46℃ 30秒，72℃ 90秒，使用PekinElmer 9600型PCR儀，共30循環)。PCR產物用QIAGEN純化試劑盒(QIAgen 28704)，然後用EcoRI和BamHI酶切(條件同前)，和上述載體一起進行連接反應，連接產物轉化大腸桿菌JM109(Promega公司)，獲得完全正確的質粒pSPIKE，該質粒轉染細胞後可表達帶Myc標籤的冠狀病毒S基因(圖2)。
上述質粒2μg與上述合成的RNA2μg(或2μg例3種使用的與Spike基因無關的雙鏈RNA鏈為對照)一起共轉染HEK293細胞(ATCC，轉染方法使用InvitrogenLipofectamine 2000，見其說明書)，36小時後裂解細胞，通過抗Myc抗體進行免疫印跡(方法見分子克隆第三版)，比較蛋白的表達產量。
結果如圖3所示，與對照比較，冠狀病毒Spike基因的表達產量降低了80-90％。由於該蛋白含有病毒進入細胞的識別序列，因此抑制該基因的表達可以阻止病毒的繁殖。
實施例3使用合成RNA雙鏈抑制衣殼蛋白基因的表達根據權利要求1中序列7，選取長19核苷酸的RNA片段，並根據互補配對的原則合成其互補鏈，並在RNA鏈的3』端用UU修飾，退火後的RNA雙鏈如下5』gaguacgaucgaggguacauu 3』3』uucucaugcuagcucccaugu 5』質粒pCMV-cMyc(Clontech公司)用EcoRI(10單位)和BglII(10單位)，37℃酶切2小時，回收片斷用作載體；合成SARS冠狀病毒核衣殼蛋白基因(N基因)的引物PN1cggaattccatatgtctgataatggaccccaatcaaa；PN2cggaattcggatccttatgcctgagttgaatcagcagaagc。以SARS cDNA(1ng)為模板，上述引物各100ng，按如實施例2所述條件進行PCR擴增並克隆至上述載體，獲得正確的質粒pNUC，該質粒染細胞後可表達帶Myc標籤的核衣殼蛋白。
上述質粒(pNUC)2μg與上述合成的RNA 2μg(或2μg實施例2中使用的與N蛋白無關的雙鏈RNA為對照)一起，如實施例2共轉染HEK293細胞，36小時後裂解細胞，通過抗Myc抗體進行免疫印跡(方法見分子克隆第三版)，比較蛋白的表達產量。
結果如圖4所示，與對照比較，冠狀病毒N基因的表達產量降低了80-90％。由於該蛋白為病毒的外殼蛋白，失去該蛋白的病毒不能擴增，因此可以有效阻止病毒擴增。
實施例4使用合成RNA雙鏈抑制其他冠狀病毒基因的表達按照實施例2所述的方法，使用合成1，3，4，5所對應的RNA雙鏈，和表達RNA依賴的RNA聚合酶的報告質粒一起轉染HEK293細胞後，可有效抑制RNA聚合酶基因的表達。其抑制效率見表2。
表2新型雙鏈核糖核酸抑制冠狀病毒RNA聚合酶基因表達的效率
注++抑制效率25-50％；+++抑制效率50-75％；++++抑制效率)75％實施例5.真核載體表達的RNA雙鏈抑制冠狀病毒基因的表達合成實施例1中保守序列6對應的DNA序列及其互補序列(黑斜體)的DNA片斷，兩端含有BamHI和HindIII的粘末端，中間含有9核苷酸的間隔序列。合成序列如下退火後形成雙鏈DNA片斷。
A5』gatcccctggccttggtatgtttggcttcaagagagccaaacataccaaggccatttttggaaa；B5』agcttttccaaaaatggccttggtatgtttggctctcttgaagccaaacataccaaggccaggg片斷A、B退火後形成雙鏈DNA片斷。按文獻所述方法(BrummelkampTR et al，Science，296550.2002)克隆至表達載體pSUPER，獲得質粒pSUPER-S。
質粒pSUPER-S與質粒pSPIKE(見實施例2)一起轉染HEK293細胞(以質粒pSUPER為陰性對照，轉染方法見實施例2)，轉染後36小時裂解細胞，用抗Myc抗體進行免疫印跡，如圖3所示，結果表明SPIKE蛋白的表達量顯著降低。
實施例6.使用腺病毒伴隨病毒載體表達得RNAi可以抑制病毒複製。
將例5質粒pSUPER-S用EcoRI+HindIII酶切(酶切條件如前述)，克隆至腺相關病毒載體pAAV-MCS(Stratagen公司)的EcoRI和HindIII位點(連接方法見圖2)。構建質粒pAAV-Si，將該質粒(4μg)與輔助質粒pHelper 1μg(Stratagen公司)和質粒pAAV-RC 2μg(Stragagen公司)一起用Lipofectamine法共轉染HEK293FT細胞，48小時後取上清製備重組AAV病毒；Vero細胞用DMEM培養基(Invitrogen公司，含10％胎牛血清)培養至50％密度，用上述108重組腺相關病毒感染Vero細胞(以pAAV-MCS為對照)，同時用SARS病毒感染，24小時吸去上清，細胞裂解後進行SDS-PAGE電泳，並轉移(BioRad公司半乾轉移電泳)至硝酸纖維素膜，用5％脫脂奶粉封閉後，加10ml 1∶50稀釋的恢復期SARS病人血清，孵育1小時後用PBST(pH7.4)洗三次，加抗人IgG-HRP，孵育1小時後用，PBST洗滌如上。如實施例2進行顯色。結果冠狀病毒SPIKE蛋白有顯著著色。在使用表達雙鏈RNA(RNAi)的重組AAV感染後，細胞內SPIKE抗原顯著降低(如圖5所示)，說明細胞內冠狀病毒數量大大降低。
序列表110北京三諾佳邑生物技術有限責任公司120一組抗冠狀病毒感染及防治非典型肺炎的核苷酸序列及其應用130
1607170PatentIn version 3.1210121120212RNA213冠狀病毒屬(coronavirus genera)4001ugggauuauc caaaauguga 20210221123212RNA213冠狀病毒屬(coronavirus genera)4002uguuuuggaa uuguaacguu gau 23210321125212RNA213冠狀病毒屬(coronavirus genera)4003uaacucaaau gaaucuuaag uaugc 25210421120212RNA213冠狀病毒屬(coronavirus genera)
4004uauuaucaaa auaauguguu20210521121212RNA213冠狀病毒屬(coronavirus genera)4005uuuaacauuu gucaagcugu u 21210621129212RNA213冠狀病毒屬(coronavirus genera)4006uauauuaaau ggccuuggua uguuuggcu 29210721129212RNA213冠狀病毒屬(coronavirus genera)4007ggccacgcgg aguacgaucg aggguacag 29
權利要求
1.一組抗冠狀病毒感染及防治非典型肺炎的RNA序列及其片段，該組RNA序列如下(1)ugggauuauccaaaauguga(2)uguuuuggaauuguaacguugau(3)uaacucaaaugaaucuuaaguaugc(4)uauuaucaaaauaauguguu(5)uuuaacauuugucaagcuguu(6)uauauuaaauggccuugguauguuuggcu(7)ggccacgcggaguacgaucgaggguacag。
2.一組由權利要求1所述的RNA序列及其片段和與之互補的序列雜交形成的雙鏈RNA序列。
3.一組由權利要求1或2所述的RNA序列及其片斷在其5』端或3』端加核苷酸修飾的序列。
4.一組由權利要求1或2所述的RNA序列及其片段和與之反向互補的序列加上中間非互補連接序列形成的髮夾樣RNA雙鏈。
5.一組權利要求1或2所述序列對應的DNA序列。
6.一組權利要求3所述序列對應的DNA序列。
7.一組權利要求4所述序列對應的DNA序列。
8.包含權利要求1或2所述的RNA序列的表達載體。
9.包含權利要求3所述的RNA序列的表達載體。
10.包含權利要求4所述的RNA序列的表達載體。
11.包含權利要求5所述的DNA序列的表達載體。
12.包含權利要求6或7所述的DNA序列的表達載體。
13.包裹權利要求1或2所述的RNA序列的脂質體。
14.包裹權利要求3所述的RNA序列的脂質體。
15.包裹權利要求4所述的RNA序列的脂質體。
16.包裹權利要求5所述的DNA序列的脂質體。
17.包裹權利要求6或7所述的DNA序列的脂質體。
18.包裹權利要求8所述的表達載體的脂質體。
19.包裹權利要求9或10或11所述的表達載體的脂質體。
20.包裹權利要求12所述的表達載體的脂質體。
21.將權利要求1或2所述的RNA序列在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
22.將權利要求3所述的RNA序列在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
23.將權利要求4所述的RNA序列在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
24.將權利要求5所述的DNA序列在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
25.將權利要求6或7所述的DNA序列在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
26.將權利要求8所述的表達載體在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
27.將權利要求9或10或11所述的表達載體在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
28.將權利要求12所述的表達載體在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
29.將權利要求13所述的脂質體在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
30.將權利要求14或15或16或18或20所述的脂質體在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
31.將權利要求17所述的脂質體在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
32.將權利要求19所述的脂質體在體內或體外導入真核細胞系、動物及人體的方法。
33.權利要求1或2所述的RNA序列及其片段用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
34.權利要求3所述的RNA序列及其片段用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
35.權利要求4所述的RNA序列及其片段用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
36.權利要求5所述的DNA序列及其片段用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
37.權利要求6或7所述的DNA序列及其片段用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
38.權利要求8所述的表達載體用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
39.權利要求9或10或11所述的表達載體用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
40.權利要求12所述的表達載體用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
41.權利要求13所述的脂質體用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
42.權利要求14或15或16或18或20所述的脂質體用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
43.權利要求17所述的脂質體用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
44.權利要求19所述的脂質體用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
45.權利要求21所述的方法用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
46.權利要求22或23或24或26或28或29或31或32所述的方法用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
47.權利要求25所述的方法用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
48.權利要求27所述的方法用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
49.權利要求30所述的方法用於製備抗冠狀病毒感染及非典型肺炎診斷、治療和預防的藥物的應用。
全文摘要
本發明提供了一組抗冠狀病毒感染及防治非典型肺炎的核苷酸序列及其應用，該序列如序列表所示。本發明的優點是通過同源比較，獲得一系列與所有已經發表的冠狀病毒序列高度同源的RNA序列片段，使用該系列片段衍生的雙鏈RNA序列可以有效地抑制冠狀病毒基因的表達；使用質粒轉錄的該系列RNA也可在細胞內抑制冠狀病毒基因的表達；攜帶該片段對應DNA腺病毒伴隨病毒感染細胞後可以轉錄出對應的雙鏈RNA並抑制冠狀病毒基因的表達。
文檔編號C12N15/88GK1539967SQ0312790
公開日2004年10月27日 申請日期2003年4月23日 優先權日2003年4月23日
發明者周志文, 馮宇霞, 左叢林, 李月娟, 趙春文 申請人:北京三諾佳邑生物技術有限責任公司