來源於穀氨酸棒狀桿菌的二氫乳清酸脫氫酶的序列及其在微生物生產嘧啶和/或嘧啶...的製作方法

2023-09-20 09:56:30 1

專利名稱：來源於穀氨酸棒狀桿菌的二氫乳清酸脫氫酶的序列及其在微生物生產嘧啶和/或嘧啶 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及藉助於基因操作的生物通過發酵生產嘧啶的方法。本發明包含來源於穀氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)的二氫乳清酸脫氫酶的序列，及其用於微生物生產嘧啶和/或嘧啶相關化合物的用途。
嘧啶的生物合成途徑對於所有活的生物都是非常重要的(R.L.和Quinn，C.L.所著的關於此內容的評論文章是在枯草桿菌(編者Sonenshein，A.L.，Hoch，J.A.和Losick，R.，American Society forMicrobiology，Washington，D.C.)，1993，第343-358頁中發表的)。嘧啶核苷酸是嘧啶的衍生物，且，本身是DNA和RNA的活化前體，並用於許多生物合成途徑中。在嘧啶核苷的胞苷，尿苷，脫氧胞苷和脫氧胸苷中，嘧啶鹼基與戊糖結合，且嘧啶核苷酸是嘧啶核苷的磷酸酯。嘧啶核苷和嘧啶核苷酸及其衍生物還是合成有價值的藥物，如，例如，CDP-膽鹼，乳清酸或UMP(Kuninaka，A.所著的關於此內容的評論文章是在Biotechnology生物工程學第6卷(編者Rehm，H.-J.和Reed，G.)，VCH，Weinheim，Germany，1996，第561-612頁中發表的)的重要起始化合物。
許多，但不是全部微生物均能夠從外部供給的嘧啶核苷和嘧啶鹼基從頭合成它們的嘧啶核苷酸。嘧啶鹼基和/或嘧啶核苷通常不存在於細胞中。然而，在某些生長條件下，它們可能過量地形成，然後分泌到培養基中。由於這個原因，微生物可用於發酵生產嘧啶核苷酸和/或相關的化合物。
微生物生物合成嘧啶核苷酸的效率可通過基因操作嘧啶的生物合成途徑而達到最佳。就基因操作方法而論，嘧啶生物合成途徑的基因轉錄速度和/或基因拷貝數增加。由於這個原因，胞內酶活性和基因產物的比例增加。酶活性的增加使得在營養培養基中供給的化合物至嘧啶核苷酸和/或相關化合物的轉化增加，從而增加合成效率。因而，可顯示，例如，二氫乳清酸脫氫酶的活性增加，其催化(S)-二氫乳清酸至乳清酸的氧化-這是嘧啶核苷酸從頭生物合成嘧啶的第四階段-增加產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)中UMP合成的效率(Nudler，A.A.，Garibyan，A.G.和Bourd，G.I.(1991)FEMSMicrobiol.Lett.82263-266)。
本發明涉及來源於穀氨酸棒狀桿菌的，用於嘧啶生物合成途徑的二氫乳清酸脫氫酶的新pyrD基因，及其製備嘧啶核苷酸和/或嘧啶相關化合物的用途。
本發明其中一個部分包含pyrD基因產物。SEQ ID NO.2描述了一種多肽序列。該pyrD基因編碼具有33953分子量的322個胺基酸的多肽。本發明還涉及，此多肽的功能性衍生物，其可通過將SEQ ID NO2的序列缺失，插入或置換或缺失，插入和置換的組合，一個或多個胺基酸，優選直到25％的胺基酸，最優選直到15％的胺基酸而得到。術語功能性衍生物是指該衍生物的酶活性與具有SEQ ID NO.2序列的多肽的酶活性處於同一數量級。
本發明的另一部分包含編碼上述多肽的多核苷酸序列。該核苷酸序列可以從自穀氨酸棒狀桿菌分離的序列(即，SEQ ID NO.1)開始產生，其中這些序列是通過定點誘變而修飾的或，使用遺傳密碼反向翻譯相應的多肽之後，進行化學全合成。
這些多核苷酸序列最適於以用於宿主生物，優選微生物轉化的基因構造的形式應用。這些基因構造是由多核苷酸的至少一個拷貝和至少一個調節序列組成的。調節序列包含啟動子，終止子，增強子及核糖體結合位點。
用這些基因構造轉化的優選宿主生物是棒狀桿菌屬和芽孢桿菌屬(Bacillus)，但任一真核微生物也可用於此目的，優選Ashbya，假絲酵母屬(Candida)，畢赤氏酵母屬(Pichia)，糖酵母屬(Saccharomyces)和漢遜氏酵母屬(Hansenula)的酵母菌株。
本發明的另一部分包含通過培養以上述方法轉化的宿主生物，隨後分離嘧啶來製備嘧啶和嘧啶衍生物。嘧啶衍生物指的是一種具有嘧啶環的化合物，其可以通過用本發明的其中一個多核苷酸轉化宿主生物來製備。
培養微生物和從微生物產物中分離嘧啶的方法和過程對於本領域的技術人員來說是熟知的。
下列實施例描述本發明是如何產生的，及其為了增加嘧啶核苷酸和/或相關化合物的生產效率，在微生物基因操作中的應用。
序列列表(I)一般信息(1)申請人(A)名稱BASF-LYNX Bioscience AG(B)街 Im Neuenheimer Feld 515(C)市 Heidelberg(D)國家德國(E)郵政編碼69120(F)電話06221/4546(G)傳真06221/454770(2)標題來源於穀氨酸棒狀桿菌的二氫乳清酸脫氫酶的序列及其在微生物生產嘧啶和/或嘧啶相關化合物中的用途(3)序列數2(4)計算機可讀形式的類型(A)媒體類型軟盤(B)計算機 IBM PC兼容的(C)作業系統Windows NT(D)軟體Microsoftword 97 SR-1(I)SEQ ID NO.1的信息(1)序列特徵(A)長度966(B)類型核酸(C)鏈的類型雙鏈(D)拓撲結構線形(2)分子類型DNA(3)假擬無(4)反義無(5)源(A)生物Corynebacterium glutamicum穀氨酸棒狀桿菌(6)序列描述SEQ ID NO.1ATGGAAAAAATCATCGCAGTGCACGATGATTCCCTCTCCCAGGAAGTCTTCGGCGTCACCTTCCCACGACCACTAGGCCTCGCCGCAGGTTTCGACAAAAACGCATCAATGGCTGATGCCTGGGGTGCCGTTGGATTCGGATACGCCGAACTTGGCACCGTCACCGCCTCCCCACAGCCAGGAAACCCCACCCCGCGCCTTTTCCGCCTGCCTGCCGACAAAGCTATCTTGAACCGCATGGGATTCAACAACCTGGGTGCAGCAGAAGTCGCAAAAAACCTGCGCAACCGGAAATCCACCGATGTCATCGGCATCAACATCGGTAAAACCAAAGTGGTTCCCGCTGAACACGCAGTAGATGACTACCGCCGTTCTGCATCTTTGTTAGGTGATCTTGCTGATTACCTGGTTGTCAACGTTTCCTCCCCCAACACTCCGGGTCTCCGCGATCTGCAGGCTGTGGAATCTTTGCGACCAATCCTCGCCGCAGTGCAGGAATCCACCACCGTCCCAGTCTTGGTGAAAATCGCACCAGACCTCTCCGACGAAGACATCGACGCCGTAGCTGACCTGGCAGTTGAGCTCAAACTCGCCGGAATCGTAGCCACCAATACCACCATTTCCCGCGAAGGCCTCAACACTCCTTCAGGTGAAGTCGAAGCCATGGGTGCTGGCGGAATCTCCGGTGCTCCAGTAGCAGCCCGATCTTTGGAGGTACTCAAGCGCCTCTACGCACGGGTAGGCAAAGAGATGGTGTTGATCTCTGTCGGTGGCATCAGCACCCCTGAGCAAGCCTGGGAACGCATCACCTCCGGCGCAACCCTTCTGCAGGGATACACCCCATTCATCTACGGTGGCCCCGATTGGATCAGAGATATCCACCTTGGTATCGCCAAGCAGCTGAAAGCTCACGGTCTGCGCAACATCGCTGACGCTGTGGGCAGCGAATTGGAGTGGAAGAACTAA(I)SEQ ID NO.2的信息(1)序列特徵(A)長度322(B)類型胺基酸(C)鏈的類型單鏈(D)拓撲結構線形(2)分子類型胺基酸(3)假擬無(4)反義無(5)源(B)生物Corynebacterium glutamicum穀氨酸棒狀桿菌(6)序列的描述SEQ ID NO.2MEKIIAVHDDSLSQEVFGVTFPRPLGLAAGFDKNASMADAWGAVGFGYAELGTVTASPQPGNPTPRLFRLPADKAILNRMGFNNLGAAEVAKNLRNRKSTDVIGINIGKTKVVPAEHAVDDYRRSASLLGDLADYLVVNVSSPNTPGLRDLQAVESLRPILAAVQESTTVPVLVKIAPDLSDEDIDAVADLAVELKLAGIVATNTTISREGLNTPSGEVEAMGAGGISGAPVAARSLEVLKRLYARVGKEMVLISVGGISTPEQAWERITSGATLLQGYTPFIYGGPDWIRDIHLGIAKQLKAHGLRNIADAVGSELEWKN
權利要求
1.一種具有二氫乳氫酸脫氫酶活性的多肽，其選自(a)一種具有SEQ ID NO.2中描述的胺基酸序列的多肽，(b)一種與(a)相比，已經通過一個或多個胺基酸的缺失，插入或置換而被修飾了的多肽。
2.一種編碼權利要求1多肽的多核苷酸。
3.一種基因構造，其包含權利要求2的多核苷酸的至少一個拷貝，和至少一個調節序列。
4.一種用權利要求3的基因轉化的宿主生物。
5.一種生產嘧啶和嘧啶衍生物的方法，其中先培養權利要求4的宿主生物，隨後分離嘧啶或嘧啶衍生物。
全文摘要
本發明包含一種用於從穀氨酸棒狀桿菌生物合成嘧啶的基因(pyrD)的核苷酸序列及其用於微生物生產嘧啶的用途。
文檔編號C07K14/34GK1358229SQ00809504
公開日2002年7月10日 申請日期2000年6月23日 優先權日1999年6月25日
發明者M·馬克, K·赫爾布斯特 申請人:阿克薩隆生物科學股份公司