蛋白質在大腸桿菌中的表達的製作方法

2023-09-13 20:42:05 8

專利名稱：：蛋白質在大腸桿菌中的表達的製作方法蛋白質在大腸桿菌中的表達
背景技術：
：重組蛋白質表達系統便於蛋白質、多肽和肽的生產，所述蛋白質、多肽和肽被用作生物藥物或作為多種應用的藥物篩選中的靶。細菌表達系統已經成為優選的備選方法，主要是由於在細菌中有效的和經濟的生產，而酵母和杆狀病毒提供了可靠的可選擇的表達系統。儘管重組表達系統用於異源蛋白質生產用途廣泛，不能依靠現有的方法來以足夠的數量生產任何給定的蛋白質並具有足夠的同質性以滿足下遊需求。許多哺乳動物蛋白質在細菌中以低產量表達並具有相當差的溶解度。同時，它們對於細菌細胞是有毒的，特別是如果它們是部分可溶的。許多載體系統被設計來表達目標重組蛋白質，所述目標重組蛋白質作為與短的或更長的N-末端肽標籤的融合蛋白。這些標籤的實例有組氨酸標籤或麥芽糖結合標籤，其對於隨後重組蛋白質的純化是特別有用的。然而仍然存在著對有效的表達系統的需求，特別是對於治療性蛋白質，這些蛋白質是潛在毒性的並且難以表達。由於蛋白質產量很大程度依賴於轉錄和翻譯起始，這樣的系統應當具有N-末端標籤，其賦予高產量並賦予具有低溶解性的融合蛋白，因為包涵體一般被宿主好得多地耐受。並且，對於天然蛋白質的生產，導入的標籤應當是容易切割的。發明概述本發明提供了自我複製的DNA質粒，用於在微生物宿主細胞中N-末端標籤化的蛋白質的重組表達，包含DNA標籤，所述DNA標籤具有編碼式[I]的肽標籤的核普酸序列MX!(X2X3)n其中代表K或R;X2代表M、S或T;X3代表K或R;n代表1或更大的整數；以及其中所述DNA可操作性地連接到啟動子序列。根據本發明的質粒可以進一步包含核酸序列，所述核酸序列編碼按照閱讀框與所述DNA標籤融合的蛋白質，用於由融合到所述DNA標籤的所述核酸所編碼的N-末端標籤化的蛋白質的重組表達。本發明提供了包含本發明的DNA質粒的微生物宿主細胞。在一個實施方式中，本發明提供了標籤化的蛋白質，其包含與蛋白質融合的N-末端肽標籤，其中所述標籤具有根據式I的序列。在一個實施方式中，本發明提供了在微生物宿主細胞中重組表達N-末端標籤化的蛋白質的方法，包括構建重組質粒的步驟，包括將編碼蛋白質的DNA序列按閱讀框插入根據本發明的質粒的DNA標籤的3，，以及將所述重組質粒導入宿主孩i生物細胞，並誘導所述N-末端標籤化的蛋白質在微生物宿主細胞中表達。附圖的說明附圖1:標籤去除以產生成熟的hIL-21的效力和完成通過質譜法確定，如附圖1,A和B所示。A欄顯示了在標籤去除之前的級分的Maldi譜。B欄顯示了在標籤去除之後的相同級分。附圖2:2A:在MKMK-IL21的DAP/Q-環化酶處理之前的Maldi質譜。具有15948Da的值的單電荷的分子離子，與完整的MKMK-IL21相應。2B:在MKMK-IL21的DAP/Q-環化酶處理之後的Maldi質譜。具有15423Da的值的單電荷的分子離子，與具有N-末端焦穀氨酸殘基的IL21相應。沒有觀察到相應於完整MKMK-IL21的信號。附圖3:3A:在MKSK-IL21的DAP/Q-環化酶處理之前的Maldi質譜。具有15911.6Da的值的單電荷的分子離子，與完整的MKSK-IL21相應。3B:在MKSK-IL21的DAP/Q-環化酶處理之後的Maldi質譜。具有15429Da的值的單電荷的分子離子，與具有N-末端焦穀氨酸殘基的IL21相應。沒有觀察到相應於完整MKSK-IL21的信號。附圖4:4A:在MKTK-IL21的DAP/Q-環化酶處理之前的Maldi質譜。具有15933.6Da的值的單電荷的分子離子，與完整的MKTK-IL21相應。4B:在MKTK-IL21的DAP/Q-環化酶處理之後的Maldi質譜。具有15430.9Da的值的單電荷的分子離子，與具有N-末端焦穀氨酸殘基的IL21相應。沒有觀察到相應於完整MKTK-IL21的信號。縮寫胺基酸丙氨酸(A);精氨酸(R);天冬醯胺(N);天冬氨酸(D);半胱氨酸(C);甘氨酸(G);穀氨醯胺(Q);穀氨酸(E);組氨酸(H);異亮氨酸(I);亮氨酸(L);賴氨酸(K);曱硫氨酸(M);苯丙氨酸(F);脯氨酸(P);絲氨酸(S);蘇氨酸(T);色氨酸(W),酪氨酸(Y);纈氨酸(V).C-末端包含一個或更多個胺基酸殘基的、蛋白質的羧基(C)-末端部分。hlL-21:人類白細胞介素-21N-末端包含一個或更多個胺基酸殘基的、蛋白質的氨基(N)-末端部分。SDSPAGE:十二烷基(月桂基)硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠發明描述本發明提供了適合於異源蛋白質的重組表達的DNA標籤、表達載體或質粒，以及用於重組蛋白質表達的方法，其與隨後的重組蛋白質的純化、重組蛋白質的最後加工以按它的天然和活性形式回收蛋白質是相容的。根據本發明表達的具有N-末端標籤的蛋白質具有低溶解度，並將優選地表達到包涵體內，其一般^皮宿主好得多地耐受。在一個實施方式中，本發明提供了自我複製的DNA質粒，用於在微生物宿主細胞中N-末端標籤化的蛋白質的重組表達，所述質粒包含DNA標籤，所述DNA標籤具有編碼式[I]的肽標籤的核苷酸序列MX!(X2X3)n[I]其中代表K或R;X2代表M、S或T;X3代表K或R;n代表1或更大的整數；術語"蛋白質"、"多肽"和"肽"在此可互換地使用，應當認為是指由通過肽鍵連接的至少五個組成胺基酸組成的化合物。組成胺基酸可以來自由遺傳密碼編碼的胺基酸的組，它們可以是不由遺傳密碼編碼的天然胺基酸，以及合成胺基酸。不由遺傳密碼編碼的天然胺基酸有例如羥脯氨酸、y-羧基穀氨酸、鳥氨酸、磷酸絲氨酸、D-丙氨酸和D-穀氨醯胺。合成的胺基酸包括通過化學合成製造的胺基酸，即，由遺傳密碼編碼的胺基酸的D-同分異構體，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(a-氨基異丁酸)、Abu(a-氨基丁酸)、Tie(叔-丁基甘氨酸)、卩-丙氨酸、3-氨基曱基苯曱酸和鄰氨基苯曱酸。如在此^f吏用的，術語"DNA標籤，^皮定義為編碼N-末端蛋白質標籤的DNA分子，其^皮添加到編碼異源蛋白質的DNA序列上，它在孩吏生物中按閱讀框表達產生標籤化的蛋白質或融合蛋白質。本發明的DNA標籤編碼具有至少四個胺基酸並包含如式I定義的胺基酸序列的胺基酸序列。在一個實施方式中，Xi代表K。在一個實施方式中，Xi代表R。在一個實施方式中，X2代表M或S。在一個實施方式中，乂2代表M或T。在一個實施方式中，X2代表S或T。在一個實施方式中，X2代表M。在一個實施方式中，X2代表S。在一個實施方式中，X2代表T。在一個實施方式中，X3代表K。在一個實施方式中，X3代表R。在一個實施方式中，n是l到10的整數。在一個實施方式中，n是1到9的整數。在一個實施方式中，n是l到8的整數。在一個實施方式中，n是l到7的整數。在一個實施方式中，n是l到6的整數。在一個實施方式中，n是1到5的整數。在一個實施方式中，n是1到4的整數。在一個實施方式中，n是l到3的整數。在一個實施方式中，n是l到2的整數。在一個實施方式中，n是l。在一個實施方式中，n是2。在一個實施方式中，n是3。如在實施例中說明的，與編碼融合到N-末端曱硫氨酸的蛋白質的對照序列相比，包含按閱讀框融合到蛋白質的編碼序列的、本發明的DNA標籤的DNA序列的表達，促成了顯著更高水平的蛋白質表達。雖然不希望受理論的限制，相信的是，如果表達的蛋白質以對宿主細胞新陳代謝或生長無毒的形式積累，例如在包涵體中，宿主微生物細胞特別是大腸桿菌(五.co")細胞中重組蛋白質表達被增強。因而，融合到重組蛋白質的選定的N-末端蛋白質標籤可以通過促進它們在包涵體中的積累來增強它們的表達。許多感興趣的哺乳動物蛋白質在它們的天然宿主中被分泌，並伴有信號肽地被合成，信號肽在分泌期間被切除。因而分泌的成熟蛋白質的N-末端在大多數情況下以不同於曱硫氨酸的胺基酸開始，曱硫氨酸是大腸桿菌中所有從頭合成的蛋白質，包括異源的、細胞內積累的蛋白質的天然的N-末端。為了避免關於N-末端曱硫氨酸的切割的不確定性，添加如所描述的、具有已知的體外切割性質的小的肽標籤，在獲得感興趣的成熟蛋白質方面是高度有益的。本發明4是供的DNA標籤可以添加到編碼蛋白質的DNA序列上，為了它在宿主微生物細胞特別是細菌細胞中的重組表達。DNA標籤在很大數量的有用蛋白質在宿主微生物細胞中的重組表達方面具有應用，特別是對於治療性蛋白質，例如人生長激素、IL-20、IL-21和GLP-1的表達。編碼N-末端肽標籤的DNA標籤按閱讀框與編碼要表的蛋白質的DNA序列融合，從而在宿主細胞中可獲得的表達產物是標籤化的或融合蛋白質。如果DNA標籤編碼超過四個胺基酸的N-末端肽標籤，所述肽標籤可以通過添加二肽來延長，它的胺基酸組成適合於通過二氨基肽酶，例如，二肽基氨肽酶I來切割它們。表達的標籤化的或融合蛋白質可以包含直接融合到要表達的成熟蛋白質的第一胺基酸的肽標籤，從而所述肽標籤的切割以及二肽的去除將所表達的蛋白質以它的成熟形式釋放。如果表達的標籤化的或融合蛋白質的肽標籤通過氨肽酶被除去，希望的是確保表達的蛋白質的成熟形式的胺基酸序列以一殘基開始或前面是所述殘基，所述殘基可以作為終止點起作用，超過該終止點氨肽酶不能繼續。這樣，表達的蛋白質的成熟形式被保護免於N-末端蛋白水解切割。可以作為二氨基肽酶的終止點的適合的胺基酸殘基可以選自Q、P、R、K。胺基酸殘基Q可以用作終止點，憑藉它在存在穀氨酸環轉移酶的情況下形成焦穀氨酸的能力。如果成熟蛋白質的N-末端胺基酸本身不是可以作為終止點起作用的殘基，希望的是通過編碼適合的終止殘基的密碼子延伸DNA標籤，其然後融合到編碼期望的成熟蛋白質的DNA序列上。要添加到肽標籤的末端的優選的終止殘基是Q，因為這個殘基可以在肽標籤的二肽基氨肽酶切割之後用焦穀氨醯氨肽酶從表達的蛋白質的N-末端除去。當按閱讀框融合到要重組表達的蛋白質的編碼序列時本發明的DNA標籤提供了標籤化的蛋白質，其肽標籤具有帶電極性側鏈的優勢。在標籤化蛋白質中額外的帶電殘基的存在在隨後的純化步驟中是特別有用的，所述純化步驟在蛋白質質量電荷的基礎上進行區分。根據本發明的DNA標籤可以按閱讀框融合到編碼hlL-21的DNA序列。在本發明的一個實例中，根據本發明的DNA標籤按閱讀框融合到編碼hIL-21、具有SEQIDNO:4的核苦酸序列的DNA分子。可以選擇其他限制性位點，相應地調整序列處於本領域的技術人員的能力範圍之內。在一個方面，本發明提供了包含編碼本發明的肽標籤的DNA標籤的表達載體或表達質粒。所述DNA標籤可以插入載體或質粒的適合的克隆位點的鄰近或其中，從而所述標籤位於啟動子序列的下遊並與之可操作地連接。優選的，所述DNA標籤側翼是限制性酶切割位點，其促進編碼要重組表達的蛋白質的DNA序列的下遊地按閱讀框地插入。本領域技術人員將容易識別適合的優選側翼序列，以促進期望的蛋白質的編碼序列的下遊按閱讀框克隆。與本發明的DNA標籤可操作地連接的，本發明的質粒或載體中的啟動子序列具有能夠指導編碼標籤化蛋白質的DNA分子在選定的宿主微生物細胞中的轉錄的核苷酸序列。適合於在細菌中特別是在大腸桿菌中重組蛋白質表達的啟動子序列是本領域:忮術人員7>知的，4旦包括T7、trc、lac和tac啟動子的任一種。包含了表達盒的優選的載體是自我複製性的，並具有可選擇標記物，例如氨千西林，所述表達盒包含與本發明的DNA標籤可操作地連接的啟動子。在一個實施方式中，本發明的表達載體或表達質粒進一步包含編碼要重組表達的蛋白質的DNA序列，其中所述DNA序列克隆到所述DNA標籤下遊並與所述DNA標籤按閱讀框地克隆。在一個實例中，克隆到表達質粒中的DNA序列是編碼hIL-21的序列，當所述表達質粒被導入適合的宿主細胞中時其能夠表達為標籤化的蛋白質。在本發明的表達載體或表達質粒中編碼hIL-21的DNA序列可以包含SEQIDNO:4的核苷酸序列。適合於標籤化蛋白質的表達的、要用本發明的表達質粒載體轉化的宿主細胞是本領域技術人員公知的。優選的細菌宿主菌林是大腸桿菌B的衍生菌林，例如，蛋白酶缺陷的菌林大腸桿菌BL21(DE3),其在染色體上帶有T7聚合酶基因。本發明提供了標籤化的蛋白質，其包含與蛋白質融合的N-末端肽標籤，其中所述標籤包含式[I]的胺基酸序列MX!(X2X3)n[I]其中代表K或R;X2代表M、S或T;X3代表K或R;以及n代表1或更大的整數。在一個實施方式中，X!代表K。在一個實施方式中，Xi代表R。在一個實施方式中，X2代表M或S。在一個實施方式中，X2代表M或T。在一個實施方式中，X2代表S或T。在一個實施方式中，X2代表M。在一個實施方式中，X2代表S。在一個實施方式中，X2代表T。在一個實施方式中，X3代表K。在一個實施方式中，X3代表R。在一個實施方式中，n是l到10的整數。在一個實施方式中，n是1到9的整數。在一個實施方式中，n是l到8的整數。在一個實施方式中，n是l到7的整數。在一個實施方式中，n是l到6的整數。在一個實施方式中，n是1到5的整數。在一個實施方式中，n是1到4的整數。在一個實施方式中，n是l到3的整數。在一個實施方式中，n是l到2的整數。在一個實施方式中，n是l。在一個實施方式中，n是2。在一個實施方式中，n是3。在一個實施方式中，所述蛋白質包含SEQIDNO:2的胺基酸序列。在一個實施方式中，所述肽標籤不是MKMK、MKTK或MKSK。根據本發明的標籤化蛋白質可以通過本發明的表達質粒或表達載體的重組表達來獲得。標籤化蛋白質可以經歷在此描述的純化步驟，和/或一個或更多個蛋白水解加工步驟，用於從標籤化蛋白質上除去肽標籤以提供具有一種或更多種應用的成熟蛋白質。本發明進一步提供了用於在宿主微生物細胞中標籤化蛋白質的重組表達的方法，所述標籤化蛋白質由按閱讀框融合到編碼序列的本發明的DNA標籤所編碼，從而所述融合的DNA序列編碼所述標籤化蛋白質，以改善表達的目標蛋白質的產率。因此，所述方法包括構建編碼融合蛋白的表達質粒或表達載體的步驟，所述融合蛋白包含融合到蛋白質的N-末端肽，從而所述編碼序列由終止密碼子來終止。標籤化蛋白質的表達由與標籤化蛋白質的編碼序列可操作地連接的啟動子來指導，由此所述啟動子是所述宿主細胞的表達系統所識別的啟動子。根據本發明的一個實施方式，用於hlL-21的表達的表達載體的構建在實施例1中描述。本發明的表達載體或表達質粒被轉染到宿主微生物細胞、優選的細菌大腸桿菌中，被載體轉化的宿主細胞在與宿主細胞的增殖和標籤化蛋白質的表達相容的條件下鑑定、分離和培養。本發明的標籤化蛋白質在宿主微生物細胞中的表達優選的是可誘導的。例如，當宿主細胞是大腸桿菌菌抹時，表達被lac操縱子調節，表達可以通過添加解除lac啟動子抑制的約0.5-lmM的異丙基p-D-硫代吡喃半乳糖苦(IPTG)來誘導。在通過IPTG適合的誘導之後，例如3-4小時，宿主細胞可以被裂解，例如通過超聲處理或凍融操作，通過離心將細胞溶胞產物分離成可溶的和不溶的級分。標籤化蛋白質，取決於它的溶解度，可以位於可溶級分中，或更優選的位於與細胞團粒一起分級分離的包涵體中。當標籤化蛋白質位於包涵體中時，在它的進一步純化之前，溶解和重摺疊步驟可能是需要的，採用根據本領域公知的方案為標籤化蛋白質優化的條件。可以採用各種各樣的蛋白質分離和純化方案來實現需要的純化程度。測定本發明的純化的標籤化蛋白質和隨後衍生的成熟蛋白質的純度的方法是本領域公知的，在實施例2中進行了例示。從本發明的標籤化蛋白質上除去肽標籤可以採用二肽基氨肽酶，如果終止殘基是Q,其可以與穀氨醯胺環轉移酶組合。標籤的除去可以在本發明的重組表達的蛋白質的純化之前或之後進行。以下是本發明的實施方式的列表，其不應被看作是限制性的。實施方式1:自我複製的DNA質粒，用於在微生物宿主細胞中N-末端標籤化的蛋白質的重組表達，所述質粒包含DNA標籤，所述DNA標籤具有編碼式[I]的肽標籤的核苦酸序列MXt(X2X3)n[I]其中代表K或R;X2代表M、S或T;X3代表K或R;n代表1或更大的整數；以及其中所述DNA標籤可操作地連接到啟動子序列。實施方式2:根據實施方式1的DNA質粒，其中X!代表K。實施方式3:根據實施方式1的DNA質粒，其中Xi代表R。實施方式4:根據實施方式1到3的任一項的DNA質粒，其中X2代表M或S。實施方式5:根據實施方式1到3的任一項的DNA質粒，其中X2代表M或T。實施方式6:才艮據實施方式1到3的任一項的DNA質粒，其中X2代表S或T。實施方式7:根據實施方式1到3的任一項的DNA質粒，其中乂2代表M。實施方式8:才艮據實施方式1到3的任一項的DNA質粒，其中X2代表S。實施方式9:根據實施方式1到3的任一項的DNA質粒，其中X2代表T。實施方式10:才艮據實施方式1到9的任一項的DNA質粒，其中X3代表K。實施方式ll:4艮據實施方式1到9的任一項的DNA質粒，其中X3代表R。實施方式12:根據實施方式1到11的任一項的DNA質粒，其中n是1。實施方式13:根據實施方式1到11的任一項的DNA質粒，其中n是2。實施方式14:根據實施方式1到11的任一項的DNA質粒，其中n是3。實施方式15:根據實施方式1到14的任一項的質粒，進一步包含核酸序列，所述核酸序列編碼按閱讀框與所述DNA標籤融合的蛋白質，用於由融合到所述DNA標籤的所述核酸序列編碼的N-末端標籤化的蛋白質的重組表達。實施方式16:根據實施方式15的質粒，其中與沒有所述肽標籤的蛋白質的表達相比，通過使用所述質粒的蛋白質的表達被提高。實施方式17:根據實施方式15或16的質粒，其中與沒有所述肽標籤的表達的蛋白質的溶解度相比，通過使用所述質粒表達的蛋白質的溶解度被降低。實施方式18:根據實施方式15到17的任一項的質粒，其中所述蛋白質包含SEQIDNO:2的胺基酸序列。實施方式19:根據實施方式15到18的任一項的質粒，其中所述編碼蛋白質的核酸序列由SEQIDNO:1的核苷酸序列組成。實施方式20:根據實施方式1到19的任一項的DNA質粒，條件是所述由DNA標籤編碼的肽標籤不是MKMK、MKTK或MKSK。實施方式21:包含根據實施方式1到20的任一項的質粒的微生物宿主細胞。實施方式22:根據實施方式21的微生物宿主細胞，其中所述細胞是大腸桿菌。實施方式23:標籤化的蛋白質，其包含與蛋白質融合的N-末端肽標籤，其中所述標籤包含式[I]的胺基酸序列MX!(X2X3)n[I]其中代表K或R;X2代表M、S或T;X3代表K或R;以及n代表1或更大的整數。R。實施方式24:根據實施方式23的標籤化的蛋白質，其中Xi代表實施方式25:根據實施方式23的標籤化的蛋白質，其中X!代表實施方式26:根據實施方式23至其中X2代表M或S。實施方式27:才艮據實施方式23至其中X2代表M或T。實施方式28:才艮據實施方式23至其中X2代表S或T。實施方式29:根據實施方式23至'其中X2代表M。實施方式30:其中X2代表S。實施方式31:其中X2代表T。實施方式32:其中Xs代表K。實施方式33:其中X3代表R。實施方式34:其中n是1。實施方式35:其中n是2。實施方式36:其中n是3。實施方式37:根據實施方式23至#4居實施方式23至#4居實施方式23至#4居實施方式23至才艮據實施方式23至根據實施方式23至#4居實施方式23至25的任一項的標籤化的蛋白質，25的任一項的標籤化的蛋白質，25的任一項的標籤化的蛋白質，25的任一項的標籤化的蛋白質，25的任一項的標籤化的蛋白質，25的任一項的標籤化的蛋白質，31的任一項的標籤化的蛋白質，31的任一項的標籤化的蛋白質，33的任一項的標籤化的蛋白質，33的任一項的標籤化的蛋白質，33的任一項的標籤化的蛋白質，36的任一項的標籤化的蛋白質，的胺基酸序列。37的任一項的標籤化的蛋白質，才艮據實施方式23到其中所述蛋白質包含SEQIDNO:2實施方式38:才艮椐實施方式23到條件是所述肽標籤不是MKMK、MKTK或MKSK。實施方式39:在微生物宿主細胞中重組表達N-末端標籤化的蛋白質的方法，包括步驟(a)構建重組質粒，包括將編碼蛋白質的DNA序列按閱讀框插入到^4居實施方式1到14的任一項的質粒的DNA標籤的3'，和(b)將所述重組質粒導入宿主微生物細胞中，和(c)誘導所述N-末端標籤化的蛋白質在微生物宿主細胞中的表達。實施方式40:提高蛋白質在微生物宿主細胞中的重組表達的方法，所述方法包括「(a)構建重組質粒，包括將編碼蛋白質的DNA序列按閱讀框插入到根據實施方式1到14的任一項的質粒的DNA標籤的3',和(b)將所述重組質粒導入宿主微生物細胞中，和(c)誘導所述N-末端標籤化的蛋白質在微生物宿主細胞中的表達。實施方式41:降低微生物宿主細胞中重組表達的蛋白質的溶解度的方法，所述方法包括-(a)構建重組質粒，包括將編碼蛋白質的DNA序列^I安閱讀框插入到才艮據實施方式1到14的任一項的質粒的DNA標籤的3',和(b)將所述重組質粒導入宿主微生物細胞中，和(c)誘導所述N-末端標籤化的蛋白質在微生物宿主細胞中的表達。實施方式42:根據實施方式39到41的任一項的方法，其中所述蛋白質包含SEQIDNO:2的胺基酸序列。實施方式43:根據實施方式39到42的任一項的方法，其中編碼蛋白質的DNA序列由SEQIDNO:1的核苷酸序列組成。實施方式44:根據實施方式39到43的任一項的方法，條件是所述由質粒的DNA標籤編碼的肽標籤不是MKMK、MKTK或MKSK。所有在此引用的參考文獻，包括公開物、專利申請和專利，通過完全引用合併在此，並且達到如同每個參考文獻被單獨地和特意地指明通過引用來合併、以及在此完全闡述的程度(法律所允許的最大程度)，不管在本文其他地方作出的、特定文件的任何單獨提供的合併。在描述本發明的上下文中術語"一"以及"該"和類似對象的使用被認為是覆蓋了單數和複數，除非在此另有陳述或上下文明顯牴觸。例如，用語"該化合物"被理解為是指本發明或特別描述的方面的各種"化合物"，除非另有陳述。除非另有陳述，在此提供的所有確切數值是相應的近似值的表示(例如，對於特定因素或度量來說提供的所有的確切示範性數值被認為還提供了相應的大略的度量，在合適時由"約"來修飾)。對於一個元素或複數個元素使用術語如"包含"、"具有"、"包括"或"含有"的本發明任一方面或方面的在此的描述，是意圖提供對"由......組成"、"基本上由......組成"或"基本上包含"所述特定元素或複數個元素的本發明的類似方面的支持，除非另有說明或上下文明顯地牴觸(例如，在此描述的組合物包含特定元素應當被理解為還描述了組合物由該元素組成，除非另有說明或上下文明顯地牴觸)。總之，本發明提供了包含編碼肽標籤的DNA標籤的表達載體或表達質粒，所述DNA標籤與啟動子可操作地連接，所述啟動子能夠指導所述DNA標籤以及與所述DNA標籤按閱讀框融合的任何蛋白質編碼序列在宿主微生物細胞中的表達。採用本發明的表達載體或表達質粒用於按閱讀框融合到所述DNA標籤的蛋白質編碼序列的重組蛋白質表達的特別的優點是，在宿主細胞中的表達水平被顯著地增強了。因而，當具有融合在N-末端的本發明的肽標籤的蛋白質在微生物宿主細胞例如大腸桿菌中重組表達時，這種標籤的存在大多數情況下增強表達，這是由於所述蛋白質的降低的溶解度和對宿主細胞的降低的毒性，並且它進一步滿足了有效的重組蛋白質表達所需的許多其他重要的指標。特別是，它容許在標籤的適當的切割之後蛋白質以它的成熟形式獲得。此外，帶電的標籤所帶來的總蛋白質電荷的改變幫助了蛋白質的純化。實施例實施例1標籤化的人類白細胞介素-21的表達對於表達和下遊加工，為了比較各種小的N-末端標籤，選擇人類白細胞介素hIL-21作為目標蛋白質。編碼蛋白質hIL-21的核酸分子是SEQIDNO:1(MethIL-21AWel-5amHl核普酸序列)，其中分子的5'末端和3'末端分別具有AWel-5amHl的限制性酶位點。MethIL-21M/el-5flmHl核苷酸序列編碼SEQIDNO:2所示的hlL-21蛋白質序列。當在大腸桿菌中表達時，這個蛋白質在N-末端具有額外的甲硫氨酸。hlL21的這個形式被稱為Met-hlL21。一系列構建體根據以下方案來製成410石威基對DNA分子，編碼hlL-21的成熟形式，相應於Met-hlL-21的胺基酸殘基1-133,具有5'和3'末端的《S(y/^amHl位點，在SEQIDNO:3中示出(hIL-21砂1-5證H1核普酸序列)。hlL畫21,-S應Hl核普酸序列，從核普酸2開始，包含SEQIDNO:4所示的核普酸序列，其編碼具有SEQIDNO:2的胺基酸序列的成熟的hIL-21蛋白質序列。hIL-21S(yl-5flwHl分子連接到A^el-5amHl消化的T7表達載體，5.6kb的pET-llc，與一系列連4矣物的任一種一起，每一個側翼是5'M/el位點和3'6V少1相容位點，在表1中列出。表1tableseeoriginaldocumentpage18包含含有DNA標籤的連接物、所述DNA標籤按閱讀框連接到DNA分子hIL-21S^l-萬"mHl的T7表達載體pET-llc轉化到宿主細胞大腸桿菌BBL21(DE3)中。用每種T7表達載體轉化的宿主細胞菌抹在37。C補充有氨節西林0.2mg/l的LB培養基中生長，來自T7表達載體的重組蛋白質表達用0.5mMIPTG誘導3-4小時。宿主細胞通過離心來收穫，裂解，然後離心樣品來提供可溶級分和團粒化的包涵體級分。來自每個宿主細胞樣品的總細胞提取物、包涵體和可溶細胞級分然後通過SDSPAGE分離，凝膠用Comassie藍染色來測定標籤化hlL-21蛋白質表達的水平，與未標籤化的蛋白質MethIL-21比較。hIL-21的各種標籤化形式的表達水平取決於標籤的胺基酸序列，如表l所示，但是在某些情況下它還取決於核苦酸序列，即，mRNA中的二級結構。對密碼子進行調整以避免可能遭遇的二級結構難題是本領域的技術人員能力之內的。表l說明了兩點表達水平一般通過添加特定的肽標籤來提高，hIL-21的溶解度被降低，從而保護了大腸桿菌宿主細胞免於hIL-21的毒性影響。並且，溶解度降低幫助了hIL-21分配到包涵體中，從而便於它隨後的純化。實施例2重組表達的標籤化人類白細胞介素-21被加工成它的成熟和活性形式。利用構建體DAP17表達的MKHK-hIL-21如WO04/55168中公開的從包涵體中重摺疊，隨後採用SepharoseSP柱層析純化到大約90-95%純度。相應於MKHK-hIL-21的單個主要多肽條帶通過從SepharoseSP柱獲得的級分的SDS-PAGE分析檢測到，級分的庫，如泳道4-10中所示，隨後進行二肽基氨肽酶(DAPase)和穀氨醯胺環轉移酶(Q環化酶)處理以進行四個胺基酸的N-末端肽標籤的受控的去除。肽標籤切割的條件是27.5pMMKHK-IL21、67.5mUDAPase、5.5UQ環化酶、25mMTris、0.15MNaCl、pH7.0的水溶液，在環境溫度(20-25°C)孵育90分鐘，採用Qiagen.com提供的酶。標籤去除以產生成熟的hIL-21的效力和完成通過質譜法確定，如附圖1，A和B所示。A欄顯示了在標籤去除之前的級分的Maldi光譜。B欄顯示了在標籤去除之後的相同級分。天然hlL21具有15433Da的分子量，而MKHK-IL21具有15975Da的分子量。如在B欄中觀察到的，切割和標籤去除是大約90%完成的。實施例3重組表達的MKMK標籤化的人類白細胞介素-21被加工成它的成熟和活性形式。利用構建體DAP21表達的MKMK-hIL-21如WO200455168中公開的從包涵體中重摺疊，隨後採用TosoHaassp550c柱層析純化到大約90-95%純度。相應於MKMK-hIL-21的單個主要多肽條帶通過從TosoHaassp550c柱獲得的級分的SDS-PAGE分析一企測到，級分的庫隨後進行二肽基氨肽酶(DAPase)和穀氨醯胺環轉移酶(Q環化酶)處理以進行四個胺基酸的N-末端肽標籤的受控的去除。肽標籤切割的條件是2mg/mlMKMK-IL21、在25mMTris、0.15MNaCl、pH7.0中800:1:32摩爾比的MKMK-IL21:DAPase:Q環化酶的水溶液，在環境溫度(20-25°C)孵育30分鐘，採用Qiagen.com提供的酶。標籤去除以產生成熟的hIL-21的效力和完成通過質譜法確定，如附圖2，A和B所示。A欄顯示了在標籤去除之前的級分的Maldi光譜。B欄顯示了在標籤去除之後的相同級分。具有N-末端焦穀氨酸的天然WL21具有15442Da的分子量，而MKMK-IL21具有15978Da的分子量。如在B欄中》見察到的，切割和標籤去除是完全的。實施例4重組表達的MKSK標籤化的人類白細胞介素-21被加工成它的成熟和活性形式。利用構建體DAP23表達的MKSK-hIL-21如WO200455168中公開的從包涵體中重摺疊，隨後採用TosoHaassp550c柱層析純化到大約90-95%純度。相應於MKSK-hIL-21的單個主要多肽條帶通過從TosoHaassp550c柱獲得的級分的SDS-PAGE分析4全測到，級分的庫隨後進行二肽基氨肽酶(DAPase)和穀氨醯胺環轉移酶(Q環化酶)處理以進行四個胺基酸的N-末端肽標籤的受控的去除。肽標籤切割的條件是2mg/mlMKSK-IL21、在25mMTris、0.15MNaCl、pH7.0中800:1:32摩爾比的MKSK-IL21:DAPase:Q環化酶的水溶液，在環境溫度(20-25°C)孵育30分鐘，採用Qiagen.com提供的酶。標籤去除以產生成熟的hIL-21的效力和完成通過質譜法確定，如附圖3,A和B所示。A欄顯示了在標籤去除之前的級分的Maldi光譜。B欄顯示了在標籤去除之後的相同級分。具有N-末端焦穀氨酸的天然hIL21具有15442Da的分子量，而MKSK-IL21具有15934Da的分子量。如在B欄中》見察到的，切割和標籤去除是完全的。實施例5重組表達的MKTK標籤化的人類白細胞介素-21被加工成它的成熟和活性形式。利用構建體DAP24表達的MKTK-hIL-21如WO04/55168中公開的從包涵體中重摺疊，隨後採用TosoHaassp550c柱層析純化到大約90-95%純度。相應於MKTK-hIL-21的單個主要多肽條帶通過從TosoHaassp550c柱獲得的級分的SDS-PAGE分析#企測到，級分的庫隨後進行二肽基氨肽酶(DAPase)和穀氨醯胺環轉移酶(Q環化酶)處理以進行四個胺基酸的N-末端肽標籤的受控的去除。肽標籤切割的條件是2mg/mlMKTK-IL21、在25mMTris、0.15MNaCl、pH7.0中800:1:32摩爾比的MKTK-IL21:DAPase:Q環化酶的水溶液，在環境溫度(20-25°C)孵育30分鐘，採用Qiagen.com提供的酶。標籤去除以產生成熟的WL-21的效力和完成通過質譜法確定，如附圖4,A和B所示。A欄顯示了在標籤去除之前的級分的Maldi光譜。B欄顯示了在標籤去除之後的相同級分。具有N-末端焦穀氨酸的天然hlL21具有15442Da的分子量，而MKTK-IL21具有15948Da的分子量。如在B欄中，見察到的，切割和標籤去除是完全的。藥理學方法分析(I)BAF-3分析來測定IL-21活性BAF-3細胞(來自骨髓的鼠前B淋巴樣細胞系)的生長和存活原始是IL-3依賴性的。IL-3活化JAK-2和STAT,其是在刺激時IL-21活化的相同的介體。在人類IL-21受體的轉染之後，細胞系被轉變成IL-21依賴性細胞系。這個克隆可以用於評估IL-21樣品對BAF-3細胞的存活的影響。BAF-3細胞在飢餓培養基(沒有IL-21的培養基)中在37°C、5%C02中生長24小時。洗滌細胞並重懸浮在飢餓培養基中，並接種到平板上。10pl的IL-21化合物、不同濃度的人IL-21作為對照添加給細胞，平並反在37。C、5%002孵育68小時。AlamarBlue⑧添加到每個反應孔，然後孵育細胞另外4小時。AlamarBlue⑧是氧化還原指示劑，被細胞代謝的天然反應還原，因而提供了活細胞數量的間接的度量。最後，細胞的代謝活性在焚光平板讀取器中測量。樣品中的吸光度表示為未用生長激素化合物刺激的細胞或對照的％,從濃度-反應曲線可以計算活性(以50%刺激細胞的化合物的數量)。在利用IL-21受體的這種分析中測試的，本發明的構建體的生物學活性顯示了，來自所有構建體的切割的天然IL-21的效力等同於通過WO200455168中描述的方法產生的Met-IL21。權利要求1.自我複製的DNA質粒，用於在微生物宿主細胞中N-末端標籤化的蛋白質的重組表達，所述質粒包含DNA標籤，所述DNA標籤具有編碼式[I]的肽標籤的核苷酸序列MX1(X2X3)n[I]其中X1代表K或R；X2代表M、S或T；X3代表K或R；n代表1或更大的整數；以及其中所述DNA標籤可操作性地連接到啟動子序列。2.根據權利要求1的DNA質粒，其中n是l、2或3。3.根據權利要求1或權利要求2的質粒，進一步包含核酸序列，所述核酸序列編碼4安閱讀框與所述DNA標籤融合的蛋白質，用於由融合到所述DNA標籤的所述核酸序列編碼的N-末端標籤化的蛋白質的重組表達。4.根據權利要求3的質粒，其中所述蛋白質包含SEQIDNO:2的胺基酸序列。5.根據權利要求3或權利要求4的質粒，其中所述編碼蛋白質的核酸序列由SEQIDNO:l的核苷酸序列組成。6.根據權利要求1到5的任一項的DNA質粒，條件是所述由DNA標籤編碼的肽標籤不是MKMK、MKTK或MKSK。7.包含根據權利要求1到6的任一項的質粒的微生物宿主細胞。8.標籤化的蛋白質，其包含與蛋白質融合的N-末端肽標籤，其中所述標籤包含式[I]的胺基酸序列formulaseeoriginaldocumentpage2其中Xj代表K或R;X2代表M、S或T;X3代表K或R;以及n代表1或更大的整數。9.根據權利要求8的標籤化的蛋白質，其中n是l、2或3。10.根據權利要求8或權利要求9的標籤化的蛋白質，其中所述蛋白質包含SEQIDNO:2的胺基酸序列。11.根據權利要求8到10的任一項的標籤化的蛋白質，條件是所述肽標籤不是MKMK、MKTK或MKSK。12.在微生物宿主細胞中重組表達N-末端標籤化的蛋白質的方法，包括步驟(a)構建重組質粒，包括將編碼蛋白質的DNA序列按閱讀框插入到根據權利要求1到2的任一項的質粒的DNA標籤的3'，以及(b)將所述重組質粒導入宿主^L生物細胞中，和(c)誘導所述N-末端標籤化的蛋白質在微生物宿主細胞中的表達。13.提高蛋白質在微生物宿主細胞中的重組表達的方法，所述方法包括(a)構建重組質粒，包括將編碼蛋白質的DNA序列按閱讀框插入到根據權利要求1到2的任一項的質粒的DNA標籤的3'，和(b)將所述重組質粒導入宿主微生物細胞中，和(c)誘導所述N-末端標籤化的蛋白質在微生物宿主細胞中的表達。14.降低微生物宿主細胞中重組表達的蛋白質的溶解度的方法，所述方法包括「(a)構建重組質粒，包括將編碼蛋白質的DNA序列按閱讀框插入到根據權利要求1到2的任一項的質粒的DNA標籤的3'，和(b)將所述重組質粒導入宿主微生物細胞中，和(c)誘導所述N-末端標籤化的蛋白質在微生物宿主細胞中的表達。15.根據權利要求12到14的任一項的方法，其中所述蛋白質包含SEQIDNO:2的胺基酸序列。16.根據權利要求12到15的任一項的方法，其中編碼蛋白質的DNA序列由SEQIDNO:1的核苦酸序列組成。17.根據權利要求12到16的任一項的方法，條件是所述由質粒的DNA標籤編碼的肽標籤不是MKMK、MKTK或MKSK。全文摘要提供了質粒，包含編碼序列MX1(X2X3)n的肽標籤的DNA標籤，X1代表K或R；X2代表M、S或T；X3代表K或R；n代表1或更大的整數；以及其中所述DNA可操作性地連接到啟動子序列。文檔編號C07K1/107GK101622269SQ200880006757公開日2010年1月6日申請日期2008年2月22日優先權日2007年3月1日發明者C·B·希奧特,H·沃爾迪克申請人:諾沃-諾迪斯克有限公司