金黃色葡萄球菌裂解蛋白的製備方法及其應用的製作方法
2023-09-14 23:05:00
金黃色葡萄球菌裂解蛋白的製備方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明通過篩選潛在編碼金黃色葡萄球菌裂解蛋白基因，成功得到3個可純化金黃色葡萄球菌裂解蛋白，並且都有活性，其胺基酸序列如SEQIDNO.1，SEQIDNO.2，SEQIDNO.3所示，其對應名稱分別為SAlylOO、SAlyl02、SAlyllO。本發明製備的金黃色葡萄球菌裂解蛋白可以高效、特異裂解宿主細菌，不易產生耐藥菌株，並且無毒無害，是抗生素的最佳替代品之一，可以用於治療金黃色葡萄球菌感染引起的疾病，並可用作醫療消毒劑和添加劑。
【專利說明】金黃色葡萄球菌裂解蛋白的製備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一系列新型的金黃色葡萄球菌裂解蛋白的製備，該系列蛋白可以用於 治療金黃色葡萄球菌感染引起的一系列疾病，還可以作為醫療外用消毒劑及添加劑使用， 屬於醫學、獸醫學及醫療器械類生物製劑領域。
【背景技術】
[0002] 金黃色葡萄球菌屬於革蘭氏陽性球菌，在環境中廣泛存在，是醫院內感染的重要 病原菌之一，也是引起奶牛乳腺炎等的主要致病菌之一。金黃色葡萄球菌具有較強的抵抗 力，在臨床治療中發現，金黃匍甸球囷對青黴素、金黴素、紅黴素和慶大黴素1?度敏感，但易 產生耐藥性；對鏈黴素中度敏感；但對磺胺、氯黴素敏感性差。
[0003] 目前臨床上普遍發現多種耐藥菌株，對多種抗生素藥物耐藥，新出現的耐甲氧西 林金黃色葡萄球菌（MRSA)幾乎可以抵抗所有的抗生素，被稱為超級細菌，已成為醫院內感 染最常見的致病菌。耐藥菌株導致感染治療困難，病死率較高，已成為全球公共衛生體系的 重大危害。畜牧業中，耐藥金黃葡萄球菌引起的牛乳腺炎給奶牛養殖業造成的極大的損失， 現在依然沒有很有效的解決方法。因此，發展新的抗菌分子已刻不容緩。
[0004] 噬菌體是以細菌為宿主的病毒，噬菌體有嚴格的宿主特異性，可以高效、特異性裂 解宿主細菌，高效安全，對哺乳動物不具備侵染性。目前，臨床上已經應用噬菌體治療某些 疾病。噬菌體裂解細菌的機制是噬菌體侵染宿主細菌，釋放遺傳信息，控制宿主細胞代謝， 合成噬菌體自身的遺傳信息和蛋白，在宿主體內組裝成新的噬菌體。通過合成的裂解蛋白 將宿主細胞壁裂解，細菌滲透壓改變，細胞破碎，噬菌體釋放。細菌噬菌體裂解蛋白具有高 效、特異及不產生耐藥菌株等特點。
[0005] 細菌裂解蛋白序列和結構具有保守性，主要有兩部分組成：一部分為催化結構域， 另一部分為細胞壁結合結構域。細菌裂解蛋白通過細胞壁結合結構域特異性結合到細菌的 細胞壁上，催化結構域特異性的識別細胞壁肽聚糖的切割位點裂解細胞壁，細菌由於細胞 壁破裂，導致細菌內部滲透壓過大，細胞膜破裂，細菌死亡。細菌裂解蛋白具有高效、特異， 不易產生耐藥菌株等特點，並且作用完畢後最終代謝成胺基酸，無毒無害，是替代抗生素的 最佳候選之一，因此具有很重要的臨床應用價值。
[0006] 目前原核系統表達細菌裂解蛋白具有表達量低、可溶性差及活性弱等缺點，不利 用大規模的工業化生產。經過大量的篩選，本發明涉及的金黃色葡萄球菌裂解蛋白克服了 以上缺點，更加利於大規模的工業生產和臨床應用。
【發明內容】
[0007] 針對現有技術的不足，本發明提供一系列金黃色葡萄球菌裂解蛋白的製備，檢測 以及該系列蛋白的應用。
[0008] 發明概述
[0009] 本發明通過篩選潛在編碼金黃色葡萄球菌裂解蛋白基因，成功得到3個可純化金 黃色葡萄球菌裂解蛋白，並且都有活性，其胺基酸序列如SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 2，SEQ ID NO. 3所示，其對應的名稱分別為SAlylOO、SAlyl02、SAlyllO。本發明製備的金黃色葡萄球 菌裂解蛋白可以高效、特異裂解宿主細菌，不易產生耐藥菌株，並且無毒無害，是抗生素的 最佳替代品之一，可以用於治療金黃色葡萄球菌感染引起的疾病，並可用作醫療消毒劑和 添加劑。
[0010] 發明詳述
[0011] 本發明的技術方案如下：
[0012] 一、金黃色葡萄球菌裂解蛋白
[0013] 一種金黃色葡萄球菌裂解蛋白，其序列為SEQ ID NO. 1所示的胺基酸序列。
[0014] 一種金黃色葡萄球菌裂解蛋白，其序列為SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列。
[0015] 一種金黃色葡萄球菌裂解蛋白，其序列為SEQ ID NO. 3所示的胺基酸序列。
[0016] 二、金黃色葡萄球菌裂解蛋白的製備方法
[0017] 本發明還提供了金黃色葡萄球菌裂解蛋白的製備方法，通過基因工程的方法獲 得，其步驟包括：
[0018] (1)首先進行人工基因合成，同時根據基因序列設計合成一對引物，在引物中引 入酶切位點NdeI和Xhol，以合成的基因為模板，用合成的引物進行基因擴增，擴增程序如 下：94°C預變性2min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin30s，32個循環，72°C延伸 5min，得到的基因擴增產物用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，通過百泰克膠回收試劑盒回收基因擴 增產物；
[0019] (2)用NdeI和XhoI分別酶切回收的基因擴增產物和原核表達載體pET28a，37°C 酶切2h，然後用百泰克膠回收試劑盒回收酶切產物；酶切後的基因片段和表達載體用NEB T4連接酶16°C連接2h，連接產物全量轉化DH5 α感受態細胞，並塗布到含有卡那青黴素的 LB平板上37°C倒置過夜培養；挑取單克隆菌落進行PCR鑑定，將鑑定正確的單克隆提取質 粒進行酶切鑑定，將酶切鑑定正確的單克隆進行DNA測序，對測序結果進行比對，結果顯示 與我們所需的DNA完全一致；
[0020] (3)將構建成功的重組表達載體轉化至大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)，37°C倒置 過夜培養，挑取單克隆至LB培養基中做表達檢測，通過SDS-PAGE膠鑑定表達量高的單克隆 菌株保存甘油菌；
[0021] (4)將表達菌株甘油菌以1:1000的比例接種至50ml含有50 μ g/ml Kan的LB液 體培養基中，37°C 210rpm過夜培養，5000rpm IOmin離心收集菌體，用5ml LB液體培養基 重懸，然後加入到含有50 μ g/ml Kan的IL LB液體培養基中37°C 210rpm培養至0D600達 0. 6,加入終濃度0. 5mM IPTG 20°C195rpm過夜誘導表達；5000rpm IOmin離心收集菌體，收 集的菌體用50mM PB 500mM NaCl 5mM咪唑pH 7. 4重懸備用；
[0022] (5)將菌懸液加入蛋白酶抑制劑，在冰浴條件下超聲破碎，超聲破碎的溶液 4? 18000rpm 30min離心去除沉澱，上清用0. 22μηι濾膜過濾備用；
[0023] (6)蛋白純化所用Ni親和柱為預裝柱，首先用Buffer A平衡柱子，然後通過蠕動 泵將蛋白溶液上樣至鎳柱，將柱子連接至AKTA Primer機器上，用Buffer A洗脫柱子，直至 基線洗平，依次換用10%Buffer A、20%Buffer A洗脫雜蛋白，最後用洗脫目的蛋白，收集 目的蛋白，通過SDS-PAGE膠檢測得到純度達90%以上蛋白；
[0024] (7)將收集的目的蛋白過夜透析換液成0· OlM PBS(pH 7.4)，濃縮貯存於液氮備 用。
[0025] 進一步，所述的 Buffer A 為 50mM PB 500mM NaCl 5mM 咪唑 pH 7. 4。
[0026] 進一步，所述的 Buffer B 為 50mM PB 500mM NaCl 500mM 咪唑 pH 7.4。
[0027] 三、金黃色葡萄球菌裂解蛋白體外抑菌活性檢測
[0028] 所述金黃色葡萄球菌裂解蛋白採用微孔板法進行裂解蛋白活性檢測，其具體步驟 如下：
[0029] (1)採用的金黃色葡萄球菌菌株包括標準菌株CMCC26112,臨床分離菌株共9株和 臨床分離耐藥菌株MRSA ;將37°C 24h培養的金黃色葡萄球菌5000rpm離心IOmin收集菌 體，用0. OlM無菌PBS重懸菌體，然後在微孔板分別加入50 μ 1重懸的菌液，實驗組每孔加 入5μ l(lmg/ml)金黃色葡萄球菌裂解蛋白，對照組加入5μ 1 0. 01MPBS，37°C培養箱中孵 育，每隔15min用分光光度計檢測0D600,記錄實驗數據；
[0030] (2)採用二倍稀釋法檢測所得金黃色葡萄球菌裂解蛋白的最小抑菌濃度（MIC)， 取10支無菌試管排成一列，每支試管中加入Iml營養肉湯培養基，然後往第一支試管中 加入lml(lmg/ml)金黃色葡萄球菌裂解蛋白混勻，然後從第一管中吸取Iml加入到第二 管中混勻，再從第二管中吸取Iml加入第三管中，依此類推，直至加到第八管，此時各管 金黃色葡萄球菌裂解蛋白的濃度依次為500μ g/ml、250y g/ml、125y g/ml、62. 5μ g/ml、 31. 25 μ g/ml、15. 625 μ g/ml、7. 8125 μ g/ml、3. 90625 μ g/ml，每管加入適量的金黃色葡萄 球菌菌液，第九管作為陽性對照，只加菌液不加金黃色葡萄球菌裂解蛋白；第十管作為陰性 對照不加菌液；將上述各管依次放入37°C培養箱培養20h，觀察培養基的渾濁度，根據渾濁 度判斷金黃色葡萄球菌裂解蛋白的MIC。
[0031] 本發明製備的金黃色葡萄球菌裂解蛋白可以高效、特異裂解宿主細菌，不易產生 耐藥菌株，並且無毒無害，是抗生素的最佳替代品之一，可以用於製備治療金黃色葡萄球菌 感染引起的一系列疾病的藥物中的應用，並還可用作醫療消毒劑和添加劑等。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032] 圖1為金黃色葡萄球菌裂解蛋白重組質粒構建流程圖
[0033] 圖2SDS-PAGE膠檢測重組金黃色葡萄球菌裂解蛋白純化效果
[0034] LSAlylOO 2. SAlyl02 3. SAlyllO
[0035] 圖3重組金黃色葡萄球菌裂解蛋白SAlylOO抑菌效果圖
[0036] 1-9為臨床分離菌株10為標準菌株CMCC26112
[0037] 圖4重組金黃色葡萄球菌裂解蛋白SAly 102抑菌效果圖
[0038] 1-9為臨床分離菌株10為標準菌株CMCC26112
[0039] 圖5重組金黃色葡萄球菌裂解蛋白SAlyllO抑菌效果圖
[0040] 1-9為臨床分離菌株10為標準菌株CMCC26112
[0041] 圖6重組金黃色葡萄球菌裂解蛋白對臨床分離MRSA抑菌效果圖
[0042] 其中X軸為孵育培養時間，Y軸為Treated/Untreated 0D600值，隨著時間增長OD 值降低，表明黃色葡萄球菌裂解蛋白對實驗菌株有明顯抑制效果。
【具體實施方式】
[0043] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並 不用於限定本發明。
[0044] 實施例1 :
[0045] 1)金黃色葡萄球菌裂解蛋白基因克隆及表達載體構建
[0046] 首先進行人工基因合成，同時根據基因序列設計合成一對引物，在引物中引入酶 切位點NdeI和Xhol，設計的引物序列如下：
[0047] SAlylOO 引物序列：
[0048] 上遊引物：GGAATTC CATATG GCTACTGTAAACGAA
[0049] 下遊引物：CCG CTCGAG TTACTTGAAAGTACCCCAAGCAT
[0050] SAly 102 引物序列：
[0051] 上遊引物：GGAATTC CATATG GCTACTTTAAACGAT
[0052] 下遊引物：CCG CTCGAG TTAAGAGAATGAACCAAAGC
[0053] SAlyllO 引物序列：
[0054] 上遊引物：GGAATTC CATATG GCTACTTTAAACGAT
[0055] 下遊引物：CCG CTCGAG TTACTTGAATGAACCAAAATC
[0056] 以合成的基因為模板，用合成的引物進行基因擴增，擴增程序如下：94°C預變性 2min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin30s，32個循環，72°C延伸5min。得到的基 因擴增產物用〇. 8%瓊脂糖凝膠電泳，通過百泰克膠回收試劑盒回收基因擴增產物。用NEB 公司的NdeI和XhoI分別酶切回收的基因擴增產物和原核表達載體pET28a，37°C酶切2h， 然後用百泰克膠回收試劑盒回收酶切產物。酶切後的基因片段和表達載體用NEB T4連接 酶16°C連接2h，連接產物全量轉化DH5 α感受態細胞，並塗布到含有卡那青黴素的LB平板 上37°C倒置過夜培養。挑取單克隆菌落進行PCR鑑定，將鑑定正確的單克隆提取質粒進行 酶切鑑定，將酶切鑑定正確的單克隆進行DNA測序，對測序結果進行比對，結果顯示與我們 所需的DNA完全一致。
[0057] 2)金黃色葡萄球菌裂解蛋白的誘導表達
[0058] 將構建成功的重組表達載體轉化至大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)，37°C倒置過夜 培養，挑取單克隆至LB培養基中做表達檢測，通過SDS-PAGE膠鑑定表達量高的單克隆菌株 保存甘油菌。將表達菌株甘油菌以1:1000的比例接種至50ml含有50 μ g/ml Kan的LB液 體培養基中，37°C 210rpm過夜培養，5000rpm IOmin離心收集菌體，用5ml LB液體培養基 重懸，然後加入到含有50 μ g/ml Kan的IL LB液體培養基中37°C 210rpm培養至0D600達 0. 6,加入終濃度0. 5mM IPTG 20°C195rpm過夜誘導表達。5000rpm IOmin離心收集菌體， 收集的菌體用50mM PB 500mM NaCl 5mM咪唑pH7. 4重懸備用。
[0059] 3)金黃色葡萄球菌裂解蛋白純化
[0060] 將菌懸液加入蛋白酶抑制劑，在冰浴條件下超聲破碎，超聲破碎的溶液 4°C 18000rpm 30min離心去除沉澱，上清用0. 22 μ m濾膜過濾備用。
[0061] 蛋白純化所用Ni親和柱為GE公司預裝柱，首先用Buffer A (50mM PB 500mM NaCl 5mM咪唑pH 7.4)平衡柱子，然後通過蠕動泵將蛋白溶液上樣至鎳柱，將柱子連接至AKTA Primer機器上，用Buffer A(50mM PB 500mM NaCl 5mM咪唑pH 7.4)洗脫柱子，直至基線洗 平，依次換用 10% Buffer A、20 % Buffer A 洗脫雜蛋白，最後用 Buffer B (50mM PB 500mM NaCl 500mM咪唑pH 7. 4)洗脫目的蛋白，收集目的蛋白，通過SDS-PAGE膠檢測得到純度達 90 %以上蛋白。
[0062] 將收集的目的蛋白過夜透析換液成0. OlM PBS(pH 7. 4)，濃縮貯存於液氮備用。
[0063] 實施例2 :金黃色葡萄球菌裂解蛋白體外抑菌活性檢測
[0064] 本發明採用微孔板法進行金黃色葡萄球菌裂解蛋白活性檢測，採用的金黃色葡萄 球菌菌株包括標準菌株CMCC26112,臨床分離菌株共9株和臨床分離耐藥菌株MRSA。將 37°C 24h培養的金黃色葡萄球菌5000rpm離心IOmin收集菌體，用0. OlM無菌PBS重懸菌 體，然後在微孔板分別加入50 μ 1重懸的菌液，實驗組每孔加入5 μ I (lmg/ml)裂解蛋白，對 照組加入5 μ 1 0. OlM PBS，37°C培養箱中孵育，每隔15min用分光光度計檢測0D600,記錄 實驗數據，實驗結果如圖4所示。
[0065] 採用二倍稀釋法檢測所得金黃色葡萄球菌裂解蛋白的最小抑菌濃度（MIC)。
[0066] 取10支無菌試管排成一列，每支試管中加入Iml營養肉湯培養基，然後往第一支 試管中加入lml(lmg/ml)金黃色葡萄球菌裂解蛋白混勻，然後從第一管中吸取Iml加入到 第二管中混勻，再從第二管中吸取Iml加入第三管中，依此類推，直至加到第八管，此時各 管金黃色葡萄球菌裂解蛋白的濃度依次為500 μ g/ml、250 μ g/ml、125 μ g/ml、
[0067] 62. 5 μ g/ml、31. 25 μ g/ml、15. 625 μ g/ml、7. 8125 μ g/ml、3. 90625 μ g/ml，每管加 入適量的金黃色葡萄球菌菌液，第九管作為陽性對照，只加菌液不加金黃色葡萄球菌裂解 蛋白；第十管作為陰性對照不加菌液。將上述各管依次放入37°C培養箱培養20h，觀察培養 基的渾濁度，根據渾濁度判斷金黃色葡萄球菌裂解蛋白的MIC為7. 8125-62. 5 μ g/ml。
[0068] 以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，本發明涉及的材 料均為已知材料，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應 包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1. 一種金黃色葡萄球菌裂解蛋白，其序列為SEQ ID NO. 1所示的胺基酸序列。
2. -種金黃色葡萄球菌裂解蛋白，其序列為SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列。
3. -種金黃色葡萄球菌裂解蛋白，其序列為SEQ ID NO. 3所示的胺基酸序列。
4. 如權利要求1-3所述的胺基酸序列，及與其同源性在80%、85%、90%、95%及以上 的同源性序列。
5. 權利要求1-3所述的一種金黃色葡萄球菌裂解蛋白的製備方法，其步驟是： (1) 首先進行人工基因合成，並根據基因序列設計合成引物，在其中引入酶切位點 NdeI和Xhol，以合成的基因為模板，用合成的引物進行基因擴增，電泳純化後回收基因擴 增產物； (2) 用NdeI和XhoI分別酶切回收的基因擴增產物和原核表達載體pET28a，回收酶切 產物；酶切後的基因片段和表達載體用NEBT4連接酶連接，連接產物轉化至DH5 α感受態 細胞，並塗布到含有卡那青黴素的LB平板上37°C倒置過夜培養；挑取單克隆菌落以PCR鑑 定，將鑑定正確的單克隆菌株提取質粒酶切鑑定，並DNA測序確認； (3) 將構建成功的重組表達載體轉化至大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)，37°C倒置過夜 培養，挑取單克隆至LB培養基中做表達檢測，篩選表達量高的單克隆菌株保存甘油菌； (4) 將表達菌株甘油菌擴大培養，誘導表達。收集表達菌體，加入蛋白酶抑制劑，超聲破 碎後去除沉澱，上清濾膜過濾後以Ni親和柱純化，收集純化的目的蛋白，以SDS-PAGE膠檢 測純度。將純度大於90%的目的蛋白過夜透析濃縮後存於液氮備用。
6. 根據權利要求4所述的一種金黃色葡萄球菌裂解蛋白的製備方法，其特徵在於： 製備序列為SEQ ID NO. 1金黃色葡萄球菌裂解蛋白步驟（1)中的引物為SAlylOO引物 序列： 上遊引物：GGAATTC CATATG GCTACTGTAAACGAA 下遊引物：CCG CTCGAG TTACTTGAAAGTACCCCAAGCAT。
7. 根據權利要求4所述的一種金黃色葡萄球菌裂解蛋白的製備方法，其特徵在於： 製備序列為SEQ ID NO. 2金黃色葡萄球菌裂解蛋白步驟（1)中的引物為SAlyl02引物 序列： 上遊引物：GGAATTC CATATG GCTACTTTAAACGAT 下遊引物：CCG CTCGAG TTAAGAGAATGAACCAAAGC。
8. 根據權利要求4所述的一種金黃色葡萄球菌裂解蛋白的製備方法，其特徵在於： 製備序列為SEQ ID NO. 2金黃色葡萄球菌裂解蛋白步驟（1)中的引物為SAlyllO引物 序列： 上遊引物：GGAATTC CATATG GCTACTTTAAACGAT 下遊引物：CCG CTCGAG TTACTTGAATGAACCAAAATC。
9. 權利要求1-3任一所述的一種金黃色葡萄球菌裂解蛋白體外抑菌活性檢測方法，所 述金黃色葡萄球菌裂解蛋白採用微孔板法進行裂解蛋白活性檢測，其具體步驟如下： (1) 將37°C 24h培養的多種金黃色葡萄球菌標準菌株離心，收集菌體，重懸後加入微孔 板，每孔分別加入50 μ 1重懸的菌液，每孔2個重複，分別記為實驗組和對照組； (2) 實驗組每孔加入5 μ g金黃色葡萄球菌裂解蛋白，對照組加入5 μ L 0. 01MPBS，37°C 培養箱中孵育，每隔一定時間用分光光度計測定600nm的OD值，記錄實驗數據； (2)採用二倍稀釋法檢測所得金黃色葡萄球菌裂解蛋白的最小抑菌濃度（MIC)，取8 支含有Iml液體培養基的無菌試管，每管中分別加入最終濃度為500 μ g/ml、250 μ g/ml、 125 μ g/ml、62. 5 μ g/ml、31. 25 μ g/ml、15. 625 μ g/ml、7. 8125 μ g/ml、3. 90625 μ g/ml 金黃 色葡萄球菌裂解蛋白，繼續在其中加入適量的金黃色葡萄球菌菌液，另取2管，其中I管作 為陽性對照，加入培養基和金黃色葡萄球菌菌液，另1管作為陰性對照，只加入培養基；將 上述各管依次放入37°C培養箱培養20h，根據渾濁度判斷金黃色葡萄球菌裂解蛋白的MIC。
10.權利要求1-3中的任意一項所述的一種金黃色葡萄球菌裂解蛋白在製備治療金黃 色葡萄球菌感染引起的一系列疾病的藥物或醫療消毒劑或添加劑中的應用中的應用。
【文檔編號】C12R1/445GK104211781SQ201410447144
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月4日 優先權日:2014年9月4日
【發明者】朱文壯, 劉勇, 宋世燕, 楊春江, 孟賡, 秦堃, 莫勳, 馬孝斌 申請人:北京納百景弈生物科技有限公司