一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG及其製備的製作方法

2023-09-20 06:26:00

專利名稱：一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG及其製備的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，具體涉及一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒 pElrLCG及其製備方法。
背景技術：
現有的可以用來拯救植物胚胎致死突變的誘導型載體有(1)四環素誘導型載體(2)
糖皮質激素誘導型載體(3)雌激素誘導型載體(4)酒精誘導型(5)蛻皮(Ecdysone)激 素誘導型載體(6)銅誘導型載體等。四環素誘導性載體的使用對環境存在潛在的危險， 另外細胞核中必須存在大量四環素才能起作用，而高濃度的四環素是有毒的；雌激素誘導 型載體的缺點是局部誘導性強，雌激素在植物體內不易擴散，所以不能對植物進行整株 誘導；蛻皮激素誘導型載體主要的缺點是葉片對蛻皮激素吸收差；而酒精誘導型載體對 植物有毒害作用，另外酒精易揮發；銅誘導型表達載體的缺點是銅只能在部分細胞起作 用，對植物有毒害作用；糖皮質激素誘導型表達載體的誘導化學物質地塞米松，可以高 效地被運輸到植物的各個組織器官而且對植物無毒害作用，這正是本載體的優點。本載體 將GR-Cre重組酶片段構建在兩個同向loxP重組位點之間，這兩個loxP位於T-DNA之上， 目前的報導大部分都是將Cre重組酶片段和loxP位點分別構建在兩個Ti質粒的T-DNA上， 轉基因植株通過雜交實現重組。如果將GR-Cre重組酶片段和loxP位點同時構建在同一個 載體上，那麼可以人為控制重組的發生和終止，這樣既可以節省時間也可以減少工作量。 Cre重組酶是38道爾頓的DNA特異位點重組酶，是從噬菌體Pl分離出來的，loxP (locus of crossover in Pl)最早在噬菌體P1的基因組裡發現的，loxP位點具有34個鹼基，在兩端 有13個反向重複的鹼基，中間核心序列是8個非迴文結構的鹼基，它決定了loxP位點的 極性，Cre重組酶分別結合在loxP位點的兩端，在中間核心序列區將loxP切開(見圖3)。
如果兩個loxP位點是同向的，那麼在重組酶的作用下將兩個loxP切開從而產生4個 粘性末端，兩個loxP位點之間的序列通過兩端的粘性末端自我連接成環，從基因組裡游離 出來丟失掉(見圖4)。
由於Cre重組酶只能在細胞核內起作用，Cre連上GR後，GR-Cre在沒有施加地塞米 松時，GR結合在內質網上，這時GR-Cre只存在於細胞質中，因此不能使Loxp位點發生 重組；噴施地塞米松時，地塞米松與GR結合使得GR-Cre從內質網上釋放出來，Cre重組酶進入核內，結合到Loxp位點上引發重組。在Loxp位點之間還含有一個Gateway cassette 和多克隆位點(MCS)， Gateway克隆技術的優點是不受酶切位點的限制，本載體的Gateway cassette含有attRl和attR2兩個重組位點，可以通過LR反應克隆不同的啟動子，多克隆位 點位於Gateway cassette的後面，可以將目的基因克隆到多克隆位點(MCS)上。

發明內容
本發明的目的在於提供一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG及其製備 的方法。讓胚胎致死突變體在胚胎時期不致死，從而可以研究胚胎致死突變體後期的發育 狀況，同時又可以在渡過胚胎時期後的任意一個時期，在地塞米松誘導下Cre重組酶入核 引發loxP位點重組，將兩個loxP位點之間基因從植物基因組裡敲除掉。
本發明的目的是通過以下方式實現的。
一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG是由原始載體pJawohl8-RNAi用 Xhol-Spel雙酶切消化回收的5.211kb長的載體片段與合成片段Xhol—loxP—Nhel—Ncol —Nos—BsiwI—Kpn1—StuI—BgIII—Mfel—AatII— lxMyc—loxP—Spel連接而成。在所述 的合成片段的Nhel和Ncol酶切位點之間接入了 GR—Cre片段，在所述的合成片段的Bsiwl 和Kpnl酶切位點之間接入了 Gateway cassette片段。
所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG的製備方法是將原始載體 pJawohl8-RNAi用Xhol-Spel雙酶切消化回收的5.21 lkb長的載體片段與合成片段Xhol— loxP—Nhel—Ncol—Nos—Bsiwl—Kpnl—Stul_BgIII—Mfel—AatII_ lxMyc—loxP—Spel 連接構建質粒載體pElrL，然後在合成片段的Nhel和Ncol酶切位點之間接入GR—Cre片 段構建質粒載體pElrLC，最後在合成片段的Bsiwl和Kpnl酶切位點之間接入Gateway cassette片段構建所述的質粒載體pElrLCG。
所述的質粒載體pElrL的構建過程為Xhol-Spel雙酶切載體pUC57-loxP消化，回收 得到合成片段Xhol—loxP—Nhel—Ncol—Nos—Bsiwl—Kpnl—Stul—BgIII _ Mfel—AatII —lxMyc—loxP—Spel，然後合成片段與經Xhol-Spel雙酶切載體pJawohl8-RNAi消化回 收後的5.211kb的片段連接即成。
所述的質粒載體pElrLC的製備過程為用正向引物:CGGGCTAGCATGTCCAATTTAC TGACCGTACAC和反向引物CGGCCATGGTCATTTTTGATGAAACAGAAGCTT以質粒 pCre為模板PCR擴增GR-Cre片段，然後用Nhel—Ncol酶分別將擴增出的GR-Cre片段 和質粒pEkL進行雙酶切，最後將酶切後的GR-Cre片段與酶切後的pElrL質粒長片段連接 即成。所述的pElrLCG質粒載體的製備過程為用正向引物CGGCGTACGACAAGTTTG TACAAAAAAGCTGAACG和反向引物CGGGGTACCACCACTTTGTACAAGAAAG CT GAA以質粒載體pJawohl8-RNAi為模板PCR擴增Gateway cassette片段，然後用Bsiwl 酶在55"C分別對Gateway cassette片段和質粒pElrLC進行酶切，再用Kpnl酶在37"C分別 對Bsiwl酶切過的Gateway cassette片段和pElrLC酶切回收產物進行酶切，最後用T4連接 酶將酶切過的Gateway cassette片段與酶切過的pElrLC質粒載體長片段連接即成。
所述的Gateway cassette片段含有attRl attR2。
該載體的優點是
1) 本載體既可以使用Gateway克隆技術，也可以使用常規酶切連接克隆技術。 Gateway克隆技術優點不受限制性內切酶的限制，它是通過同源重組來實現克隆而
不是酶切和連接，Gateway cassette (attRl attR2)是用來克隆各種不同的啟動子，便於轉 入的基因的啟動表達。多克隆位點是用來克隆導致胚胎致死突變的基因。
2) GR-Cre重組酶表達後，其蛋白不在核內而是通過GR結合在細胞質內質網上，這樣 就可以通過是否施加地塞米松來控制Cre的入核，從而控制何時把轉入的基因從基因組裡 敲除掉，利用這種工具就可以得到胚胎致死突變體的純合體，可以隨時研究致突變體純合 體後期發育的情況，同時開發胚胎致死突變體潛在的特殊生物性狀。
3) 本載體在雜交育種也有很大的潛力，比如花粉不育的性狀優良的母本，利用該載體 就可得到花粉可育(轉基因)和花粉不育(轉入的基因環出丟失)的植株，這樣花粉可育 的植株可以用來繁殖種子，而花粉不育的植株就可以用作雜交育種的母本。
4) 在C末端的Myc標籤可以檢測轉入的基因是否表達及其表達量，同時在把轉入的基 因在Cre的作用下從基因組中環出而丟失後，為檢測轉入的基因在蛋白水平是否存在及存 在的時間提供方便。
5) 本載體在施加地塞米松誘導Cre入核引發loxP位點重組，loxP位點之間的DNA 片段從基因組裡環出，環出的DNA片段包含了GR-Cre以及轉入的基因。由於GR-Cre已 經沒有35S啟動子不能正常啟動表達，而目的基因這時也沒有了3，末端加尾信號，從而不 能形成mRNA，導致GR-Cre以及目的基因不能正常表達，所以只要Cre引發重組，GR-Cre 及目的基因的轉錄就終止了。
6) GR作為糖皮質激素受體已經廣泛被用於轉基因以及基因功能研究，地塞米松作為 誘導化學物質對植物無毒害作用，同是時它能對植物整株起作用而不是部分細胞。


圖1為本發明質粒載體pElrLCG合成的流程圖； 圖2為本發明質粒載體pElrLCG的主要部分的結構圖； 圖3為Cre重組酶將loxP位點切開示意圖； 圖4為Cre重組酶作用示意圖。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步說明，而不是對本發明的限制。 實施例1
1、用XhoI-Spel雙酶切消化pJawohl8-RNAi載體(由中國農科院傅永福研究員提供) 回收5.21 lkb長的載體片段，合成463bp的XhoI-Loxp-NheI-NcoI-Nos-BsiwI-KpnI-StuI-BgIII -MfeI-AatII-lxMyc-Loxp-SpeI片段，上海生工合成，序列如下
GCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGG
GTTATGGCGCCACTAGT
該合成片段位於載體pUC57 (從上海生工購買)上的Smal位點即pUC57-loxP，由於 該合成片段只能以連接在載體pUC57上的形式保存，因此pUC57-loxP也用Xhol-Spel雙 酶切消化，分別回收後將5,211kb的片段和合成片段連接構建好質粒pElrL。
2、 用正向引物CGGGCTAGCATGTCCAATTTACTGACCGTACAC和反向引物 CGGCCATGGTCATTTTTGATGAAACAGAAGCTT以質粒pCre(由美國加州大學洛杉磯分 校林辰濤教授提供)為模板PCR擴增GR-Cre並回收PCR產物，用Nhel和Ncol酶分別將 GR-Cre PCR回收產物和質粒pElrL進行雙酶切，然後將GR-Cre片段連接到pElrL質粒的 Nhel和Ncol酶切位點之間，這樣GR-Cre片段就位於2x35S啟動子控制之下，從而構建成 pElrLC質粒。
3、 用正向引物CGGCGTACGACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACG和反向引物 CGGGGTACCACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAA以質粒pJawohl8-RNAi為模板PCR擴增Gateway cassette (含attRl attR2)，首先用BsiwI酶在55。C下對Gateway cassette PCR 回收產物和質粒pElrLC進行酶切，再用Kpnl酶在37。C對Gateway cassette和pElrLC酶切 回收產物進行酶切，用T4連接酶將Gateway cassette (含attRl attR2)片段連接到pElrLC 載體的BsiwI和Kpnl酶切位點之間，構建成pElrLCG質粒，見圖1 。
權利要求
1、一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG，其特徵在於，所述的載體pElrLCG是由原始載體pJawoh18-RNAi用XhoI-SpeI雙酶切消化回收的5.211kb長的載體片段與合成片段XhoI—loxP—NheI—NcoI—Nos—BsiwI—KpnI—StuI—BgIII—MfeI—AatII—1xMyc—loxP—SpeI連接而成，在所述的合成片段的NheI和NcoI酶切位點之間接入了GR—Cre片段，在所述的合成片段的BsiwI和KpnI酶切位點之間接入了Gatewaycassette片段。
2、 權利要求1所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG的製備方法，其 特徵在於，將原始載體pJawohl8-RNAi用Xhol-Spel雙酶切消化回收的5.211kb長的載體 片段與合成片段Xhol — loxP — Nhel — Ncol — Nos — Bsiwl — Kpnl — Stul — BgIII — Mfel — AatII— lxMyc—loxP—Spel連接構建質粒載體pElrL，然後在合成片段的Nhel和Ncol酶 切位點之間接入GR—Cre片段構建質粒載體pElrLC，最後在合成片段的Bsiwl和Kpnl酶 切位點之間接入Gateway cassette片段構建所述的質粒載體pElrLCG。
3、 根據權利要求2所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG的製備方法， 其特徵在於，所述的質粒載體pElrL的構建過程為Xhol-Spel雙酶切載體pUC57-loxP消 化，回收得到合成片段XhoI—loxP—Nhel—NcoI-Nos—Bsiw1—Kpnl —Stul—BgIII—MfeI —Aatll—lxMyc—loxP—SpeI，然後合成片段與經Xhol-Spel雙酶切載體pJawohl8-RNAi 消化回收後的5.211kb的片段連接即成。
4、 根據權利要求2或3所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG的製備 方法，其特徵在於，所述的質粒載體pElrLC的製備過程為用正向引物CGGGCTAGCATG TCCAATTTACTGACCGTACAC禾口反向弓l物CGGCCATGGTCATTTTTGATGAAACAGA AGCTT以質粒pCre為模板PCR擴增GR-Cre片段，然後用NheI—NcoI酶分別將擴增出 的GR-Cre片段和質粒pElrL進行雙酶切，最後將酶切後的GR-Cre片段與酶切後的pElrL 質粒長片段連接即成。
5、 根據權利要求4所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG的製備方法， 其特徵在於，所述的pElrLCG質粒載體的製備過程為用正向引物:CGGCGTACGACAAGT TTGTACAAAAAAGCTGAACG和反向引物CGGGGTACCACCACTTTGTACAAGAAAG CTGAA以質粒載體pJawohl8-RNAi為模板PCR擴增Gateway cassette片段，然後用Bsiwl 酶在55'C分別對Gateway cassette片段和質粒pElrLC進行酶切，再用Kpnl酶在37'C分別對Bsiwl酶切過的Gateway cassette片段和pElrLC酶切回收產物進行酶切，最後用丁4連接 酶將酶切過的Gateway cassette片段與酶切過的pElrLC質粒載體長片段連接即成。
6、根據權利要求5所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG的製備方法， 其特徵在於，所述的Gateway cassette片段含有attRl attR2。
全文摘要
本發明公開了一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG及其製備方法。將原始載體pJawoh18-RNAi酶切回收的5.211kb長的載體片段與合成的XhoI-loxP-NheI-NcoI-Nos-BsiwI-KpnI-StuI-BgIII-MfeI-AatII-1xMyc-loxP-SpeI片段連接，然後在兩個loxP位點之間接入GR-Cre、Gateway cassette片段，構建成新型質粒載體pElrLCG。利用該載體既可以得到胚胎致死突變體的純合體，也可以用來研究致死突變體純合體後期發育的情況，對於研究胚胎致死突變，雜交育種及胚胎致死突變體的特殊生物性狀具有重大意義。
文檔編號C12N15/84GK101544989SQ20091004283
公開日2009年9月30日 申請日期2009年3月11日 優先權日2009年3月11日
發明者萍 劉, 劉選明, 林辰濤, 王宏歸 申請人:湖南大學