新豬環病毒、疫苗及診斷試劑的製作方法

2023-06-23 23:18:51

專利名稱：：新豬環病毒、疫苗及診斷試劑的製作方法新豬環病毒、疫苗及診斷試劑本申請是申請號為98810652.3、申請日為1998年10月1日、發明名稱為"新豬環病毒、疫苗及診斷試劑"的發明專利申請的分案申請。本發明涉及一種引起P麗S綜合症(豬多系統性消瘦綜合症，也稱為斷乳後多系統性消瘦綜合症)的新型豬環病毒株(porcinecircovirus簡稱為PCV)，涉及檢測其的試劑和方法，涉及免疫接種方法及疫苗，和涉及製備這些試劑和疫苗的方法。最初，在豬腎細胞系PK/15中檢測到PCV為非細胞致病性汙染物。此病毒與幼禽貧血病毒(簡稱為CAV)禾口PBFDV病毒(PscittacineBeakandfeatherdiseaseVirus)被分類為環病毒科(Circocuridae)。此病毒為小型無被膜病毒(從15-24nm)，共同特徵為含有1.76-2.31kb的環狀單鏈DNA形式的基因組。最初認為該基因組編碼一種約30kDa的多肽(Todd等人，病毒學文獻(ArchVirol)，1991，117;129-135)。然而，最近的工作顯示其更為複雜的轉錄(MeehanB.M.等人，1997，78:221-227)。此外，在三種類型已知環病毒之間的核苷酸序列或共同抗原決定簇中無明顯同源性。—直認為來源於PK/15細胞的PCV無致病性。其序列由MeehanB.M.等人，普通病毒學雜誌(J.Gen.Virol.)，1997,78:221-227可知。直到最近有人意識到PCV株可能為致病性的，與P麗S綜合症相關(GupiP.S.Nayar等人，加拿大獸醫雜誌(Can.Vet.J.)，1997，38:385-387;ClarkE.G.，美國豬應用協會進展(Proc.Am.Assoc.SwinePrac.)，1997;499-501)。Nayar等人利用PCR技術從患有P麗S綜合症的豬中檢測到PCVDNA。此前，尚未有野生型PCV毒株被分離和純化。在加拿大、美國和法國檢出的P麗S綜合症臨床上的特徵為體重逐漸下降，出現諸如呼吸急促、呼吸困難和黃疸的臨床表現。從病理學角度而言，這些症狀是淋巴細胞或肉芽腫浸潤、淋巴結病的臨床表現，和更罕見的肝炎、淋巴細胞性或肉芽腫性腎炎(ClarkE.G.，美國豬應用協會進展1997;499-501;LaSemaineVeterinaireNo.26，LaSemaineVeterinairei曾幹lj，1996(834);LaSemaineVeterinaire1997(857):54;GupiP.S.Nayar等人，加拿大獸醫雜誌，1997,38:385-387)。本申請人從肺或神經節樣本中成功分離了五種新PCV毒株，此後稱為根據本發明的環病毒，其中這些樣本獲自位於加拿大、美國(加利福尼亞)和法國(Brittany)的農場。已經從患有P麗S綜合症的豬的損傷處檢出這些病毒，而在健康豬中未檢出。此外，本申請人測定了這些毒株中的4株之基因組序列，即從加拿大、美國獲得的毒株以及從法國獲得的兩株毒株。在核苷酸水平上這些毒株相互之間顯示出強烈的同源性，超過96%;而與PK/15毒株之間同源性較低，約76X。因此，認為新毒株為一種新型豬環病毒的代表，此處稱為II型，I型由PK/15代表。因此，本發明的主題為分離的或純化製品形式的如上述的II型豬環病毒。本發明涉及可從患有P麗S綜合症病豬中的生理學樣本或組織，尤其是損傷組織樣本中分離的，尤其是依照實施例所述的方法分離的任何豬環病毒，特別是涉及II型環病毒。本發明的主題更具體的是五種毒株的純化製品，其已保藏在ECACC(歐洲動物細胞保藏中心，應用微生物及研究中心，PortonDown,Salisbury,WiltshireSP4OJG，英國)保藏號V97100219(此處稱為Imp.1008PCV);保藏號V97100218(此處稱為Imp.1010PCV);保藏號V97100217(此處稱為Imp.999PCV);於1997年10月2日(星期四)保藏，以及保藏號V98011608(此處稱為Imp.1011-48285);保藏號V98011609(此處稱為Imp.1011-48121);於1998年1月16日(星期五)保藏。本發明涉及從患病豬分離的豬環病毒，和/或與本發明毒株具有顯著血清學相似性的環病毒，和/或在嚴格條件下可與本發明的毒株交叉雜交的環病毒，所述嚴格條件是指例如不能與PCVPK/15毒株雜交。從患有P麗S綜合症的豬中的生理學樣本或組織，尤其是損傷組織樣本中分離的病毒株可有利地在細胞系中增殖，尤其是豬腎細胞系，特別是無汙染物(如PCV以及瘟病毒、豬腺病毒和豬細小病毒)的PK/15細胞中，用於其複製或具體地產生抗原，包括完整抗原(如病毒)和/或抗原亞單位(如多肽)。非常明顯而出人意料的是，已證明這些分離物在PK/15細胞培養物中產量很大，這無疑對病毒或抗原，尤其是對滅活疫苗的產生十分有利。本發明的主題還涉及環病毒製品，其中在體外培養的細胞特別是細胞系(如PK/15細胞)傳代後分離環病毒，所述細胞或細胞系被至少一種根據本發明的環病毒感染，或者被可從患有P麗S綜合症的豬的生理學樣本或從組織樣本(尤其是損傷組織)中分離的任一種豬環病毒感染。本發明的主題還包括培養物提取物或上清液，任選地，其通過標準技術純化，以及通常任一種獲自體外培養物的抗原性製品。本發明的主題還涉及免疫活性組分和含有至少一種上述抗原的疫苗。其可為基於減毒活體全病毒的免疫活性組分，或用這些活性組分製備的疫苗。可根據常規方法進行減毒，例如，通過在細胞上進行傳代，優選在豬細胞特別是細胞系(如PK/15細胞)上傳代，例如從50至150次，特別是約100次水平的傳代。這些疫苗一般包括獸醫學可接受的載體或稀釋劑，任選地，獸醫學可接受的佐劑，以及任選地一種冷凍乾燥穩定劑。這些疫苗優選地包含103_106TCID50。其可是免疫活性組分，或基於根據本發明環病毒抗原的滅活狀態的疫苗。這些疫苗還包括獸醫學可接受的載體或稀釋劑，以及任選地獸醫學可接受的佐劑。根據本領域普通技術人員已知的技術，滅活根據本發明的環病毒以及可能存在的組分。滅活優選地通過化學方法進行，如通過使抗原接觸一種化學藥劑，如甲醛(福馬林)、多聚甲醛、e-丙內酯、乙撐亞胺或其衍生物。滅活優選的方法為此處所述的接觸化學藥劑，特別是接觸乙撐亞胺或e-丙內酯。優選地，通過本領域技術人員周知的方法，根據本發明的滅活疫苗可添加佐劑有利地以乳液形式提供，例如油包水或水包油型。也可根據佐劑性質將常規佐劑化合物摻入活性組分中。5可用的佐劑中，以舉例的方式，包括但不限於氫氧化鋁、皂甙(如Quillaja皂武或QuilA;參見"疫苗設計，亞單位疫苗劑佐劑方法"，1995，MichaelF.Powel和MarkJ.Newman編，PIen皿m出版社，New-York及London,210頁)、Avridine(疫苗設計，148頁)、DDA(溴化二甲基雙十八烷基銨，疫苗設計，157頁)、聚磷腈(疫苗設計，204頁)、或備擇的基於礦物油、角鯊烷(例如SPT乳液，疫苗設計，147頁)、角鯊烯(例如MF59，疫苗設計，183頁)的水包油型乳液，或基於可代謝油(優選根據W0-A-9420071)的油包水型乳液，以及us-a-5，422，109中所述的乳液。也可選擇佐劑的組合，例如Avridiiie⑧或dda與一種乳液組合。這些疫苗優選地包含106-108TCID50。活疫苗佐劑可選自那些用於滅活疫苗的佐劑，優選乳液。可在用於滅活疫苗中所示的那些乳液還包括W0-A-9416681中所述的那些乳液。至於冷凍乾燥穩定劑，其以舉例方式可為SPGA(Bovarnik等人，細菌學雜誌(J.Bacteriology)，59,509,950)、碳水化合物(如山梨醇、甘露醇、澱粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖)、蛋白質(白蛋白或酪蛋白)，或這些化合物的衍生物，或如鹼金屬磷酸鹽的緩衝液。此夕卜，申請人獲得了分離株中4個的基因組，鑑定為SEQIDNO:1-4和任選地SEQIDNo:6。因此，本發明的主題是含有這些序列之一的部分或全部的DNA片段。不言而喻，本發明自然涵蓋了等同序列，即不改變所述序列的功能或菌株特異性的序列，或由該序列編碼的多肽之菌株特異性的序列。當然，由於密碼子簡併性造成的差異也包括在內。本發明也涵蓋了這樣的等同序列，它們在高度嚴格條件下可與上述序列雜交，和/或與本發明的毒株有高度同源性，且屬於上述II型環病毒組。藉助適當載體，這些序列及其片段可有利地用於多肽的體外或體內表達。特別是，已經鑑定了在II型環病毒基因組序列上的可用於此方面的開放閱讀框架，其形成了根據本發明的DNA片段。本發明涉及含有至少一個這些開放閱讀框架(相應於胺基酸序列)的任何多肽。優選地，本發明涉及一種基本上由0RF4、0RF7、0RF10或0RF13組成的蛋白質。為了在體外表達亞單位，作為一種表達方法可優選使用大腸桿菌或杆狀病毒(US-A-4，745，051)。將編碼序列或其片段整合入杆狀病毒基因組(如，杆狀病毒苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒AcNPV)，將後者在昆蟲細胞中增殖，如草地夜蛾(SpodopterafrugiperdaSf9)(保藏號ATCCCRL1711)。也可在真核細胞如酵母(如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))或哺乳動物細胞(如CH0、BHK)中表達亞單位。本發明的主題也涉及可通過這些表達方法製備，然後任選地根據傳統技術純化的多肽。本發明還涉及一種亞單位疫苗，其包括在獸醫學可接受的載體或稀釋劑之中的至少一種如此獲得的多肽，或其片段，以及任選地獸醫學可接受的佐劑。為了用於製備重組活體疫苗的體內表達，在允許該多肽表達的條件下將編碼序列或其片段插入一種合適的表達載體。至於合適的載體，根據本領域技術人員周知的技術可使用活病毒，優選地能在豬中增殖、對豬無致病性(天然無致病性或賦予此性質)。尤其是可使用豬皰疹病毒如假狂犬病病毒、豬腺病毒、皰疹病毒、痘病毒，特別是痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒和豬痘病毒。也可使用質粒DNA作為載體(W0-A-9011092，W0-A-9319813，WO-A-9421797，W0-A-9520660)。因此，本發明主題也涉及如此製備的載體和重組活體疫苗或質粒疫苗(多核苷酸或DNA疫苗)，此外，疫苗包括獸醫學可接受的載體或稀釋劑。根據本發明的疫苗(活體減毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、重組疫苗和質粒疫苗)可包括一種或多種(2或3種)根據本發明環病毒之中的一種或多種的一種或多種活性組分(抗原)。對於每一上述疫苗類型，本發明也提供了針對豬環病毒的免疫接種與針對其它豬疾病(特別是可與P麗S症候群相關的疾病)的免疫接種的聯合免疫接種疫苗。因此，根據本發明的疫苗，特別是滅活疫苗可包含相應於其它豬病原體的效價。這些其它豬病原體中，優選地包括PRRS(豬生殖和呼吸症候群)(本領域技術人員可參見W0-A-93/07898，W0-A-94/18311，FR-A-2709966;C.chareyre等人，第15屆IPVS大會論文集，Birmingham,英國，1998年7月5-9日，139頁；此處引入作為參考)和/或豬肺炎支原體(Mycoplasmahyop腦monia)(本領域技術人員可參見EP-A-597852;EP_A_550477;EP-A-571648;0.Martinon等人，157，284和285頁以及G.Reynaud等人，150頁，均在上述第15屆IPVS大會論文集，此處引入作為參考)。其它可能感興趣的疫苗可包括大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropne咖oniae)、大腸桿菌、豬萎縮性鼻炎以及偽狂犬病(Aujeszky病)、豬霍亂、豬流感。本發明的主題還涉及一種方法，從而可在豬中誘導針對本發明環病毒的免疫反應。該方法特別是一種在豬中有效的方法。該方法可向豬一次或多次施用上述疫苗。也可在同一免疫接種方案中聯合上述數種類型的疫苗。該方法不僅可向成年豬施用，也可向幼豬或懷孕雌豬施用。對後者的免疫接種可對新生豬賦予被動免疫(母本抗體)。本發明還提供了在豬中診斷根據本發明的環病毒的可能性。因此，本發明的主題還包括利用下述試劑的診斷試驗和與其相關的方法。對不同環病毒序列的了解使得確定共同序列成為可能，這使其可製備能識別所有已知豬環病毒的反應物片段。為了進行特異性診斷，本領域普通技術人員能選擇這樣的序列片段，其相應於與對應的PK/15環病毒序列沒有或幾乎沒有同源性的區域。本領域普通技術人員可通過序列比較選擇符合其意願的反應物片段。第一種反應物片段存在於此處公開的序列及其片段中，其可特別地在周知的雜交或PCR(聚合酶鏈反應)技術中用作探針或引物。第二種反應物片段存在於由來自病毒的這些序列編碼的多肽或在載體幫助下表達的多肽(見上)，或根據傳統用於肽合成的技術通過化學途徑合成的多肽。第三種和第四種反應物片段分別存在於多克隆和單克隆抗體，其可根據傳統方法從病毒提取多肽或片段、或由DNA序列編碼的多肽或其片段製備。這第二、三和四種反應物片段可用於本發明主題的診斷方法，其中對獲自待測豬的生理學液體樣本(血液、血漿、血清等)或組織樣本(神經中樞、肝臟、肺、腎等)進行試驗，通過搜尋檢測抗原自身或針對該抗原的抗體，檢驗是否存在特異於根據本發明環病毒的抗原。根據本發明的抗原和抗體可用於任何已知的實驗室診斷技術。然而，優選地在可由獸醫、飼養者或牲畜主現場直接使用的技術中使用這些抗原和抗體。本領域技術人員可使用多種實驗室和現場技術，因此可有利地改造這些抗原和/或抗體以適於作為診斷試劑的應用。可在本發明的框架中優選使用的診斷技術為蛋白質印跡、免疫螢光、ELISA和免疫層析。就免疫層析的使用而言，專業人士可特別參見Robertf.Zurk等人，臨床化學(Clin.Chem.)，31/7，1144-1150(1985)，以及下列專利或專利申請W0-A-88/08534、W0-A-91/12528、EP-A-291176、EP_A_299428、EP_A_291194、EP_A_284232、US_A_5120643、US-A-5030558、US-A-5266497、US-A-4740468、US-A-5266497、US-A-4855240、US-A-5451504、US-A-5141850、US-A_5232035和US-A-5238652。因此，優選通過間接試驗(通過競爭或通過替換)在樣本中檢測特異性抗體。為此，使用抗原自身，或保留了抗體識別位點的該抗原片段作為檢測試劑。可有利地使用過氧化物酶標記或特定標記進行標記，優選用膠體金。也期望在特異於該抗原的標記抗體的幫助下檢測樣本中的抗原本身。標記有利地為如上所述。對於特異於可特別用於競爭或替換的抗原之抗體，或特異於用來檢測抗原自身的抗體，應理解為特異於抗原的多克隆抗體或單克隆抗體、這些抗體的片段，優選為Fab或F(ab)'2片段。本發明的另一方面是特異於根據本發明的抗原的單克隆或多克隆抗體，這些抗體可特別用作診斷試劑，在生理學液體樣本或組織樣本中檢測抗原，或者甚至在這樣的樣本或樣品中檢測抗體。本發明還包括這些抗體的免疫功能性片段，特別是Fab和F(ab)'2片段。抗體可通過常規技術製備。可特別參見"抗體，實驗室手冊"，1988，冷泉港實驗室，美國，或J.W.Goding。"單克隆抗體原理與實踐"，學院出版社，其內容此處引入作為參考。也可特別的以自知方法進行小鼠脾細胞與適當的骨髓瘤細胞的融合，其中小鼠用抗原或至少一種該抗原的片段免疫過。本發明的主題還包括一種特異於抗原的單克隆或多克隆抗體(特別是小鼠或兔抗體)製品，其優選為純或基本上純，或甚至為粗品。本發明還可以確定目標表位，特別是基於此處描述的DNA序列，確定是否存在免疫用的表位或診斷用的表位。從根據本發明的環病毒基因組的DNA序列，本領域技術人員可根據已知方法，例如一種適當的電腦程式或PEPSCAN確定表位。表位是蛋白質的免疫決定區域，是暴露在蛋白質表面的區域。由此，其可通過抗體識別，因而可特別用於診斷領域，用於診斷目的之抗體製備或者用於可用作診斷試劑的相應肽的製備。—個表位至少是具有8-9個胺基酸的肽。通常優選最少為13-25個胺基酸。本領域技術人員因此可使用一種或多種這些技術以及其它可能的技術，發現可用於診斷目的的肽或抗體的表位。本發明的主題還包括診斷試劑盒，其中含有該抗原和/或特異於該抗原的多克隆8或單克隆抗體。特別是相應於上述診斷技術的診斷試劑盒。以下，本發明將以非限制性實施方案結合附圖更詳細的進行描述，其中圖1.Imp.1011-48121株的基因組DNA序列。圖2.Imp.1011-48285株的基因組DNA序列。圖3.Imp.999株的基因組DNA序列。圖4.Imp.1010株的基因組DNA序列。圖5.根據圖1-4的4個序列與PCVPK/15株序列的比較。圖6.在1997年10月3日法國首次遞交的文件中的Imp.999株的基因組DNA序列。圖7.圖6序列與PK/15株序列的比較。序列表SEQIDSEQIDNO:lImp.1011-48121株的基因組DNA序列。SEQIDNO:2Imp.1011-48285株的基因組DNA序列。SEQIDNO:3Imp.999株的基因組DNA序列。SEQIDNO:4Imp.1010株的基因組DNA序列。SEQIDNO:5PCVPK/15株基因組的DNA序列。SEQIDNO:6在1997年10月3日法國首次遞交的文件中的Imp.999株的基因組DNA序列。實施例實施例1豬環病毒株的培養及分離從法國、加拿大和美國小豬的肺和淋巴結收集組織樣本。這些小豬均顯示典型的斷乳後多系統消瘦綜合症的臨床症狀。為便於病毒分離，屍檢後立即將組織樣本於-7(TC冷凍。為了病毒分離，在含有Earle鹽(EMEM，BioWhittaker英國有限公司，Wokingham,英國)、青黴素(100IU/ml)和鏈黴素(100iig/ml)的基本培養基(MEM-SA培養基)中，通過利用無菌馬達和杵將組織樣本與無菌沙研磨，製備含有約15%組織樣本的懸浮液。然後將此研磨製品加入MEM-SA，4。C下於3000g離心30分鐘，收穫上清液。在接種細胞培養物之前，1001體積的氯仿加入各個2ml上清液中，室溫下連續混合10分鐘。然後將此混合物轉移入微量離心管中，3000g離心IO分鐘，收穫上清液。將此上清液用作病毒分離實驗的接種物。所有的病毒分離研究均在PK/15細胞培養物上進行，該培養物已知無豬環病毒(PCV)、瘟病毒、豬腺病毒和豬細小病毒汙染(AllanG.等人，初乳停斷小豬的豬環病毒實驗性感染的病原體及豬胎材料的檢查，獸醫微生物(Vet.Microbiol.)，1995，44，49-64)。根據下列技術進行豬環病毒的分離通過從生長至鋪滿的培養物用胰蛋白酶(胰蛋白酶-依地酸混合物)消化分離PK/15細胞單層，以終濃度約400，000個細胞/ml加入含有15%胎牛血清無瘟病毒汙染的MEM-SA培養基(=MEM-G培養基)。然後將此細胞懸浮液的10ml等份與2ml上述接種物等份混合，最終將混合物以6ml等份培養於兩個25cm2的Falcon燒瓶中。在含10%C02的氛圍中37t:培養18小時。培養後，用300mMD_葡糖胺(Cat#G48175，Sigma-Aldich化學有限公司，Poole，英國)處理半鋪滿單層的培養液(TischerI.等人，病毒學文獻，1987，96:39-57)，然後37t:繼續培養48-72小時。後一培養結束後，每個接種物的兩個Falcon燒瓶之一經過連續3次凍/融循環。所剩Falcon燒瓶之PK/15細胞用胰蛋白酶_依地酸溶液處理，重懸於20mlMEM-G培養基中，以約400，000個細胞/ml濃度接種入75cm2的Falcon中。通過加入經過凍/融循環獲得的相應裂解物5ml，"超感染"新鮮接種的燒瓶培養物。實施例2用於通過免疫螢光或原位雜交檢測豬環病毒的細胞培養物樣本的製備收集5ml超感染的懸浮液，接種入直徑55mm的帶有無菌無脂玻璃蓋玻片的培養皿。在燒瓶中及玻璃蓋玻片上的培養物於37t:培養，如實施例l所述用葡糖胺處理。用葡糖胺處理後24-48小時收集玻璃蓋玻片上的培養物，用丙酮室溫下固定10分鐘，或用10%緩衝的甲醛固定4小時。固定後，所有玻璃蓋玻片在矽膠上於-7(TC儲存，直至用於原位雜交研究和免疫細胞化學標記研究。實施例3通過原位雜交檢測PCV的技術對從患病豬收集的且用甲醛固定的組織進行原位雜交，也對固定於玻璃蓋玻片上之為了病毒分離(見實施例2)接種的細胞培養物製品進行原位雜交。使用相應於PK/15豬環病毒(PCV)以及相應於傳染性禽貧血病毒(CAV)的完整基因組探針。使用質粒PPCV1作為PCV的特異性病毒DNA來源，其中含有以單一1.7千鹼基對(kbp)插入片段形式克隆的PCV基因組複製形式(MeehanB.等人，豬環病毒DNA基因組序列與植物環病毒的親和性，普通病毒學雜誌，1997,78:221-227)。使用含有2.3kbp複製形式的禽環病毒病毒CAV之類似質粒pCAAl作為陰性對照。使用兩個質粒各自的甘油儲藏原種用於根據鹼裂解技術製備和純化質粒(SambrookJ.等人，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室，紐約，1989)，使其可用作模板製備探針。從上述純化的質粒以及根據供應商說明使用市售非放射性標記試劑盒(DIGDNA標記試劑盒，BoehringerMannheim,Lewes，英國)從隨機六核苷酸引物製備代表PCV和CAV完整基因組的環病毒探針(每個探針1Pg)。在用於原位雜交前將地高辛標記的探針加入體積為50-100的無菌水中。製備包埋在石蠟中用甲醛固定的患豬組織樣本以及用甲醛固定的感染細胞培養物製品，用於按如下技術檢測PCV核酸從包埋於石蠟中的組織切下厚度為5ym的切片，除去石蠟，在濃度遞減的連續乙醇溶液中再水合。用甲醛固定的組織切片和細胞培養物在37°C下於0.5%蛋白酶K之0.05MTris-HCl溶液中(含有5mMEDTA，pH7.6)分別溫育15分鐘和5分鐘。然後將載玻片置於1%甘氨酸的無菌蒸餾水溶液中30秒，用0.01MPBS緩衝液(磷酸緩衝鹽液，pH7.2)洗滌兩次，最後用無菌蒸餾水洗滌5分鐘。將其空氣乾燥，與探針接觸。每一組織/探針製品加蓋潔淨無脂玻璃蓋玻片，置於9(TC爐中10分鐘，然後與冰塊接觸1分鐘，最後於37t:培養18小時。將製品短暫浸入2X檸檬酸鈉(SSC)緩衝液(pH7.0)，以去除保護性玻璃蓋玻片，然後於2XSSC緩衝液中洗滌兩次5分鐘，最後於PBS緩衝液中洗滌兩次5分鐘。經過洗滌後，將製品浸入0.1M馬來酸、0.15MNaCl(pHl.5)(馬來酸緩衝液)10分10鍾，然後於37t:在1%封閉試劑(Cat.#1096176，BoehringerMannheim,英國，Lewis,EastSussex,英國)的馬來酸緩衝液溶液中溫育20分鐘。然後，製品與稀釋於封閉緩衝液中的抗地高辛單克隆抗體1/250溶液(BoehringerMannheim)37"C下溫育1小時，於PBS中洗滌，最後與生物素醯化抗小鼠免疫球蛋白抗體37t:下溫育30分鐘。製品在PBS中洗滌，通過用0.5%過氧化氫的PBS溶液室溫下處理20分鐘封閉內源過氧化物酶活性。再次用PBS洗滌製品，用即配即用的3-氨基-9-二乙基咔唑(AEC)底物處理(CambridgeBioscience,Cambridge,英國)。最終用自來水洗滌後，將製品用蘇木精復染，在自來水中"變藍"，用封固液(GVAMount,CambridgeBioscience,Cambridge,英國)封固於顯微鏡玻璃蓋玻片上。實驗對照包括了在獲自患病豬和非患病豬的樣本上使用非相關陰性探針(CAV)和陽性探針(PCV)。實施例4:通過免疫螢光檢測PCV的技術使用1/100稀釋的成體豬血清集合通過間接免疫螢光技術(IIF)進行丙酮固定的所有細胞培養物製品的初次篩選。該血清集合包含來自北愛爾蘭的25隻成體豬的血清，其中已知含有針對多種豬病毒(包括PCV、豬細小病毒、豬腺病毒和PRRS病毒)的抗體。通過將稀釋於PBS中的血清37t:下接觸細胞培養物1小時，進行IIF技術，然後在PBS中洗滌兩次。再用1/80稀釋的與螢光素異硫氰酸結合的兔抗豬免疫球蛋白抗體PBS溶液染色細胞培養物1小時，用PBS洗滌，在紫外光下顯微鏡觀察之前用甘油緩衝液封固。實施例5:對患病豬組織原位雜交的結果使用由獲自法國、加拿大和加利福尼亞小豬的用甲醛固定的組織的PCV基因組探針進行原位雜交，其中小豬患有多系統消瘦綜合症，結果顯示在數個研究的損傷組織中存在與損傷相關的PCV核酸。當對獲自非病患豬的組織使用PCV探針時或者對患病豬使用CAV探針時未觀察到信號。在浸潤入加利福尼亞小豬肺部損傷中的大量單核細胞之胞漿和細胞核中檢出PCV核酸。在肺細胞、支氣管和細支氣管上皮細胞以及在微動脈、小囊突和淋巴管的內皮細胞中也證實PCV核酸的存在。在患病法國豬中，在大量濾泡淋巴細胞和淋巴結竇狀(小管)內單核細胞的胞漿中也存在PCV核酸。在臨時合胞體中也存在PCV核酸。根據這些檢測結果，選擇加利福尼亞豬肺、法國豬腸繫膜淋巴結和加拿大豬器官用於分離新型豬環病毒株。實施例6:新型豬環病毒株細胞培養物及免疫螢光檢測結果在用獲自法國小豬(Imp.1008株)、加利福尼亞小豬(Imp.999株)和加拿大小豬(Imp.1010株)接種的細胞培養物中未觀察到致細胞病變效應，這些豬顯示多系統消瘦的臨床症狀。然而，獲自接種細胞培養物的製品的免疫標記在用丙酮固定及用豬多克隆血清集合染色後，利用加利福尼亞小豬肺(Imp.999株)、法國小豬腸繫膜淋巴結(Imp.1008株)、和加拿大小豬器官(Imp.1010株)接種的培養物的大量細胞中顯示核螢光。實施例7:豬環病毒基因組DNA的提取利用感染的PK/15細胞培養物(10隻75cm2Falcon)製備新型豬環病毒毒株的複製形式(見實施例1)，該細胞培養物培養72-76小時後收穫，用葡糖胺處理，如CAV複製形式克隆時所述(Todd.D等人，利用克隆DNA探針斑點雜交檢測禽貧血病毒，臨床微生物雜誌，1991,29:933-939)。根據改進的Hirt技術提取這些複製形式的雙鏈DNA(HirtB.從感染細胞培養物中選擇性提取多病毒DNA，分子生物學雜誌，1967，36:365-369)，如Molitor所述(MolitorT.W.等人，豬細小病毒DNA:兩種病毒分離物的基因組及複製形式的表徵，病毒學，1984，137:241-254)。實施例8:豬環病毒Imp.999株基因組複製形式的限制性圖譜依供應商說明，用SI核酸酶(Amersham)處理根據Hirt技術提取的DNA(1-5yg)，然後用多種限制酶(BoehringerMannheim,英國，Lewis,EastSussex，英國)酶切此DNA，如Todd等人所述，在存在溴乙錠時於1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離酶切產物(禽貧血病毒的純化和生化表徵，普通病毒學雜誌，1990,71:819-823)。從Imp.999株培養物提取的DNA具有單一EcoRI位點、兩個Sacl位點，不含有任何PstI位點。因此，此限制性圖譜不同於PCVPK/15毒株的限制性圖譜，該毒株中含有Pstl位點，而不含有任何EcoRI位點。實施例9:豬環病毒Imp.999株基因組的克隆用限制性酶EcoRI酶切PCVImp.999毒株雙鏈複製形式產生的約1.8kbp限制性片段，使用Qiagen市售試劑盒(QIAEXII凝膠提取試劑盒，Cat#20021，QIAGENLtd.，Crawley,WestSussex,英國)在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離酶切產物(見實施例3)。然後根據標準克隆技術(SambrookJ.等人，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室，紐約，1989)，將此EcoRI-EcoRI限制性片段與已經用相同限制性酶消化並去磷酸化的載體pGEM-7(Promega，醫學供應公司，都柏林，愛爾蘭)連接。根據標準技術，用獲得的質粒轉化大腸桿菌JM109宿主菌株(Stratagene，LaJolla，美國)。還將PCVImp.999毒株EcoRI-EcoRI限制性片段克隆入載體pBlueScriptSK+的EcoRI位點(Stratagene，LaJolla，美國)。在每一宿主菌株獲得的克隆中，篩選了含有期望片段大小的至少兩個克隆。然後培養所得克隆，根據標準質粒製備和純化技術，以小體積(2ml)或大體積(250ml)純化含有完整Imp.999毒株基因組的質粒。實施例10:PCVImp.999毒株基因組DNA(雙鏈複製形式)的序列測定根據Sanger雙脫氧核苷酸技術使用測序試劑盒"AmpliT叫DNA聚合酶FS"(Cat#402070PEAppliedBiosystems,Warrington,英國)以及依製造商說明用AppliedBiosystemsABI373A自動測序儀測定兩個EcoRIImp.999克隆(克隆pGEM-7/2和克隆pGEM-7/8)的核苷酸序列。用M13"正向"和"反向"通用引物進行初步測序反應。根據"DNA步行，，技術進行如下測序反應。由LifeTechnologies(Inchin薩BusinessPark,Paisley,英國)合成下列序列測定所需的寡核苷酸。用MacDNASIS3.2版軟體裝配產生的序列並分析(Cat#22020101，A卯ligene，Durham，英國)。通過由"國家生物工程信息中心"伺服器(NCBI，Bethesda，MD，美國)可得的BLAST序列對比工具分析開放閱讀框架。最初從克隆pGEM-7/8獲得的完整序列(EcoRI-EcoRI片段)(SEQIDNO:6)示於圖6。其任意地從EcoRI位點中的G之後開始，從核苷酸角度而言存在幾個不確定的地方。然後優化序列測定，SEQIDN0:3(圖3)給出了此毒株的總序列，其任意地從EcoRI位點開始，即G為第一個核苷酸。採用類似方法獲得其它三種根據本發明的分離物之序列(見SEQIDNO:1、2和4，以及圖1、2和4)。這四個毒株的基因組大小為Imp.1011-481211767核苷酸Imp.1011-482851767核苷酸Imp.9991768核苷酸Imp.10101768核苷酸實施例11:PCVImp.999毒株序列分析當從Imp.999毒株產生的序列用於同GenBank資料庫中含有的序列進行同源性測試時，僅檢測出與PK/15株(保藏號Y09921和U49186)序列在核酸水平上有約76%的同源性(見圖5)。在胺基酸水平，與資料庫的6相序列翻譯同源性測試(在NCBI伺服器上的BLAST序列對比工具)可證實與相應於理論上的BBTV病毒之複製酶的開放閱讀框架有94%同源性，其類似於由GenBankU49186序列編碼的植物環病毒(GenBank鑑定號1841515)。其它資料庫中含有的序列與從PCVImp.999毒株產生的序列無明顯的同源性。收集自患有多系統消瘦綜合症的加利福尼亞小豬損傷組織之培養的Imp.999毒株所產生的序列分析清楚表明，此病毒分離物是一種新型豬環病毒株。實施例12:序列的比較分析與PCVPK/15株序列進行4株新PCV毒株核苷酸序列的序列比較(圖5)。建立考慮了4株新毒株和已有PK/15毒株的同源性矩陣。結果如下1:Imp.1011-481212:Imp.1011-482853:Imp.9994:Imp.10105:PK/1512345tableseeoriginaldocumentpage13兩株法國毒株Imp.1011-48121與Imp.1011-48285的同源性超過99%(0.9977)。0141]兩株北美毒株Imp.999與Imp.1010之間的同源性也大於99%(0.9949)。法國毒株與北美毒株之間的同源性略大於96%。所有這些毒株與PK/15的同源性在75%_76%之間。由此可推知，根據本發明的毒株代表了一種不同於由PK/15株代表的類型的新豬環病毒類型。從顯示P麗S綜合症的豬分離的這一新類型稱為II型豬環病毒，PK/15代表I型。雖然它們事實上分離自十分不同的地理區域，屬於此II型的毒株之間顯示明顯的同源性。實施例13:由新PCV毒株基因組編碼的蛋白質的分析認為Imp.1010分離物的核苷酸序列是與多系統消瘦綜合症相關的其它環病毒毒株的代表。用BLAST序列對比工具以及MacVecter6.0軟體程序組合(牛津分子組，牛津0X44GA，英國)，詳細分析此序列(Altschul等人，分子生物學雜誌，1990，215:403-410)。在此序列(環狀基因組)上可檢測到體積大於20個胺基酸的13個開放閱讀框架(ORF)。這13個ORF為名稱tableseeoriginaldocumentpage14每個0RF的起始和終止位點參見圖4(SEQIDNO:4)的1010毒株基因組。ORF1-13的界限與999毒株相同。它們1011-48121毒株及1011-48285毒株中ORF的界限也與999毒株中相同，除了ORF3和13:ORF31432-1539，有義，108nt，35aaORF13314-1377，反義705nt，234aa。13個0RF中，4個與位於克隆病毒PCVPK/15的基因組之類似ORF具有明顯同源性。分析了所有與多系統消瘦綜合症有關的環病毒分離物基因組上的每個開放閱讀框架。這4個ORF如下tableseeoriginaldocumentpage15每個ORF的起始和終止位置參見圖4(SEQIDNO:4)的序列。ORF的大小(以核苷酸計=nt)包括終止密碼子。PCVImp.1010與PCVPK-15分離株的基因組排列之間的比較鑑定了兩種病毒基因組中保守的4個0RF。下表為觀察到的同源性程度ORFImp.1010/0RFPCVPK-15同源性百分比0RF4/0RF186%0RF13/0RF366.4%0RF7/0RF361.5%(在重疊水平(104aa))ORF10/ORF483%(在重疊水平(59aa))在0RF4Imp.1010與0RF1PK-15之間觀察到最大序列相同性(86%同源性)。由於此蛋白質可能參與了病毒DNA複製，且為病毒複製的關鍵，預計有這樣的同源性(Meehan等人，普通病毒學雜誌，1997,78:221-227;Mankertz等人，普通病毒學雜誌，1998,79:381-384)。在0RF13Imp.1010與0RF2PK-15之間序列相同性不甚強(66.4%同源性)，但這兩個ORF各自的確存在高度保守的N-末端基本區域，其與CAV禽環病毒的主要結構蛋白質之N-末端區域相同(Meehan等人，病毒學文獻，1992，124:301-319)。此外，在0RF7Imp.1010與0RF3PK-15之間以及0RF10Imp.1010與0RF4PK-15之間觀察到許多差異。每個情況中，當與PCVPK-15的0RF3及0RF4比較時，Imp.1010分離株的ORF7和0RF10的C-末端存在缺失。在0RF7/0RF3以及0RF10/0RF4的N-末端區域水平上觀察到最大序列同源性，分別為61.5%同源性(在重疊水平)和83%同源性(在重疊水平)。由於豬環病毒基因組特別緊密，其基因組排列似乎相當複雜。主要結構蛋白質可能由位於豬環病毒基因組相同鏈上的數個閱讀框架剪接產生。因此，上表中的任一開放閱讀框架(0RF1-0RF13)可代表所有或部分由II型豬環病毒編碼的抗原性蛋白質，因此可能是一種可用於特異性診斷和/或用於免疫接種的抗原。因此，本發明涉及任一包含至少一種上述ORF的蛋白質。優選地，本發明涉及一種基本上由0RF4、0RF7、0RF10或0RF13組成15的蛋白質。實施例14:由新毒株克隆的PCV基因組的傳染特性根據由Meehan等人所述的技術，將含有Imp.999分離株的完整基因組(複製形式)的質粒pGEM-7/8轉染入PK/15細胞(用禽貧血病毒感染的細胞之病毒DNA的表徵克隆的複製形式的序列分析及克隆的基因組片段的轉染能力，病毒學文獻，1992，124:301-309)。對非汙染的PK/15細胞上轉染後的第一次傳代細胞進行免疫螢光分析(見實施例4)，顯示克隆pGEM7/8的質粒能誘導傳染性PCV病毒的產生。含有傳染性PCV遺傳物質的克隆的獲得，允許為製備經修飾的PCV病毒(在豬中減毒的或缺陷型的)對病毒基因組進行任何有用的操作，其中經修飾的PCV病毒可用於製備減毒或重組疫苗，或用於製備用作診斷試劑盒的抗原。實施例15:體外培養製備PCV抗原根據如實施例1的相同方法進行非汙染PK/15細胞的培養和病毒操作。在37t:培養4天後經胰蛋白酶消化並計數後，收集感染細胞。以每ml中400，000個感染的細胞接種下一代細胞。實施例16:病毒抗原的滅活病毒培養結束後，收集感染的細胞，用超聲波(BransonSonifier)或藉助轉子-定子型膠體磨(UltraTurrax，IKA)裂解細胞。懸浮液在3700g下離心30分鐘。用0.1%乙撐亞胺於37"下滅活病毒懸液18小時，或用0.5%P-丙內酯於28t:滅活24小時。如果在滅活前病毒滴度不足，利用300kDa截流分子量的膜通過超濾濃縮病毒懸浮液(MilliporePTMK300)。滅活的病毒懸浮液儲存於5°C。實施例17:以基於礦物油的乳液形式製備疫苗根據如下配方製備疫苗滅活豬環病毒懸浮液250mlMontanideisa70(seppic):750mi分開單獨對水相和油相過濾除菌。通過藉助Silverson渦輪乳化機混合和勻槳化組分製備乳液。—只疫苗劑量含有約10"TCID50。對皮內施用，一隻疫苗劑量體積為0.5ml，對肌內途徑給藥為2ml。實施例18:可代謝性油基乳液形式的疫苗製備根據下列配方製備疫苗滅活豬環病毒懸浮液200mlDehymulsHRE7(Henkel):60mlRadia7204(Oleofina):740ml分開單獨對水相和油相過濾除菌。藉助Silverson渦輪乳化機混合和勻槳化組分製備乳液。—只疫苗劑量含有約10"TCID50。對於肌內途徑給藥，一隻疫苗劑量體積為2ml。實施例19:與美國和法國PCV病毒株有關及與汙染有超免疫血清(PCV-T)的PK/15的間接免疫螢光結果，以及從PK/15製備的單克隆抗體F99表和從加拿大株(PCV-C)製備的超免疫血清tableseeoriginaldocumentpage17*在間接免疫螢光中產生陽性反應的血清或單克隆抗體的最終稀釋度之倒數。權利要求II型豬環病毒的純化製品。2.豬環病毒的純化製品，其選自保藏於ECACC保藏號為V97100219、V97100218、V97100217、V98011608、V98011609的製品。3.由細胞產生且從細胞培養物中體外分離的豬環病毒製品，其中所述細胞已用一種豬環病毒感染，該病毒能從患有P麗S綜合症的豬的生理學樣本或組織樣本，特別是損傷組織中分離出。4.根據權利要求3的豬環病毒製品，其從豬腎細胞系中產生並分離。5.根據權利要求4的豬環病毒製品，其從未經PCV汙染的PK/15細胞中產生並分離。6.—種培養物提取物或上清液，其收集自用根據權利要求1的環病毒感染的細胞之體外細胞培養物。7.—種抗原性製品，其收集自用根據權利要求1的環病毒感染的細胞之體外細胞培養物。8.—種疫苗，其包含根據權利要求7的抗原性製品，或根據權利要求6的培養物上清液或提取物，包含豬環病毒作為抗原。9.根據權利要求8的疫苗，其特徵在於疫苗包括在獸醫學可接受的載體或稀釋劑中的減毒活完整抗原，以及任選地獸醫學可接受的佐劑和任選地冷凍乾燥穩定劑。10.根據權利要求9的疫苗，其特徵在於抗原為滅活的，且疫苗還包含獸醫學可接受的載體或稀釋劑，以及任選地獸醫學可接受的佐劑。11.一種DNA片段，其含有選自SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDNO:4禾口SEQIDNO:6的序列。12.—種DNA片段，其含有選自0RF1-13的ORF。13.根據權利要求12的DNA片段，其特徵在於含有選自0RF4、0RF7、0RF10和0RF13的ORF。14.一種多肽，其由根據權利要求11-13中任一項的DNA片段編碼。15.—種體外表達載體，包括整合入其基因組中的根據權利要求11-13中任一項的DNA序列或片段，以使其可在體外表達。16.根據權利要求15的表達載體，其特徵在於其選自大腸桿菌和杆狀病毒。17.—種由根據權利要求15或16的表達載體產生的，任選地經純化的多肽。18.—種亞單位疫苗，包括在獸醫學可接受的載體或稀釋劑中的至少一種根據權利要求14或17的多肽，以及任選地獸醫學可接受的佐劑。19.一種體內表達載體，包括整合入其基因組中的根據權利要求11-13中任一項的DNA片段，以使其可在體內表達。20.根據權利要求19的表達載體，其特徵在於其選自能在豬中複製而不會使該動物致病的活病毒和質粒。21.根據權利要求20的表達載體，其特徵在於病毒載體選自豬皰疹病毒，如假狂犬病病毒；豬腺病毒；痘病毒，特別是痘苗病毒，禽痘病毒，金絲雀痘病毒和豬痘病毒。22.—種活體或質粒疫苗，其特徵在於其包括在獸醫學可接受的載體或稀釋劑中的一種根據權利要求19-21中任一項的表達載體。23.根據權利要求8-10、18和22中任一項的疫苗，其特徵在於其包含如權利要求1-4中定義的數種豬環病毒抗原。24.根據權利要求8-10、18、22和23中任一項的疫苗，其特徵在於還包含至少一種相應於另一種豬病原體的其它效價。25.根據權利要求24的疫苗，其特徵在於包含至少一種下列的其它效價PRRS、豬肺炎支原體、大葉性肺炎放線桿菌、大腸桿菌、萎縮性鼻炎、偽狂犬病、豬霍亂和豬流感。26.根據權利要求24的疫苗，其特徵在於包含至少一種選自PRRS和豬肺炎支原體的其它效價。27.—種探針或引物，其包含全部或部分根據權利要求11-13中任一項的序列。28.—種從根據權利要求1-5中任一項的環病毒、根據權利要求14或17的多肽或其片段製備的多克隆或單克隆抗體。29.—種檢測豬環病毒的方法，其中，在待測豬生理學液體或組織樣本中進行檢測，通過試圖檢測抗原本身或針對抗原的抗體進行抗原存在與否的測試。全文摘要本發明涉及新豬環病毒、疫苗及診斷試劑。具體而言，本發明涉及一種從肺或神經節樣本中分離的新型豬環病毒株，所述樣本獲自患有斷乳後多系統性消瘦綜合症(PMWS)的牲畜。本發明涉及這些毒株的純化製品、減毒疫苗或滅活疫苗、重組活體疫苗、質粒疫苗和亞單位疫苗，以及診斷試劑和診斷方法。本發明還涉及可用於在體外表達載體中製備亞單位疫苗的DNA片段，或者整合入病毒或質粒型體內表達載體中的序列。文檔編號A61K39/00GK101724606SQ20091025263公開日2010年6月9日申請日期1998年10月1日優先權日1997年10月3日發明者B·密罕,C·E·薩勒雷,D·海尼斯,E·克拉克,F·麥克內雷,G·E·薩普斯,G·阿蘭,J·哈丁,J·埃利斯,L·哈薩德申請人:梅瑞爾公司;貝爾法斯特皇后大學;薩斯喀徹溫大學