一種高純度絕經期促性腺素及其製備方法和用途的製作方法
2023-09-13 03:43:10
專利名稱：一種高純度絕經期促性腺素及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質純化和生物醫藥領域。具體而言，本發明涉及一種高純度絕經 期促性腺素及其製備方法和用途。
背景技術：
絕經期促性腺素(Human Menopausal Gonadotropins，簡稱HMG)含有卵泡刺激素 (Follicle-stimulating hormone,簡禾爾 FSH)禾口黃體生成激素(leuteinizing hormone,簡 稱LH)兩種活性成分，它們是由垂體產生的糖蛋白激素，都是由α鏈和β鏈兩個亞基組 成。FSH的α亞基與LH、絨毛膜促性腺素(chorionic gonadotropin，簡稱CG)的α亞基完 全相同，具有92個胺基酸，分子量約為14500D，第52和78位置上的天冬醯胺是發生N-糖 基化的胺基酸。FSH的β亞基由111個胺基酸組成，分子量約為18000D，其中第7和24位 置上的天冬醯胺是發生N-糖基化的胺基酸。而LH的β亞基由121個胺基酸組成，分子量 約為14800D ；CG的β亞基則有145個胺基酸，分子量22000-39000D。臨床上HMG主要用於治療不育症，它可以從垂體或絕經期婦女的尿液中提取出 來，也可通過DNA重組技術而製備。含有FSH的第一代產品是尿促性素(HMG)，如Serono公司的Pergonal，它是FSH 與LH比例約為1的混合物。但是它的比活和純度都很低，比活一般在40-300IU/mg蛋白， 純度只有2-3%的有效成分，其餘約97%都是雜蛋白，由於雜蛋白含量大，對人體有潛在的 副作用，給藥方式也只能局限於肌肉注射。高純度的尿促性素(PHMG)是本領域所特別需要 的，它應當純度高、雜質少，不含有大量的雜蛋白，因此不會造成人體的過敏反應，並且由於 這些優點它可以使用皮下注射，提高患者的順應性。但是，pHMG的純化很有難度，由於它同時含有FSH和LH兩種成分，而且需要兩者 按一定的比例構成，而FSH和LH的結構性質又不相同，因此在後期的純化過程中很容易使 兩者分離從而導致達不到希望的比例，這在PHMG的純化中尤其突出，目前還沒有關於直接 獲得高純度HMG的方法的報導。因此本領域迫切需要開發出一種製備純度高、雜質少的高純度HMG的方法，便於 使用於皮下注射，方便患者的使用、減輕痛苦。
發明內容
本發明旨在提供一種純度高、雜質少的高純度HMG的製備方法。本發明的另一個目的是提供由上述方法純化得到的高純度HMG。本發明的又一個目的是提供由上述方法純化得到的高純度HMG的藥物組合物。本發明的再一個目的是提供由上述方法純化得到的高純度HMG的用途。在本發明中，提供了一種高純度絕經期促性腺素(purified HumanMenopausal Gonadotropins, pHMG)，其HPLC純度不低於95%，其雜質HPLC含量不超過5% ；優選HPLC 純度不低於96 %，雜質HPLC含量不超過4%。
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在另一優選例中，所述的絕經期促性腺素來自重組的絕經期促性腺素或其變體、 或人尿來源的絕經期促性腺素或其變體。在另一優選例中，所述的高純度的絕經期促性腺素中，卵泡刺激素(FSH)與黃體 生成素(LH)的生物效價比例為1 0. 1-3。在另一優選例中，所述的高純度絕經期促性腺素中，卵泡刺激素(FSH)與黃體生 成素(LH)的生物效價比例為1 0.5-1.4。在本發明的第二方面，提供了一種如上所述的本發明提供的高純度絕經期促性腺 素(PHMG)的製備方法，所述的方法包括步驟將低純度HMG通過染料親和層析純化，得到高 純度絕經期促性腺素；所述的低純度HMG比活在2000FSH國際單位/mg蛋白以下。在另一優選例中，所述的方法包括步驟(1)將含有低純度HMG的溶液上樣至染料親和層析的層析柱上；(2)用pH6-ll的緩衝液進行洗滌；和(3)用pH6-ll的緩衝液進行洗脫，得到高純度絕經期促性腺素。在另一優選例中，所述含有低純度HMG的溶液中低純度HMG的濃度為0. l-10w/v%o在另一優選例中，所述含有低純度HMG的溶液的pH為4-8。在另一優選例中，所述的緩衝液選自醋酸鈉溶液、醋酸銨溶液、甘氨酸-NaOH溶 液、Tris-HCl溶液或磷酸鹽溶液。在另一優選例中，在步驟(3)中包括下述步驟(3')用pH6-ll的緩衝液進行洗脫，收集洗脫液；(3")濃縮洗脫液後，加入無水乙醇，離心得到沉澱；和(3"『)將沉澱脫水，得到乾燥的高純度絕經期促性腺素。在另一優選例中，所述染料親和層析的填料的染料配基選自Cibacron Blue、 Orange、Red、Green0在另一優選例中，所述染料親和層析的填料的固相載體選自皂土、玻璃微球、石英 微球、羥磷酸鈣、氧化鋁、聚丙烯醯胺凝膠、澱粉凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素、或瓊脂糖。在另一優選例中，所述染料親和層析的填料選自Blue Sepharose FF或 BlueSepharose 6B。在本發明的第三方面，提供了一種藥物組合物，所述的組合物中含有治療有效量 的如上所述的本發明提供的高純度絕經期促性腺素，和藥學上可接受的載體。在本發明的第四方面，提供了一種如上所述的本發明提供的高純度絕經期促性腺 素的用途，所述高純度絕經期促性腺素用於製備治療不育綜合症的藥物。據此，本發明提供了一種製備純度高、雜質少的高純度HMG的方法，所得到的高純 度絕經期促性腺素便於使用於皮下注射，方便患者的使用、減輕痛苦。
圖1顯示了 pHMG的純度圖譜。
具體實施例方式發明人經過廣泛而深入的研究，驚奇地發現通過染料親和層析色譜可以獲得高純度的HMG，其HPLC純度彡95%，雜質HPLC含量彡5%，是目前已知純度最高的HMG，並且FSH 和LH的生物效價比例可以在要求的範圍內，如1 0.1-1 3。具體地，本發明將低純度 HMG通過染料親和層析純化，得到高純度絕經期促性腺素。如本文所用，「低純度HMG」是指生物效價在2000FSH國際單位(IU)/mg以下的HMG， 優選生物效價在40-500FSH IU/mg。可以通過本領域熟知的方法獲得低純度HMG，例如但不 限於，從絕經期婦女尿液中通過高嶺土吸附、洗脫，丙酮沉澱，乙醇溶液抽提，離子交換層析 色譜(包括陽離子、陰離子色譜)，甚至疏水色譜得到。也可以通過商業渠道獲得。低純度 HMG中FSH和LH的生物效價比例在1 0. 1_3範圍，更佳地，在1 0.5-1. 4範圍。如本文所用，「絕經期促性腺素」、「尿促性素」和「HMG」可以互換使用，都是指一類 由垂體產生的糖蛋白激素或其變體，含有FSH和LH兩種活性成分。可以是重組的絕經期促 性腺素或其變體、或是人尿來源的絕經期促性腺素或其變體。如本文所用，「卵泡刺激素」和「FSH」可以互換使用，都是指一類用於促進精子或卵 泡產生、促進卵巢發育的激素或其變體，其可在天然情況下由垂體前葉分泌，可從絕經期婦 女的尿液中提取或可通過重組技術獲得的。如本文所用，「黃體生成激素」和「LH」可以互換使用，都是指是由腦垂體前葉嗜鹼 性細胞分泌的，作用於成熟的卵胞，能引起排卵並生成黃體的一類激素或其變體。如本文所用，「雜質」是指除了絕經期促性腺素之外的其它物質，是指除FSH、LH以 外的雜蛋白，如降解亞基、聚合亞基等。其含量測定方法與本發明提供的檢測高純度絕經期 促性腺素純度的高效液相色譜(HPLC)方法一樣，在所述HPLC檢測條件下，通過面積歸一法 得到雜質含量。製備方法本發明提供的高純度絕經期促性腺素的製備方法，是將低純度HMG通過染料親和 層析純化。在本發明的一個實施例中，所述的製備高純度絕經期促性腺素的方法包括步驟(1)將含有低純度HMG的溶液上樣至染料親和層析的層析柱上；和(2)用pH6-ll的洗滌液進行洗脫，得到高純度絕經期促性腺素。染料親和層析的填料可以是本領域所熟知的，例如但不限於，Green瓊脂糖、 Orange瓊脂糖；較佳地為Blue瓊脂糖；更佳地為Blue Sepharose 6B。較佳地，所述洗滌液中的離子濃度在0. 01-5M，洗滌液選自醋酸鈉溶液、甘氨 酸-NaOH溶液、或Tris-HCl溶液。在本發明的一個優選實施例中，所述高純度絕經期促性腺素通過以下步驟獲得將含有低純度HMG的溶液上樣至染料親和層析的層析柱上；和用pH6-ll的緩衝液進行洗滌和洗脫，得到高純度絕經期促性腺素。在本發明的另一優選例中，所述的製備高純度絕經期促性腺素的方法包括步驟⑴將含有低純度HMG的溶液上樣至染料親和層析的藍色瓊脂糖 (BlueSepharose)層析柱上；所述的含有低純度HMG的溶液是將低純度HMG溶解於pH4_8緩 衝液；(ii)用步驟(i)中的緩衝液洗滌；(iii)用 pH6-ll 的 0. 03-0. 07M 甘氨酸-NaOH 緩衝液洗滌；
(iv)用含低濃度鹽的PH6-11的0. 03-0. 07M Tris-HCl緩衝液洗滌；(ν)用含高濃度鹽的ΡΗ6-11的0. 03-0. 07Μ Tris-HC緩衝液洗脫，收集洗脫液；(ν)濃縮洗脫液，加入無水乙醇，離心得到沉澱；和(vi)將沉澱脫水，得到乾燥的高純度絕經期促性腺素。所述的鹽是鹽酸鹽或硫酸鹽，其中的金屬離子選自Na、K、或銨；一般在步驟(iv) 和步驟(ν)中使用同一種鹽；所述的低濃度為0-0. 5M，較佳地為0. 1-0. 5M，更佳地為0. 3-0. 5M ；所述的高濃度 為0. 5-5M，較佳地為2-5M，更佳地為3-5M。在本發明提供的製備高純度絕經期促性腺素的方法中，所述的含有低純度HMG的 溶液是將低純度HMG溶解於0. 01-0. 03M醋酸鹽緩衝液而得；較佳地，所述含有低純度HMG 的溶液PH為4-8。高純度絕經期促性腺素(pHMG)通過本發明的方法可以製備得到高純度絕經期促性腺素，其雜質HPLC含量 較佳地，雜質HPLC含量< 4%。本發明製備得到的高純度的絕經期促性腺素中，卵泡刺激素(FSH)與黃體生成素 (LH)的生物效價比例為1 0. 1-3 ；較佳地，卵泡刺激素(FSH)與黃體生成素(LH)的生物 效價比例為1 0.5-1.4。藥物組合物如本文所用，術語「藥學上可接受的載體」指用於治療劑給藥的載體，包括各種 賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身並不是必要的活性成分，且施 用後沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N. J. 1991)中可找到關於藥學上可接受的賦形 劑的充分討論。在組合物中藥學上可接受的載體可包括液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另 外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如崩解劑、潤溼劑、乳化劑、PH緩衝物質等。所述藥物組合物可以根據不同給藥途徑而製備成各種劑型。這些劑型以下面方式 之一施用口服、局部用藥、非腸道用藥，如皮下、靜脈、和肌肉注射或輸入，或藉助一種外植 儲器用藥。其中優選優選皮下注射給藥方式。用途通過本發明的方法製備得到的高純度絕經期促性腺素可以用於製備治療不育綜 合症的藥物，所述的藥物可以通過常規途徑施用，其中包括(但並不限於)肌注、皮下注射 等。優選皮下注射施用。藥物製劑形式應與施用方式相匹配。藥物的施用量，按活性物質計 算，通常為每天約0. 01-5μ g/kg體重，較佳地約0. 05-0. 5ug/kg體重，更優選為0. 2-0. 4ug/ kg體重。本發明的藥物可直接使用，也可與其它治療劑或輔劑聯合使用。本發明提到的上述特徵，或實施例提到的特徵可以任意組合。本案說明書所揭示 的所有特徵可與任何組合物形式並用，說明書中所揭示的各個特徵，可以任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特徵取代。因此除有特別說明，所揭示的特徵僅為均等或相似特 徵的一般性例子。本發明的主要優點在於
1、提供了一種高純度、雜質少的HMG，可應用於皮下注射；2、提供了一種高純度HMG的純化方法，方法簡單有效，適合產業化。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分數、比率、比例、或份數按 重量計。本發明中的重量體積百分比中的單位是本領域技術人員所熟知的，例如是指在 100毫升的溶液中溶質的重量。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明方法中。文 中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。本發明中FSH、LH生物效價的測定按中國藥典2005版附錄XII M、XII N的方法進行。比活是指單位重量的蛋白中所含的效價，在本發明中，HMG或pHMG的比活是指每 毫克蛋白中含多少國際單位FSH或LH。其中，蛋白含量的測定方法是按照Lowry法或其衍 生的方法進行測定。本發明中HPLC純度或HPLC含量是指按照面積歸一化法計算的峰面積百分比。本發明中絕經期促性腺素純度的測定方法如下(檢測限為2. 5IU)色譜柱Superdex7510/300 GL流動相乙腈0. 2M磷酸鈉溶液pH7. 0 = 200 1000樣品配製取樣品用流動相溶解至500IU/mL進樣量100μ L柱溫30°C流速0· 5mL/min檢測波長215nm運行時間60min絕經期促性腺素主峰保留時間約為18-19min。實施例1製備高純度絕經期促性腺素I在本實施例中，將低純度HMG(購自上海天偉生物製藥有限公司)用作pHMG的起 始原料，其中FSH的生物效價為273IU/mg，LH的生物效價為319IU/mg。將5OOmL Blue Sepharose FF (購自 GE Amersham)，裝入層析柱，用平衡液(0. 02M 醋酸鈉，PH7. 0)平衡。將IOg低純度HMG用IL平衡液溶解，用HCl或NaOH溶液調節pH約7. 0，然後上樣 至上述Blue Sepharose FF層析柱上，上樣結束後用平衡液洗滌5倍柱體積，然後用0. 05M Glycin-NaOH pHIO 洗滌 8 倍柱體積，再用 0. 05MTris-HCl, 0. 4M NaCl，pH9 洗滌 8 倍柱體積， 最後用0.05M Tris-HCl,4M NaCl，pH9洗脫，分部收集洗脫液(收集很多份，例如每300mL 為一份)，然後將含有效成分的部分合併，即合併有效成份，用10000MW膜超濾濃縮後，邊攪 拌邊加入5倍體積預冷的無水乙醇，離心收集沉澱，用無水乙醇脫水，真空乾燥得236mg幹
7燥品，即高純度絕經期促性腺素I。生物效價的測定方法按照中國藥典2005版附錄XII M、附錄XII N的方法測定 FSH、LH生物效價。其結果見表1 表1所得乾燥品的生物效價和純度 結果表明，採用本發明的方法進行純化，可以使HMG的純度大大提高。實施例2製備高純度絕經期促性腺素II將500mL Blue Sepharose 6B (購自 GE Amersham)，裝入層析柱，用平衡液(0. 02M 醋酸鈉，PH7. 0)平衡。將6g同實施例1中相同來源的低純度HMG用600mL平衡液溶解，用HCl或NaOH溶 液調節PH約7.0，然後上樣至上述Blue Sepharose 6B層析柱上，上樣結束後用平衡液洗滌 5倍柱體積，然後用0. 05M Glycin-NaOH pHIO洗滌5倍柱體積，再用0. 05M Tris-HCl，0. 2M NaCl，pH9洗滌5倍柱體積，再用0. 05MTris_HCl，0. 5M NaCl，pH9洗滌7倍柱體積，最後用 0.05M Tris-HCl, 4M NaCl，pH9洗脫，分段收集洗脫液，合併有效成份，用10000MW膜超濾濃 縮至IOOmL,即得高純度絕經期促性腺素II。對此液體取樣測定FSH、LH生物效價及蛋白含 量，計算比活。生物效價的測定方法按照中國藥典2005版附錄XII M、附錄XII N的方法測定 FSH、LH生物效價。蛋白質含量測定方法按Lowry法進行測定。FSH比活的計算方法比活=FSH生物效價(IU/mL) +每毫升液體中的蛋白含量 (mg/mL)其結果見表2:表2所得乾燥品的生物效價和純度
8 結果表明，採用本發明的方法進行純化，可以使HMG的純度大大提高。實施例3pHMG凍幹針劑的製備用於製造100瓶pHMG凍幹針劑，且每瓶含75IU FSH和75IU LH的例子如下將實施例1所製備的高純度絕經期促性腺素I 1. 64mg，溶解於5mL注射用無熱原 水中，用0. 22 μ m過濾器進行無菌過濾，並用注射用無熱原水洗滌過濾器。將Ig乳糖溶解於30mL注射用無熱原水中，如果需要的話，用HCl或NaOH調節 PH6. 5士0. 2，用0. 22 μ m過濾器進行無菌過濾。然後加入到上述FSH溶液中，用注射用無熱 原水定容至75mL，混勻。將上述溶液分裝入安瓿瓶中，每瓶0. 75mL，進行冷凍乾燥。所得到的安瓿瓶中，每瓶含約75IU FSH、75IU LH和IOmg乳糖。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並非用以限定本發明的實質技術內容範 圍，本發明的實質技術內容是廣義地定義於申請的權利要求範圍中，任何他人完成的技術 實體或方法，若是與申請的權利要求範圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將 被視為涵蓋於該權利要求範圍之中。
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權利要求
一種高純度絕經期促性腺素(purified Human Menopausal Gonadotropins，pHMG)，其特徵在於，其HPLC純度不低於95％，其雜質HPLC含量不超過5％；優選HPLC純度不低於96％，雜質HPLC含量不超過4％。
2.如權利要求1所述的高純度絕經期促性腺素，其特徵在於，所述的絕經期促性腺素 來自重組的絕經期促性腺素或其變體、或人尿來源的絕經期促性腺素或其變體。
3.如權利要求1所述的高純度絕經期促性腺素，其特徵在於，所述的高純度的絕經期 促性腺素中，卵泡刺激素(FSH)與黃體生成素(LH)的生物效價比例為1 0. 1-3。
4.如權利要求1所述的高純度絕經期促性腺素，其特徵在於，所述的高純度絕經期促 性腺素中，卵泡刺激素(FSH)與黃體生成素(LH)的生物效價比例為1 0.5-1.4。
5.一種如權利要求1-4任一所述的高純度絕經期促性腺素(pHMG)的製備方法，其特徵 在於，所述的方法包括步驟將低純度HMG通過染料親和層析純化，得到高純度絕經期促性 腺素；所述的低純度HMG比活在2000FSH國際單位/mg蛋白以下。
6.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，所述的方法包括步驟(1)將含有低純度HMG的溶液上樣至染料親和層析的層析柱上；(2)用pH6-ll的緩衝液進行洗滌；和(3)用pH6-ll的緩衝液進行洗脫，得到高純度絕經期促性腺素。
7.如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述含有低純度HMG的溶液中低純度 HMG 的濃度為 0. l-10w/v%。
8.如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述含有低純度HMG的溶液的pH為4-8。
9.如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述的緩衝液選自醋酸鈉溶液、醋酸銨 溶液、甘氨酸-NaOH溶液、Tris-HCl溶液或磷酸鹽溶液。
10.如權利要求5-9任一所述的製備方法，其特徵在於，所述染料親和層析的填料的染 料配基選自 Cibacron Blue、Orange、Red、Green。
11.如權利要求5-9任一所述的製備方法，其特徵在於，所述染料親和層析的填料的固 相載體選自皂土、玻璃微球、石英微球、羥磷酸鈣、氧化鋁、聚丙烯醯胺凝膠、澱粉凝膠、葡聚 糖凝膠、纖維素、或瓊脂糖。
12.如權利要求5-9任一所述的製備方法，其特徵在於，所述染料親和層析的填料選自 Blue Sepharose FF 或 Blue Sepharose 6B。
13.一種藥物組合物，其特徵在於，所述的組合物中含有治療有效量的如權利要求1-4 任一所述的高純度絕經期促性腺素，和藥學上可接受的載體。
14.一種如權利要求1-4任一所述的高純度絕經期促性腺素的用途，其特徵在於，用於 製備治療不育綜合症的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種高純度絕經期促性腺素及其製備方法和用途。所述的高純度絕經期促性腺素的HPLC純度不低於95％，其雜質HPLC含量不超過5％。
文檔編號C07K1/22GK101928342SQ20091005327
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月18日 優先權日2009年6月18日
發明者嚴惠敏, 季斌, 季曉銘, 洪雲海, 郭照曄, 高霄梁 申請人:上海天偉生物製藥有限公司