通過轉入抗病相關基因進行草魚,對蝦抗病育種的製作方法

2023-09-20 21:59:30 1

專利名稱：通過轉入抗病相關基因進行草魚,對蝦抗病育種的製作方法
技術領域：
本發明涉及將抗病基因如人α-幹擾素基因轉入魚、蝦體內，培育抗病的轉基因魚、蝦。本發明還涉及利用鯉魚β-肌動蛋白基因啟動子與人α-幹擾素基因構建成在魚、蝦體內表達的重組基因。
草魚是我國淡水養殖的四大家魚之一，年產量佔我國淡水魚產量的30％。由於草魚餌料來源廣泛且廉價，而且草魚肉質細嫩鮮美，廣受養殖戶和消費者歡迎。目前世界五大洲都有引種養殖。
草魚由於自身的生理特點，在苗種期易受病害的侵染，如草魚出血病、草魚腸炎和爛腮病等。其中草魚出血病為病毒性(草魚出血病毒GCHV)傳染疾病(毛樹堅等，1989)，危害最為嚴重，高發病期死亡率可達85％，給養殖業造成極大經濟損失。我國科學家經過十餘年的研究，提出了用疫苗防治的方法，由於水生生物接種疫苗效率低，因而難以普遍推廣應用。
對蝦是我國沿海海產養殖的重要生物，每年為國家創造數十億元的稅利，而對蝦的皮下及造血組織壞死杆狀病毒(HHNBV)及肝胰腺細小病毒樣病毒(Hepatopancreatic Parvo-like Virus，HPV)病也是危害極嚴重的暴發性流行疾病(陳世陽，1985)。因此，採用新方法和新技術的抗病育種異常迫切。
魚類基因工程近年來發展迅速，為基因工程進行魚類抗病育種提供了技術支持。轉生長激素基因魚已經在國內外取得了實際成效。Hew等(HSC RESDEV LP，et al.)利用魚抗凍蛋白基因啟動子構建成轉基因載體，用於外源基因如生長激素基因的轉移，並獲得了這一載體的專利；加拿大J.R.White等(小詹姆斯.R.懷特 比爾·波亥吉達克，1997)將人胰島素基因轉入魚體，用於人糖尿病的治療；日本山下伸(NIPPON SUISANKAISHA LTD.)則取得了電場轉移外源基因進入魚類卵細胞的方法專利。
本發明的目的在於針對魚、蝦等水生經濟動物病毒性疾病，通過轉入外源抗病基因，獲得轉基因個體來進行魚類抗病的基因工程及育種。本發明所採用的基因啟動子為鯉魚β-肌動蛋白基因啟動子，所採用的基因為抗病相關基因如人α-幹擾素基因，由此構建成能在魚體中表達的重組基因。
人α-幹擾素是人白細胞在病原侵染時產生的一種廣譜抗病毒蛋白，它通過啟動一系列抗病基因的表達，促使生物體細胞合成出多種對付病原的蛋白質而抑制病原繁殖，從而起到抗病的作用(侯雲德，1990)。本發明人採用草魚、對蝦體細胞離體培養並以幹擾素處理及接種病毒的實驗，研究了人α-幹擾素在魚、蝦細胞抗禦相關病毒中的作用。結果表明用一定濃度的人α-幹擾素，在病毒接種前1小時以上處理培養細胞，能使細胞免受接種病毒的侵噬。通過向魚體、蝦體注射一定量的人α-幹擾素再接種病毒的實驗，證明在接種病毒8小時以前將人α-幹擾素注入魚、蝦體內，能顯著提高其抗性，在病毒接種前48小時注入幹擾素，可使魚、蝦的成活率提高40％。這些研究證明人α-幹擾素可以顯著提高魚、蝦對相應病原的抗性。
當前，通過基因工程技術構建重組分子(基因)已經是一種常規化了的技術。同時採用通用的顯微注射法將外源分子注入受精卵細胞，在魚類轉基因操作中有明顯優勢(Chen，T.T.et al.，1990)。將抗病基因構建成能在魚體內表達的重組基因，轉入草魚、對蝦等水生經濟動物受精卵中，並選育出抗病新品種(系)，可望從根本上消除諸如草魚出血病、對蝦病毒病的危害，這是本發明的基本構思。


圖1給出了人α-幹擾素-鯉魚β-肌動蛋白基因啟動子重組質粒(pCI質粒)的結構。
圖2給出了pCI質粒的構建過程。
本發明提供了一種通過轉入抗病基因進行草魚、對蝦抗病育種的方法，該方法包括以下步驟1.重組基因構建本發明採用鯉魚β-肌動蛋白基因啟動子作為外源基因在受體中表達的啟動子，人α-幹擾素基因作為轉化的目的基因，通過重組構建成pCI重組質粒，並轉化進大腸桿菌中擴增，分離出擴增質粒後，以限制性內切酶Pvu II切下重組基因片段用於顯微注射的轉化(重組基因結構見附圖1) ；2.顯微注射轉化受體收取草魚、對蝦受精卵，在1-4胞期通過顯微操作儀將重組基因溶液注入細胞中的核區。
3.孵化注射外源基因的受精卵按常規方法進行孵化；草魚在環道流水孵化，對蝦在孵化池充氧孵化；4.轉基因個體的標記對轉基因個體進行編號標記；5.轉基因個體的檢測轉基因魚、蝦先進行病毒抗性篩選，即通過接種病毒的攻毒實驗，篩選出具有抗性的轉基因個體。抗性個體採血或剪取肌肉組織分離其DNA，進行分子檢測和基因表達水平測定。分子檢測的具體方法是以轉入基因內的特異序列合成一對引物，並用這一對引物對個體DNA樣品進行PCR擴增，擴增產物凝膠電泳分離後能觀察到特定的分子帶的個體即為轉基因個體。可通過採用Southern雜交的方法進一步予以確證。基因表達水平測定則以人α-幹擾素ELISA檢測試劑盒對血清進行定量分析。
6.轉基因魚、蝦形成品系轉基因個體的飼養按常規進行，性成熟後進行育種，形成轉基因魚、蝦品系。具體方法是轉基因魚與普通草魚雜交，從雜交後代F1中選擇轉基因的雌雄性個體作同胞間交配，從其後代中選擇出外源基因純合的個體。利用這一純合個體與普通草魚雜交，雜種一代用於養殖生產。對蝦的育種過程與草魚育種一致。
實施例1.草魚的轉基因抗病育種1.重組基因的構建鯉魚β-肌動蛋白基因啟動子克隆在通用的質粒載體pUC118中，在基因下遊有一多克隆位點，用限制性內切酶SmaI和EcoRI將質粒切開成一端為平末端而另一端為EcoRI粘端的新載體分子。人α-幹擾素基因cDNA克隆在通用載體pUC18中，可用PstI和EcoRI兩限制性內切酶切下，先用PstI切開質粒成線性分子，再用核酸酶S1對線性分子進行有限酶解以將PstI的粘端切平，然後用EcoRI從分子上切下0.9kb的α-幹擾素cDNA片段並經低熔點膠回收。
將新載體分子和回收的cDNA 0.9kb片段按1∶2分子比例混合，加入2個單位的T4 DNA連接酶，14℃連接16小時，轉化感受態大腸桿菌，在氨苄青黴素和X-gal培養基上篩選陽性菌落。
陽性菌落擴增培養後分離質粒，對質粒進行限制性酶切、Southern雜交、順序測定分析，確證獲得正確的重組基因。
以限制性內切酶PvuII，對大量質粒分子酶切，並回收4kb分子，作為顯微注射的基因分子(構建過程詳見附圖2)。
2.獲得草魚受精卵親本草魚人工注射催情激素，在約16小時後出現交尾現象，用紗網從交配池撈起剛產出的受精卵，置培養皿中在顯微鏡下觀察，選擇1-4胞期的受精卵進行顯微注射。
3.顯微注射轉化草魚受精卵按顯微注射的常規方法，在顯微鏡下利用顯微注射儀將5nl重組基因溶液約107-108分子注入受精卵細胞核中。
4.注射後的孵化注射後受精卵按常規草魚孵化，即置於孵化池流水孵化。受精16小時後魚花孵出，三天後出孵化池置發花池常規飼養。
5.轉基因草魚飼養按普通草魚飼養。
6.攻毒實驗轉基因草魚長至4月齡長約15-20cm，接種3.5倍半數致死量的草魚出血病毒，篩選抗性草魚。
7.PCR檢測從抗性魚尾動脈取血1ml，離心將血細胞和血清分離，從血細胞中按常規方法分離DNA，用於PCR檢測。針對轉入基因的順序，設計一對25個鹼基的特異引物，引物Tm為45℃，50ngDNA、5ppm引物、1.5mMMg+2、94℃變性5分鐘、94℃變性1分鐘→54℃復性30秒→72℃延伸45秒，30次循環擴增。抗性魚80％有特異擴增帶。
8.ELISA檢測人α-幹擾素ELISA檢測試劑盒購於邦定生物醫學公司(BiotingeBiomedicine Co.)，檢測使用按生產商說明進行，顯色後在酶標儀中測定吸光度並對照標準曲線，了解測定樣品中α-幹擾素的濃度。
9.轉基因魚育種形成品種(系)適效表達外源基因的轉基因個體，常規飼養約四年至性成熟，即可進行常規育種。具體方法是轉基因魚與普通草魚雜交，從雜交後代F1中選擇轉基因的雌雄性個體作同胞間交配，從其後代中選擇出外源基因純合的個體。利用這一純合個體與普通草魚雜交，雜種一代用於養殖生產。
實施例2.對蝦的轉基因抗病育種1.重組基因的構建重組基因構建同實施例1。
2.獲得對蝦受精卵對蝦親本置於暗房內交配，用流水衝洗受精卵，在顯微鏡下挑選出1-4胞期前的受精卵用於顯微注射。
3.顯微注射轉化受精卵顯微操作同實施例1。
4.注射後的孵化顯微注射後的受精卵置孵化池，以充氧泵充氧孵化。
5.轉基因蝦的飼養按常規飼養方法飼養。
6.攻毒實驗人工餵毒感染對蝦。具體方法是以感染相應病毒病致死的對蝦，去頭部、尾部甲殼及附屬物，取頭胸部切碎作為病料，在23～28℃充氣海水30L槽中飼餵體長長至2～3cm的轉基因對蝦，每槽10尾，投病料1.0g。5天後仍存活的對蝦作檢測分析。
7.PCR檢測PCR檢測同實施例1，但從肌肉組織中分離DNA。具體方法是從抗性對蝦腹下剪取小團肌肉(約10mg)，按肌肉細胞DNA分離的常規方法分離DNA，以人α-幹擾素基因內特異序列的引物對其進行PCR擴增。PCR陽性抗病個體用於雜交育種。
8.轉基因抗病對蝦育種PCR陽性個體與普通對蝦雜交，從F1代中篩選抗病個體，並進行PCR檢測，抗病同時為PCR陽性的雄性個體與雌性個體交配，獲得F2代。從F2代中可選出轉基因純合的個體，用於雜交育種的親本，與普通對蝦雜交，雜種一代用於生產。
本發明主要參考文獻有毛樹堅等，1989，草魚出血病的病原研究，水產學報，13(1)1～4。
陳世陽，1985，對蝦的病毒性疾病，國外水產，(4)41～43。
侯雲德，1990，分子病毒學，北京學苑出版社.
小詹姆斯.R.懷特比爾.波亥吉達克，1997，治療糖尿病的轉基因魚，中國專利
發明者章懷雲, 張學文, 符少輝 申請人:章懷雲