靶向小膠質細胞的tlr4複合物及其製備方法和應用的製作方法

2023-08-22 08:07:31

靶向小膠質細胞的tlr4複合物及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種靶向小膠質細胞的TLR4複合物及其製備方法和在製藥領域中的應用，屬於生物醫藥領域。該複合物由Q9肽（QQQKKKKKK）和T9肽（LTQQVVMKF）的融合肽與TLR4RNAi通過靜電作用結合而成，該複合物可利用Q9肽的導向作用，特異靶向小膠質細胞表面特異性CX3CR1受體，在T9肽與CX3CR1受體作用的同時，TLR4RNAi高效轉染入小膠質細胞，抑制小膠質細胞的活化，進而抑制由小膠質細胞介導的腦出血後的炎症反應，可用於製備治療由小膠質細胞介導的抗炎藥物，在腦出血的治療領域有著良好的開發應用前景。
【專利說明】靶向小膠質細胞的TLR4複合物及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物醫藥領域，涉及一種多肽-基因複合物，具體涉及一種靶向小膠質細胞的TLR4複合物及其製備方法和在製藥領域中的應用。
【背景技術】
[0002]腦出血是一種常見的神經系統危重症，因其高發病率，高致殘率，高死亡率而受到廣泛關注。隨著人民生活水平的提高及老齡化的到來，腦出血發病率也呈上升趨勢。大量研究表明，腦出血後存在明顯的炎症反應，炎症反應參與了腦出血後繼發性腦水腫和腦損害等病理過程。ICH後血腫周圍小膠質細胞等炎性細胞激活，釋放TNF-α、IL-1等致炎因子，加之血腦屏障破壞，外周血單核巨噬細胞等炎症細胞向血腫周邊區聚集，由此誘發炎症級聯放大反應，最終導致繼發性腦損傷和神經功能缺損加劇。
[0003]Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是一類介導天然免疫的古老受體,通過識別外源性配體(PAMPs，如細菌、真菌、病毒等)和內源性配體(DMAPs，機體損傷相關分子)，並通過下遊的接頭信號分子MyD88或TRIF活化，導致NF- κ B的激活，產生大量的炎症因子，在天然免疫中具有重要作用。大量研究發現腦出血後由血腫成分血紅蛋白(Hb)及代謝產物血紅素(Heme)通過作用於小膠質細胞TLR4受體，繼之通過下遊信號分子MyD88或TRIF活化，導致NF-κ B的激活，產生大量諸如IL-UTNF-a、IL_6的炎症因子，產生炎症損傷，最終導致ICH繼發性神經功能缺損加重。因此，如果能發現通過TLR4靶向抑制小膠質細胞的藥物，將會為腦出血的炎症損傷帶來新的治療策略。
[0004]CX3C趨化因子受體I (CX3CR1)在中樞神經系統中主要在小膠質細胞上表達，其特異性配體CX3CL1屬於CX3C家族的δ類趨化因子，主要由神經元分泌。CX3CL1通過CX3CR1受體可促進小膠質細胞的趨化、增殖、存活，細胞內鈣水平的升高以及細胞因子和金屬蛋白酶的分泌，這些反應能被抗CX3CR1抗體阻止。因此，如果能夠有效幹擾CX3CR1受體的表達，則理論上可以抑制小膠質細胞的活化，進而抑制由小膠質細胞介導的神經系統疾病的發生或惡化。
[0005]RNA幹擾(RNA interference, RNAi)是大多數真核生物體內一種調控基因表達的方式，主要通過小幹擾RNA (Small interfering RNA, siRNA)特異性地沉默靶基因的表達，具有高效性、特異性等優點，已被廣泛應用於基因功能、細胞信號轉導通路、藥物靶點篩選、基因治療等研究領域。因此，可以利用RNAi技術幹擾CX3CR1受體的表達。但RNAi技術也面臨一個關鍵問題，就是如何將siRNA有效地傳遞進入靶細胞。由於siRNA容易被核酸酶降解且真核細胞不易攝取外源性的裸露核酸，直接用siRNA轉染細胞效率低下，因此，必須選擇適當的載體包裹siRNA，以免siRNA降解並且能夠輔助siRNA轉染細胞。
[0006]US28是人類巨細胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)編碼的四個七次跨膜趨化因子受體之一，具有廣譜趨化因子結合活性，在結構上與人源CX3CR1受體的同源性最高。研究發現，來源於US28受體N末端的誘惑配體多肽T9可以阻斷人源CX3CR1受體結合生理性趨化因子形成的趨化作用，但其本身不引起趨化運動，不影響胞內信號轉導和細胞自然活性；其能夠引起細胞表面受體CX3CR1內化，但內化的受體部分能夠再循環到細胞表面，對人源CX3CR1受體的生理功能沒有明顯影響。

【發明內容】

[0007]有鑑於此，本發明的目的之一在於提供一種TLR4複合物，該複合物可以特異靶向小膠質細胞，抑制小膠質細胞的活化，進而抑制由小膠質細胞介導的中樞神經系統疾病的發生或惡化。
[0008]為達到上述目的，本發明提供如下技術方案:
靶向小膠質細胞的TLR4複合物，由Q9肽和T9肽的融合肽與TLR4通過靜電作用結合而成，所述Q9肽的胺基酸序列為QQQKKKKKK，所述T9肽的胺基酸序列為LTQQVVMKF。 [0009]進一步，所述Q9肽和T9肽的融合肽由Q9肽的羧基端和T9肽的氨基端直接連接--? 。
[0010]本發明的另一個目的在於提供所述靶向小膠質細胞的TLR4複合物的製備方法，是在渦旋條件下，向含有TLR4 RNAi和氯化鈉的水溶液中滴加Q9肽和T9肽的融合肽溶液，滴畢，繼續渦旋30-60分鐘，再靜置30-60分鐘，即得靶向小膠質細胞的TLR4複合物。
[0011]進一步，所述TLR4 RNAi與Q9肽和T9肽的融合肽的質量比為1:1。
[0012]進一步，所述靶向小膠質細胞的TLR4複合物的製備方法是在渦旋條件下，向含有濃度為200 μ g/mL的TLR4 RNAi和濃度為lmg/mL的氯化鈉的水溶液中，滴加等體積濃度為200 μ g/mL的Q9肽和T9肽的融合肽溶液，滴加完畢後，繼續渦旋30分鐘，再靜置30分鐘，即得靶向小膠質細胞的TLR4複合物。
[0013]本發明還提供了所述靶向小膠質細胞的TLR4複合物在製備治療由小膠質細胞介導的中樞神經系統疾病的藥物中的應用。
[0014]進一步，所述靶向小膠質細胞的TLR4複合物在製備治療腦出血的藥物中的應用。
[0015]本發明的有益效果在於:Q9肽為帶正電荷的短肽，可通過電性中和作用與帶負電荷的TLR4 RNAi聚合形成緻密顆粒，提高細胞對TLR4 RNAi的攝取率，增強轉染效率。CX3CR1受體在中樞神經系統中主要在小膠質細胞上表達，來源於US28受體N末端的誘惑配體多肽T9可以阻斷人源CX3CR1受體結合生理性趨化因子形成的趨化作用，但其本身不引起趨化運動，不影響胞內信號轉導和細胞自然活性。本發明所述TLR4複合物可通過T9肽的導向作用，特異靶向小膠質細胞表面特異性CX3CR1受體，在T9肽與CX3CR1受體作用的同時，TLR4 RNAi高效轉染入小膠質細胞，抑制小膠質細胞的活化，進而抑制由小膠質細胞介導的中樞神經系統炎症的發生或惡化，可用於製備治療由小膠質細胞介導的中樞神經系統炎症的藥物，在腦出血治療領域有著良好的開發應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為透射電鏡鑑定TLR4複合物。
[0017]圖2為TLR4複合物轉染的小膠質細胞活化後細胞因子的分泌水平。
[0018]圖3為TLR4複合物轉染的小膠質細胞的遷移能力。
[0019]圖4為TLR4複合物轉染的腦出血小鼠腦組織含水量。
[0020]圖5為TLR4複合物轉染的腦出血小鼠的神經功能學評分。【具體實施方式】
[0021]為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
[0022]一、靶向小膠質細胞的TLR4複合物的製備 1、Q9肽和T9肽的融合肽Q9-T9的製備 融合肽Q9-T9由Q9肽的羧基端與T9肽的氨基端直接連接而成，胺基酸序列為QQQKKKKKK LTQQVVMKF。融合肽Q9-T9的合成在AB-431A型多肽合成儀上進行，採用標準Fmoc方案。以0.25mmol對羥甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)樹脂為起始樹脂，按照融合肽Q9-T9的胺基酸序列，使肽鏈自羧基端向氨基端逐個延伸，肽鏈合成完畢後，將含有肽鏈的樹脂轉移至切割液(由酒石酸乙二胺0.25mL、三氟乙酸9.5mL和去離子水0.25mL組成)中，室溫下攪拌反應使肽鏈從樹脂上裂解下來，然後用G6玻砂漏鬥過濾，收集濾液，室溫下低壓蒸乾，殘餘物用去離子水溶解後，用AeKTA explorer 100型中壓液相色譜儀進行純化，色譜柱為C18柱,流動相A為質量分數為0.1%的三氟乙酸水溶液,流動相B為質量分數為
0.1%的三氟乙酸乙腈溶液，二元線性梯度洗脫，流動相B的體積分數在0-15分鐘內由10%上升至50%，流速為lmL/min，收集融合肽Q9-T9的洗脫液，冷凍乾燥，即得融合肽Q9-T9，用去離子水溶解製成濃度為3mg/mL的溶液，用孔徑為0.20 μ m的微孔濾膜過濾除菌，_70°C凍存備用。
[0023]取融合肽Q9-T9的洗脫液，用Delta 600型反相高壓液相色譜儀進行純度鑑定，色譜柱為Symmetry C18柱，流動相A為質量分數為0.1%的三氟乙酸水溶液，流動相B為質量分數為0.1%的三氟乙酸乙腈溶液，二元線性梯度洗脫，流動相B的體積分數在0-15分鐘內由10%上升至60%，流速為lmL/min。結果經峰面積歸一化法計算，融合肽Q9-T9的純度為98%。另取融合肽Q9-T9的洗脫液，用API 2000 LC/MS/MS型質譜儀進行分子量鑑定，結果顯示，融合肽Q9-T9的分子量實測值與理論值相符。
[0024]2、TLR4複合物的製備
TLR4RNAi的核苷酸序列為:5』 -ACGUGCACUUGUGGGUCCA-3』。於室溫、渦旋條件下，向100 μ L含有濃度為500 μ g/mL的TLR4和濃度為lmg/mL的NaCl的水溶液中，滴加100 μ L濃度為500 μ g/mL的融合肽Q9-T9溶液，滴加速度為5 μ L/min，滴加完畢後，於室溫下繼續渦旋30分鐘，再靜置30分鐘，即得TLR4複合物。
[0025]將新鮮製備的TLR4複合物滴於200目銅網上，吸附3分鐘，用吸水紙吸乾，晾乾30秒，以質量分數為1%的醋酸鈾水溶液負染30秒，用吸水紙吸乾，晾乾30秒，SOkV透射電鏡觀察。結果如圖1所示，所得TLR4複合物呈大小均一的近圓形顆粒，絕大多數顆粒長徑小於 25nm。
[0026]同時，按照上述相同方法，以陰性對照OVA RNAi (5』 -ACUUGUGGACGUGCGUCCA-3』)替代TLR4RNAi，製得陰性對照複合物。
[0027]二、靶向小膠質細胞的TLR4複合物的活性測試
1、TLR4複合物轉染小膠質細胞將小膠質細胞BV-2於6孔板內單層培養至覆蓋面積約30%，換入無血清DMEM培養基2mL，並加入TLR4複合物100 μ L，培養4小時，再換入完全DMEM培養基2mL，培養48小時，收集細胞，用PBS洗滌並重懸，獲得TLR4複合物轉染的小膠質細胞。
[0028]同時，按照上述相同方法，採用陰性對照複合物，獲得陰性對照複合物轉染的小膠質細胞。
[0029]另外，分別將TLR4複合物和陰性對照複合物轉染少突膠質細胞HO，作為無關細胞對照。
[0030]2、ELISA檢測TLR4複合物轉染的小膠質細胞活化後細胞因子的分泌水平
設置空白組(正常小膠質細胞BV-2)、對照組(陰性對照複合物轉染的小膠質細胞)和實驗組(TLR4複合物轉染的小膠質細胞)。取各組細胞，以4X IO5/孔種植於24孔板中，向細胞培養液中加入紅細胞裂解產物至終濃度為10μ g/mL，刺激24小時，之後棄去含紅細胞裂解產物的細胞培養液並洗滌細胞2次，再加入DMEM培養基lmL，繼續培養24小時，吸取細胞培養液，用ELISA試劑盒測定白細胞介素-1 β (IL-Ιβ )和腫瘤壞死因子α (TNF-α)的含量。結果如圖2所示，TLR4複合物可以明顯降低紅細胞裂解產物活化的小膠質細胞分泌細胞因子IL-1 β和TNF-a的水平。
[0031]3、用劃痕實驗檢測TLR4複合物轉染的小膠質細胞的遷移能力
設置空白組(正常小膠質細胞BV-2)、對照組(陰性對照複合物轉染的小膠質細胞)和實驗組(TLR4複合物轉染的小膠質細胞)。先用marker筆在6孔板背後，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔0.5-lcm—道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。在空中加入約5X105個細胞，向細胞培養液中加入紅細胞裂解產物至終濃度為10μ g/mL，刺激24小時，之後棄去含紅細胞裂解產物的細胞培養液並洗滌細胞2次，再加入DMEM培養基lmL，具體數量因細胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿。第二天用槍頭比著直尺，儘量垂至於背後的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。放入37度5%co2培養箱，培養。按24小時取樣觀察0.4mm2內的細胞個數。結果如圖3所示，TLR4複合物可以明顯降低紅細胞裂解產物活化的小膠質細胞的遷移能力。
[0032]4.乾濕重法測量TLR4複合物轉染的腦出血小鼠腦組織含水量
將各組小鼠於大腦的基底節注射30 μ L的全血。I小時候，在血腫周圍再次注射5 μ LTLR4複合物及對照。術後24h快速處死小鼠。取出小鼠大腦，沿正中線對半切開。取出受損處大腦半球，迅速稱重，記錄。將大腦半球放入100°C烘烤24h至恆重，稱重，記錄。計算含水量，公式為:大腦組織含水量百分比=(溼重-乾重)/溼重X100%。結果如圖4所示，TLR4複合物可以明顯降低腦出血後的腦水腫。
[0033]5、TLR4複合物轉染的腦出血小鼠的神經功能學評分
將 各組小鼠於大腦的基底節注射30 μ L的全血。I小時候，在血腫周圍再次注射5 μ LTLR4複合物及對照。3天後，根據Garcia法對小鼠的神經功能進行評分。具體指標為:1.自主運動2.四肢活動對稱性3.前肢的對稱性4.爬籠壁5.推軀幹反應6.觸鬚對刺激反應。在上述指標中，無活動或反應分；少許活動:1分；反應較差:2分；正常活動:3分。分別由2人同時對各組進行測定。如圖5所示，TLR4複合物可以明提高腦出血後的神經功能。
[0034]最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和 範圍。
【權利要求】
1.靶向小膠質細胞的TLR4複合物，其特徵在於，由Q9肽和T9肽的融合肽與TLR4RNAi通過靜電作用結合而成，所述Q9肽的胺基酸序列為QQQKKKKKK，所述T9肽的胺基酸序列為LTQQVVMKFo
2.根據權利要求1所述的靶向小膠質細胞的TLR4複合物，其特徵在於，所述Q9肽和T9肽的融合肽由Q9肽的羧基端和T9肽的氨基端直接連接而成。
3.權利要求1或2所述的靶向小膠質細胞的TLR4複合物的製備方法，其特徵在於，在渦旋條件下，向含有TLR4 RNAi和氯化鈉的水溶液中滴加Q9肽和T9肽的融合肽溶液，滴畢，繼續渦旋30-60分鐘，再靜置30-60分鐘，即得靶向小膠質細胞的TLR4複合物。
4.根據權利要求3所述的靶向小膠質細胞的TLR4複合物的製備方法，其特徵在於，所述TLR4 RNAi與Q9肽和T9肽的融合肽的質量比為1:1。
5.根據權利要求4所述的靶向小膠質細胞的TLR4複合物的製備方法，其特徵在於，在渦旋條件下，向含有濃度為100 μ g/mL的TLR4 RNAi和濃度為lmg/mL的氯化鈉的水溶液中，滴加等體積濃度為200 μ g/mL的Q9肽和T9肽的融合肽溶液，滴加完畢後，繼續渦旋30分鐘，再靜置30分鐘，即得靶向小膠質細胞的TLR4複合物。
6.權利要求1或2所述的靶向小膠質細胞的TLR4複合物在製備治療由小膠質細胞介導的中樞神經系統疾病的藥物中的應用。
7.根據權利要求6所述的靶向小膠質細胞的TLR4複合物的應用，其特徵在於:所述靶向小膠質細胞的TLR4複合物在製備治療腦出血的藥物中的應用。
【文檔編號】A61K48/00GK103933580SQ201410176829
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月29日 優先權日:2014年4月29日
【發明者】袁邦清, 楊曌, 沈漢超, 吳賢群, 陳羽建, 林立 申請人:中國人民解放軍南京軍區福州總醫院四七六醫院