動物生長促進劑的製作方法
2023-09-18 12:59:05 1
專利名稱:動物生長促進劑的製作方法
本發明涉及在體內促進動物生長，更具體地講，是關於一種生長促進劑，其生產方法以及增進動物生長的方法。
過去，通過在動物飼料中加入分解代謝的甾族物質，如雌激素已經獲得了在動物，特別是家畜中的生長促進作用。最近，已開始不贊成這種做法了，不受歡迎之處在於大量甾類化合物堆積在動物組織中。結果產生不良影響，如引起食用餵以大量雌激素的小雞的女孩胸部發育。
另一種普遍的做法是將抗生素摻入動物飼料。這有助於控制機會細菌感染，使牲畜自始至終保持良好的健康狀況，隨之發生體重增加。這種做法已經受到衛生部門的密切監視，並且由於促進抗生素抗性微生物菌株的生產而遭到反對。由於用作飼料添加劑的抗生素通常被建議治療人類疾病，所以是特別值得關注的。
已進一步提出的建議是用各種消化酶作為飼料添加劑促進動物生長。這些酶有助於在腸內使粗飼料分解，從而使從定量給定的食物中得到的營養物的量增加，超過在正常消化條件下可得到的營養物。
將酶摻入飼料的缺點是酶常常會變性並在通過胃或瘤胃時失活，因為在胃或瘤胃中遇到的pH是極端的。由於酶對pH，溫度，輔助因子等有特定的要求以保持其生物學活性，所以最適值的偏差可導致酶活性的降低或酶的不可逆失活。已經發現在動物飼料中加入消化酶在促進動物生長方面一般已不起作用。此外，由於只有一小部分摻入的酶在經過瘤胃或胃後保持活性，所以需要大量的酶，這樣就使得這種處理方法不夠經濟。
澳大利亞專利516，072號提出通過使消化酶與粘合系統，穩定劑，和崩解劑混合，然後用腸衣包被該混合物使消化酶免於在胃中失活。腸衣可經過胃，此後其在十二指腸的鹼性環境中分解。粘合劑和崩解劑促使酶迅速釋放到十二指腸中。這一提議的缺點是在有機溶劑，如異丙醇和二氯甲烷存在下，消化酶在與粘合劑和崩解劑混合時部分失活。此外，加腸衣的消化酶也被有機溶劑部分失活。根據澳大利亞專利516，072號生產的顆粒粒度一般不能令人滿意，這是由於防止均勻分布於飼料中而粒度大之故。
因此對酶促的動物生長促進劑的一個要求就是應克服一個或多個上述缺點。
本發明試圖提供一種有效地利用飼料成分的生長促進劑。
根據本發明所提供的生長促進劑包括具有一個核心的微粒，該核心由選自下列的一種或多種酶組成(ⅰ)蛋白水解酶(ⅱ)糖水解酶(ⅲ)脂肪水解酶，或(ⅳ)以固定化形式存在的纖維水解酶，該核心用一水溶性薄膜囊包住，並包上含有一種鹼溶而酸不溶性聚合物，或高分子量聚合物的腸衣，聚合物的結構可用能被腸液溶解的脂肪酸或其它物質的通道所取代或含有這些通道。
「固定化形式」一詞是指被固定在膠聯物內的，封入半透膜內的，吸附到吸附劑上的或結合到螯合劑上的那些酶。
例如，可用下述任何一種方法使酶固定化(a)截留法將酶摻入到膠聯物的核心或封入半透膜內;
(b)交聯法用交聯劑進行酶的分子間交聯;或(c)載體結合法通過離子鍵和(或)共價鍵使酶與水不溶性物質物理或化學結合。
進行固定化要使酶保持其生物活性。
通過酶與膠凝劑在某些條件下混合可進行酶在核心內的截留，以便使酶滯留在所形成的凝膠基質中。
膠凝劑的例子包括K-角叉藻聚糖，明膠，藻酸鹽，纖維素或其衍生物，或各種膠凝合成聚合物(如聚醯胺或脫乙醯殼多糖)。若使用吸附劑，則最好用細小的活性炭。
適用於酶固定化的螯合劑包括EDTA，它的鹽或衍生物，和高分子量親水聚合物(如聚丙烯醯胺)或能在水溶液或水(親水)溶劑中使其離子鍵離解的高分子量鹽類。
微粒的粒度最好為25～500μm，更好為50～350μm。
可用於本發明的酶的例子包括(1)蛋白水解酶組織蛋白酶a，b和c腺激肽釋放酶，蛋白酶K，枯草溶菌素，無花果蛋白酶，鏈道酶，木瓜蛋白酶，凝乳酶，胰蛋白酶，菠蘿蛋白酶和任何來自細菌，真菌，植物或動物的蛋白酶，(2)糖水解酶澱粉酶，葡糖澱粉酶，麥芽糖酶，乳糖酶，β-葡聚糖酶，葡糖異構酶，葡糖氧化酶，蔗糖酶和任何來自細菌，真菌，植物或動物的糖水解酶，(3)脂肪水解酶胰脂肪酶，細菌和真菌脂肪酶，
(4)纖維水解酶纖維素酶，果膠酶，半纖維素酶。
封裝包括薄膜或機械屏障在核心上的沉積使每個微粒的核心能與其環境物理分離。該屏障或薄膜可溶於水溶液。可形成適宜的機械屏障的化合物的例子是明膠。
腸衣最好為乙酸鄰苯二甲酸纖維素。然而，任何其它的耐酸，鹼溶性聚合物都可被利用。
甲基丙烯酸丁酯或其它高分子量聚合物都可用能被腸液溶解的硬脂酸或任何其它的脂肪酸衍生物(如C12-24脂肪酸)的通道所取代或含有這些通道。
消化酶在凝膠內的固定化是一個最有利的特徵。特別是，凝膠基質限制變性劑進入酶，變性劑如那些用於包被腸衣(一種酸不溶性，鹼溶性包衣，如乙酸鄰苯二甲酸纖維素)的有機溶劑。因而大部分固定在凝膠基質中的消化酶最終都具有催化活性。這將與在先有技術中所獲得的結果形成鮮明的對照，在先有技術中，當包被腸衣時發生酶活性的重大喪失。
可使消化酶固定於其中的凝膠基質是多孔和具滲透性的。因此，當凝膠處於含水條件時，如處於十二指腸的環境下時，由於腸液進入凝膠基質而使凝膠溶脹，並且使具有催化活性的消化酶從凝膠中釋放出來。
按照本發明的做法可按50μm～500μm的等級生產具有極小粒度的微粒而不喪失消化酶的生物學活性。特別是，固定在凝膠中，或存在於能形成凝膠的溶液中的消化酶易於處理和加工，並且可經過細心操作生產所需的小粒度微粒。例如，含有消化酶的凝膠可通過極小孔徑的篩網擠壓成形，或者可被冷凍乾燥製成所需大小的顆粒。通過一個合適的噴嘴可噴灑存在於能形成凝膠的溶液中的消化酶形成細小的液滴，這些液滴可進入使液滴形成凝膠的溶液，從而使消化酶固定在所形成的凝膠基質中。用這種方法所形成的顆粒的大小可由噴嘴的孔徑大小和可使溶液霧化的壓力來決定。與之相比，這樣的結果不能用先有技術的方法得到。在先有技術中，僅使酶與不易受到上述處理的常規粘合劑混合生產出所需粒度的微粒。
小粒度的微粒是最合乎需要的，因為它們可均勻分布於飼料中，並且由於微粒表面積的增加，使得酶迅速釋放出來。
在含有酶的核心周圍有一層水溶性屏障，可使酶不因在包被腸衣過程中使用有機溶劑而變性。由於前述的凝膠基質的保護性，可有效地保持消化酶的生物學活性。而這就意味著可大大節約用來促進生長的消化酶的量。
本發明的生長促進劑使得pH敏感消化酶在胃或瘤胃中不會失活，而可在腸道內起作用，特別是在十二指腸內起作用。當生長促進劑到達單胃動物腸的鹼性區域時，外面的包衣就會被溶解，或者脂肪酸通道被消化。然後腸液能夠到達水溶性包衣而使之發生降解。這樣就可使核心暴露，使之溶脹並釋放消化酶。
在反芻動物中，高分子量聚合物(如具有脂肪酸通道的甲基丙烯酸丁酯)，最好是C12-24，允許生長促進劑通過瘤胃和胃。在腸區，特別是在十二指腸中，脂肪酸通道被脂肪酶所消化，因而可使水溶性包衣降解並使核心暴露，使之溶脹並釋放消化酶。在這方面應該注意的是可按照本發明的做法獲得的小粒度的微粒可促使微粒通過瘤胃。
根據本發明的另一方面，提供了一種通過給動物服用有效量的如前所述的生長促進劑來增進動物生長的方法。
按上述方法處理的動物表現出體重增加和提高的飼料利用率。
可用本發明方法處理的動物包括豬，綿羊，山羊，馬，雞，鴨和其它家畜。
可給動物餵食本發明的生長促進劑。
本發明的另一方面，提供了一種增進動物生長的組合物，該組合物含有如前所述的與可藥用，或可獸用的載體或賦形劑結合的動物生長促進劑。例如，生長促進劑可與水，高嶺土，滑石，碳酸鈣，乳糖，氯化鈉，硫酸銅，硫酸鋅，硫酸亞鐵，硫酸鎂，碘化鉀，硫，氯化鉀，硒和(或)維生素(如生物素，膽鹼，氯化物，煙醯胺，葉酸，及維生素A，D，E，K，B1，B2，B6和B12)一起服用。
根據本發明的再一方面，提供了一種促進動物生長的飼料組合物，該組合物含有與適當的動物飼料結合的前面提到的生長促進劑。
適當的動物飼料的例子包括下列一種或多種物質玉米，小麥，麥麩，大豆粉，魚粉，禾草粉，脫脂乳，磷酸三鈣，麥芽，穀物，大米，魚精，乳清，苜蓿粉等等。
對摻入到生長促進劑中的不同的酶量(w/w)沒有嚴格限制。摻入到生長促進劑中的最適酶量不用做大量試驗即可很快地確定。
按照本發明的做法，每千克生長促進劑最好含有下列酶蛋白酶2×103～2×107Vitapharm蛋白酶單位澱粉酶1×104～4.3×108Vitapharm澱粉酶單位脂肪酶0.5～5×103Vitapharm脂肪酶單位纖維素酶2×102～2×106Vitapharm纖維素酶單位。
更好的是，1千克本發明的生長促進劑含有蛋白酶2×105蛋白酶單位澱粉酶4.3×106澱粉酶單位脂肪酶5×101脂肪酶單位纖維素酶2×104纖維素酶單位。
每種上述酶均為食物級，如在「食物化學索引」，第111版所定義的。
上面所給出的酶單位均為Vitapharm標準單位，並可按照實施例3所述的方法計算。
根據本發明的再一方面，提供了一種動物生長促進劑的生產方法，該方法包括下列步驟(a)使選自下列一組酶的一種或多種酶固定化
(ⅰ)蛋白水解酶;
(ⅱ)脂肪水解酶;
(ⅳ)糖水解酶;
這些酶都在一個核心內，(b)使固定化酶微粒化，(c)用一水溶性機械屏障囊包住這些微粒，和(d)用鹼溶而酸不溶性聚合物，或高分子量聚合物包被步驟(c)的微粒，聚合物的結構可被脂肪酸的間隙和通道所阻斷。
這些微粒最好噴塗上步驟(c)的水溶性機械屏障和步驟(d)的包衣。
在核心內的固定化最好適用於在膠聯物中固定化的酶。
本發明的動物生長促進劑可提高動物的增重和提高飼料的利用率。此外，動物生長促進劑可使動物屍體的背部脂肪減少。這樣可提供便於銷售的較瘦的肉。
用下列非限制性實施例將進一步描述和說明本發明。
實例1動物生長促進劑的製備方法(a)在65℃的溫度下，將2%～5%(w/v)的K-角叉藻聚糖與純化水混合，直至角叉藻聚糖完全溶解。然後將該溶液冷卻至50℃。
(b)在50℃下，將1%(w/v)的等酶活性(等酶活性是指能夠水解與其特定底物等重量的酶的量)的澱粉酶、纖維素酶、蛋白酶和脂酶溶解於等滲磷酸緩衝液(40% 0.067M Na H2PO4+60% 0.67M Na2HPO4)(pH6)。將這一溶液加到溶液(a)中，且在500轉/分的轉速下均化15分鐘，然後將2～5%(w/v)在水中電離的鈣加到該溶液中，再以50轉/分的轉速將產生的溶液進一步均化一小時，然後冷卻到20℃，結果產生一凝膠和一水相。
(c)將產生的凝膠和水相冷卻到5℃，經析、過濾後凍幹。將凍乾材料研磨成25～100微米大小的顆粒後，再用一種硬化劑〔如2.5%(w/w)的戊二醛或甲醛〕進行洗滌。
或者，用3KP/cm2的壓力擠壓步驟(b)的凝膠相，通過50微米大小的孔進行噴灑，且讓它滴落1～5米後進入2.5%(w/w)的戊二醛或福馬林溶液，形成顆粒。
(d)過濾顆粒後用軟化劑(如甘油)洗滌。任何薄膜軟化劑均可使用。
(e)將產生的顆粒過濾、流化後，於40℃加熱乾燥。
(f)於40℃下用1～2%(w/v)的白明膠水溶液噴灑塗布本步驟的顆粒。
(g)將一種耐酸、鹼溶性塗料噴灑塗布顆粒，至其最終重量為120%(w/w)。該塗料包括6%(w/w)乙酸鄰苯二甲酸纖維素30%(w/w)異丙醇0.5%(w/w)蓖麻油其餘均為丙酮(h)作為步驟(g)的替代步驟，是將一種大分子量聚合物(其結構被脂肪酸的間隙或通道打斷)噴灑塗布顆粒，至其最終重量為105%(w/w)。該塗料包括3%甲基丙烯酸丁酯0.15%(w/w)鄰苯二甲酸二丁酯0.05%(w/w)硬脂酸其餘均為乙基乙酸在步驟(a)中，K-角叉藻聚糖可被任何凝膠劑(如藻酸、白明膠或纖維素)及其衍生物取代。
在步驟(b)中，可取代鈣的物質包括其它鹼性金屬離子(如K，Rb2+，Cs+)，鹼金屬離子(如Mg2+，Sr2+)，二價或三價金屬離子(Al3+，Mn2+，Ba2+，Co2+，Ni2+，Zn2+，Pb2+等)，NH+4，脂族胺或芳香二胺(如三乙胺，亞甲基二胺，乙胺，六亞甲基二胺)，等等。
實例2促進豬的生長給「生長期」的豬(活重22～50千克)以及「成熟期」的豬(活重50～80千克)餵食各種數量的本發明實例1的生長促進劑。每千克生長促進劑包括2×105蛋白酶單位，4.3×106澱粉酶單位，5×101脂酶單位和2×104纖維素酶單位。將該生長促進劑加到一小麥、大麥、香白羽豆種和肉粉的標準原飼料中。該原飼料每千克含有13.4MJ可水解能量，18.3%粗蛋白(含有0.95%賴氨酸，0.54%用硫氨酸和0.56%蘇氨酸)以及適當水平的無機物和纖維素。
六種食物試驗方法是將生長促進劑以每噸飼料0，1.0，2.0，4.0，8.0和16千克的量加進飼料。用每種處理的飼料三次餵養正在生長的豬，每次餵養的量分別為生長期(22～50千克)和成熟期(50～80千克)全食慾的84%和87%。
這一試驗的結果見表Ⅰ
表Ⅰ用與基本飼料混合的生長促進劑餵養的豬的情況生長促進劑(千克/噸) 0 1 2 4 8 16輕重增加20-50千克，克/天 570 578 575 569 588 57750-80千克，克/天 732 759 812 791 794 800飼料轉化率20-50千克 2.75 2.69 2.79 2.70 2.66 2.7150-80千克 3.10 2.99 2.72 2.84 2.83 2.81背部脂肪，P2毫米 14.1 13.4 12.9 12.8 13.1 12.1軀體淨重百分數 68 68 68 68 68 68從表1所示的結果明顯可以看出，本發明的生長促進劑既改善了試驗動物的生長，又改善了飼料轉化。生長期豬的活重增加沒有成熟期豬的增加明顯。在成熟期，不用生長促進劑餵養的豬每天輕重增加732克，用每噸含2千克生長促進劑的飼料餵養的豬每天活重增加812克。從這一結果可以明顯地看出本方法的功效。
雖然對照動物與用生長促進劑餵養的動物之間的軀體淨重百分數沒有明顯不同，但是看來，隨著生長促進劑劑量的增加，軀體背部脂肪減少(用標準卡鉗測量)。
實例3與酶活性有關的Vitapharm標準單位的測定A.蛋白酶單位一個Vitapharm蛋白酶單位就是指在30分鐘的比色血紅蛋白測定中釋放0.0447毫克非蛋白氮的酶量。這一測定可在pH4.7、40℃的條件下用變性血紅蛋白進行。
測定試劑1.血紅蛋白2.浮石粉3.血紅蛋白底物稱取16.0克Difco Brand Bacto血紅蛋白(幹基準物)加到一個1升的燒杯中。加入3勺浮石粉後徹底混合幹成分。然後一邊攪動，一邊加入大約400毫升蒸餾水和1至2滴Dow-Corning消泡劑。將-pH電極浸入血紅蛋白溶液，一邊攪動，一邊用2N Na OH將pH調至10.0。再將溶液的體積調至500毫升。然後將該溶液以3000轉/分的轉速離心15分鐘，獲取上清液，用作底物。
4.乙酸鈉緩衝儲液，2M將164克無水乙酸鈉溶於大約700毫升蒸餾水。使用一標準pH儀，通過加入冰醋酸將緩衝液pH調至4.70±0.05。然後再用蒸餾水將溶液調至1升。
5.乙酸鈉緩衝液，0.2M用移液管吸取50毫升乙酸鈉緩衝儲液至500毫升容量瓶中，然後用蒸餾水稀釋至刻度。
6.溶於蒸餾水的70%三氯乙酸(TCA)7.氫氧化鈉，2N8.氫氧化鈉，0.5N9.福林試劑用2體積的蒸餾水稀釋1體積的Folin-Ciocalteau酚試劑，稀釋的酚試劑能夠穩定一周。
步驟1.吸取25毫升血紅蛋白底物和25毫升0.2M乙酸鈉緩衝液至150毫升燒杯。用一標準pH儀測定緩衝底物的值。如果底物的pH不是4.70±0.05，那麼就必須調整0.2M乙酸鈉緩衝液的pH，以使25毫升血紅蛋白底物和25毫升0.2M乙酸鈉緩衝液的pH為4.70±0.05。
2.吸取25毫升血紅蛋白底物和25毫升0.2M乙酸鈉緩衝液至125毫升錐形瓶中。將該錐形瓶在40±0.1℃的水浴中平衡15分鐘。
3.在零時，迅速吸取5毫升適當酶稀釋液至平衡底物中。在零時按動秒表。
4.準三分鐘後，向每一錐瓶中加入5毫升TCA溶液。為了安全，使用了滴定管或移液管。用力搖動每一錐瓶。
5.做一空白對照，它含有25毫升血紅蛋白底物，25毫升乙酸鈉緩衝液，5毫升蒸餾水，以及5毫升TCA溶液。
6.將錐瓶在室溫下放置30分鐘，讓蛋白質完全凝固。再用Whatman42號濾紙過濾每種溶液。最好用同樣的濾紙對最初的一半濾液再次過濾。濾液必須絕對澄清。
7.吸取1毫升每種濾液，4毫升0.5N氫氧化鈉和1毫升稀釋酚試劑至一試管中，然後充分混合。
8.10分鐘之後(但不遲於20分鐘)，在660納米處，通過與空白對照，測定每種濾液的吸收度。
計算一個血紅蛋白單位(HU)是在檢測條件下釋放67.08毫克(5312×6＝67.08)的非蛋白氮的酶量。
HU/克＝ (△A×F)/(W)△A＝酶解濾液在660納米的吸收值F＝酚試劑的顯色與蛋白酶水解之間的固定關係。見標準化程序的說明。
W＝加到5毫升等分水解液中的酶的毫克數。
標準化程序不同的蛋白酶打斷不同的肽鍵。酚試劑的顯色與水解程度之間沒有普遍關係。但是，對於每一類型的蛋白酶，確實都存在著一種固定的關係。該固定關係(即F因子)可通過將血紅蛋白底物與已知其活性的血紅蛋白樣品一起保溫來測定。保溫之後就進行凱氏定氮。
試劑1.硼酸溶液，2%2.硫酸鉀3.濃硫酸4.1%酚酞溶液(溶於95%乙醇)5.用於定氮的Hengar顆粒6.甲基紅指示劑酶的製備用已知活性的血紅蛋白樣品製備酶溶液，使5毫升最終稀釋的等分溶液產生10～12個△N1.5。參考有助於確定酶稀釋度的計算。
凱氏方法1.通過比色法中所述的步驟1～6進行測定。製備兩份空白和三份酶水解液。
2.吸取10毫升空白濾液，加到100毫升的凱氏燒瓶中，該燒瓶盛有4.0克硫酸鉀和1個硒化顆粒。按同樣方式在燒瓶中用4毫升濾液製備每一種酶水解樣品。
3.待溶液澄清後，吸取4毫升濃硫酸至每個燒瓶中，且水解30分鐘。停止加熱，使燒瓶冷卻。然後加入40毫升蒸餾水和1滴酚酞溶液。再將燒瓶置於冰浴上放置10～30分鐘。
4.在檢測2%硼酸溶液的pH值之後，立即進行一系列蒸餾。硼酸溶液的pH值應為4.3至4.7。將蒸餾冷凝器的導管放在適當位置，使得冷凝液能夠滴到含有40毫升硼酸的150毫升燒杯中。
5.將7.0克的氫氧化鈉加到冷卻的凱氏燒瓶中。不要混合，立即用一橡皮套將燒瓶與一蒸餾裝置相連。用力混合後蒸餾3分鐘，降下硼酸燒杯，繼續蒸餾1分鐘。如果發生暴沸，則立即繼續進行下列步驟如同已完成蒸餾。用蒸餾水衝洗導管至硼酸溶液中，從燒瓶下移去支架。
6.加入兩滴甲基紅指示劑，用0.02N鹽酸滴定每一餾出液至pH4.5。測定空白和酶水解液的平均滴定度，用它計算HU/克。
計算按下列方法計算由於蛋白酶的水解而得到的10毫升濾液中氮的毫克數。
毫克氮(△N)＝(樣品滴定度×10/4-空白滴定度)(0.02N)(14)毫克氮(△N)＝(樣品滴定度×2.5-空白滴定度)(0.28)10/4＝4毫升樣品濾液換算為10毫升基準物0.02N＝鹽酸的當量濃度14＝氮的分子量將△N的量乘1.5次方，即△N3/2，若將△N3/2對酶的毫克數作圖，就會得到一條直線。從這一直線圖就可測得精確釋放5毫克氮所需要的酶量。
(△N)1.5＝log-1(1.5×log，△N)每克的血紅蛋白單位(HU/克)按下列公式計算HU/克=( △N)1. 5× 1,000 × 60E × 10=11.18 × 6,000E]]>(△N)1.5＝10毫升濾液中釋放的5毫克氮1，000＝將酶的毫克數換算為克數60/10＝將10毫升的等分溶液換算為60毫升基準物總體積E＝產生5毫克氮的酶的毫克數對於蛋白酶類型的F因子按下列公式計算F＝ (W)/(△A) ×HU/克W＝加到5毫升等分水解液中的酶的毫克數△A＝酶解濾液在660納米處的吸收值HU/克＝按凱氏標準化程度測得每克蛋白酶的血紅蛋白單位一個Vitapharm蛋白酶單位(1VPPV＝1HU)B.澱粉酶單位一個Vitapharm澱粉酶單位定義的是在以下所述的Vitapharm澱粉酶檢測的條件下於30分鐘內產生1毫克還原糖(麥芽糖)的活性。
檢測試劑澱粉底物4%w/v可溶性澱粉溶液可溶性澱粉(幹基準物)漿20.00克(適用於碘量法的Merck試劑可溶性澱粉，Merck CO.，Rahway，N.J.)存在於75ml蒸餾水中。攪拌條件下向其中加入沸騰蒸餾水至300ml，再使澱粉溶液沸騰並微沸3分鐘。從加熱器上取下並定量轉移到500ml派熱克斯容量瓶中。用自來水使其冷卻至室溫並補足至該體積。
澱粉指示劑溶液150克分析純Na Cl溶於480ml蒸餾水並加熱至沸騰。用電動攪拌器劇烈攪拌。將5.7克(乾重約5.0克)可溶性澱粉加到20ml蒸餾水中所獲的均勻懸浮液緩慢加入其中。沸騰至少5分鐘，再冷卻。
碳酸鈉溶液 10.6%碳酸鈉溶液 1.06%儲備的碘溶液 0.1N12.7克碘(I2)和48克碘化鉀(KI)溶於約900ml蒸餾水中。定量轉移到1升容量瓶中並用蒸餾水補足至該體積。
碘溶液 0.02N硫酸 0.5N硫代硫酸鈉 0.005N酶溶液酶溶液的濃度應當是1ml該酶溶液能在保溫期間產生大約20%理論值的麥芽糖。稀釋的澱粉酶不穩定。因而，適宜的酶溶液應當在使用前才配製。不要在40℃平衡酶溶液，因為有失活的危險。
程序1.將25ml 4%澱粉底物移入50ml容量瓶中。加入5ml適宜的緩衝液和18ml水。以水浴在40℃±0.5°平衡該瓶15分鐘。
2.在0時，迅速吸取1ml適宜的酶溶液移至已平衡過的澱粉混合物中。用蒸餾水補足體積並顛倒混勻。對底物空白而言，加入1ml蒸餾水取代酶溶液。
3.在每個反應瓶準確地保溫30分鐘後，吸取5ml澱粉酶解液移至含1ml10.6%碳酸鈉的10ml容量瓶中。用蒸餾水補足體積並顛倒混合。
4.按下述確定酶解液的還原值吸取2ml碳酸鈉酶解液等分試樣移至50ml帶塞的玻璃燒瓶中。所有測定均重複。吸取3ml 0.02N碘溶液移入該玻璃燒瓶中，用3ml蒸餾水洗燒瓶壁。以水浴在20℃±0.5℃平衡碘混合物30分鐘。加入1ml 0.5N硫酸，用標定的0.005N硫代硫酸鈉滴定。當溶液變為灰黃時加入三滴澱粉液指示劑。繼續滴定直至澱粉-碘複合物消失。
5.對碘空白而言，滴定3ml 0.02N碘溶液，2ml 1.06%硫酸鈉和3ml水。
計算按下述方法計算酶解液的還原值1.用碘空白滴定值減去澱粉液滴定值計算出澱粉空白。
2.按下式計算麥芽糖毫克值麥芽糖毫克值＝(I2空白-澱粉空白-Na2S2O3滴定值)×50×0.855滴定的樣品的還原值等於碘空白減去澱粉空白再減去酶解液的硫代硫酸鈉滴定值再乘以0.855。1ml 0.005N硫代硫酸鈉相當於0.855mg麥芽糖。滴定的樣品相當於1ml初始酶解液。被滴定樣品的還原值乘以50給出了從1克澱粉中得到的以麥芽糖計算的還原糖的實際毫克值。
3.用表2中的修正因子將水解值修正為20%水解值。用下述等式計算澱粉酶效力
效力(mg/mg)＝ (麥芽糖(mg)×修正因子)/(酶(mg/ml))
C.脂酶單位1.Vitapharm脂酶單位定義為在下述Vitapharm澱粉酶檢測中2小時釋放出1毫克當量脂肪酸的活性。
檢測試劑1.緩衝液，0.1M磷酸鹽，pH7.32.780克Na H2PO4·H2O溶於水並稀釋至100ml。將2.839克無水Na2HPO4溶於水並稀釋至100ml量取23.0ml該Na H2PO4溶液和77.0ml該Na2HPO4溶液移至200ml容量瓶中，用蒸餾水補足體積。
2.底物，橄欖油乳液在慢速運行的韋林氏攙合器(調壓變壓器定在25～30那一檔)中的93ml 0.1M磷酸鹽緩衝液內緩慢加入200mg苯甲酸鈉和7.0克USP阿拉伯樹膠。當這些試劑完全溶解後，緩慢地加入93mlUSP橄欖油。當全部油加入後，以該速攙合3分鐘，然後再以高速攙合5分鐘。
3.緩衝的底物向100ml配衡的容量瓶中加入54.4克橄欖油乳液，用0.1M磷酸鹽緩衝溶液補足體積。該緩衝的底物應當為pH7.3。
4.乙醇，95%5.百裡酚酞，1%(w/v)在95%乙醇中6.氫氧化鈉，0.05N程序1.吸取5.0ml被緩衝的底物的等分試樣移入50ml錐形燒瓶中。每種待測樣品各用一個燒瓶。把它們放在特殊的夾具上，並放在37℃水浴中。
2.製備適宜的酶稀釋液。樣品的稀釋應根據該酶製劑的脂酶活性而定。
3.在一個含底物的燒瓶中加入5.0ml蒸餾水，即成分酶空白。然後在其它的底物燒瓶中各加入一種酶樣品5.0ml。充分攪拌，在37℃保溫2小時，其間不時迴蕩燒瓶。
4.向各燒瓶中加入3.0ml乙醇終止反應，加入4滴百裡酚酞並充分混合。
5.用0.05N Na OH滴定各燒瓶至灰蘭色終點。最好是滴定出空白，然後將樣品與其對比。從樣品滴定中減去底物空白測得酶反應。
計算不同水平的酶對底物的水解程度不是線性的。為了獲得良好的重複性，能給出4.0ml 0.05N Na OH滴定差異(樣品滴定度一定白滴定度)的酶量是正確的酶量。有兩種方法可以用來確定這一酶量。
A.三樣品法三種酶製劑樣品嚴格按本方法進行，樣品重量的選擇應這樣進行，一種給出少於4.0ml的滴定差異，另一種給出大於4.0ml的滴定差異，第三種則給出約等於4.0ml的滴定差異。在座標紙上相對滴定差異畫出酶的毫克量點，各點之間以直線相連。由圖中讀出滴定差異正好為4ml所對應的酶毫克值，並用於按下式計算脂酶單位(4.0×N×1000)/(酶樣品(毫克)) ＝脂酶單位(LU)/克其中N為Na OH的當量濃度。
B.標準曲線法以預先經準確測定了其活性的製劑作為標準樣品，使用幾種不等重量的標準樣品嚴格地按方法進行檢測。以得到的滴定差異值對標準樣品毫克值作圖，在各點之間作出平滑的曲線。得到這條標準曲線後，則在確定未知樣品的脂酶活性時，則按照方法選用方便的樣品重量進行檢測。由標準曲線確定給出與未知檢測樣品相同滴定差異值的標準樣品重量值，按下述計算脂酶活性LU/克＝ (標準樣品(mg))/(未知樣品(mg)) ×標準樣品檢測值D.纖維素酶單位一個Vitapharm纖維素酶單位定義的是在檢測條件下5分鐘使給定的羧甲基纖維素底物產生相對流動性改變為1的活性。該檢測基於的是在pH4.5，40℃使給定羧甲基纖維素底物的內部β-1，4-糖苷鍵被酶水解。
試劑和溶液1.乙酸溶液，2N2.乙酸鈉溶液，2N3.乙酸溶液，0.4N4.乙酸鈉溶液，0.4N5.乙酸焉鹽緩衝液(pH4.5)使用標準使用前用紗網過濾底物。
酶製劑製備一種酶製劑，使其在檢測條件下，5分鐘能產生0.18至0.22的相對流動性的改變。稱量該酶用的羧甲基纖維素鈉是CMC 7HP型(Hercules，Inc.，910Market Street，Wihmington，Delaware 19899)。
7.羧甲基纖維素鈉底物，0.2%w/v將200ml蒸餾水移入韋林氏攙合器的碗中。攙合器定於低速運行，將1.0gCMC 7HP小心地加到該碗中，不要有任何液體濺出。用橡膠棒將蒸餾水沿玻璃碗邊向下清洗。蓋上碗蓋，以高速混合1分鐘。定量轉移到500ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至該體積。使用前用紗網過濾底物。
酶製劑製備一種酶製劑，使其在檢測條件下，5分鐘能產生0.18至0.22的相對流動性的改變。稱量該酶並定量轉移到玻璃研缽中。用蒸餾水滴定並定量轉移到適當的容量瓶中。用蒸餾水稀釋至該體積，使用前，用1號Whatman濾紙過濾酶溶液。
檢測程序1.將校準的粘度計以垂直位置放入40°±0.1℃水浴中。應使用經嚴格清洗過的粘度計。清洗是先吸入大量清潔劑，然後再吸入蒸餾水來完成。還可用帶橡皮管的吸氣器連接到粘度計的細臂來完成。
2.吸取20ml經過過濾的CMC 7HP底物和4.0ml乙酸鹽緩衝液(pH4.5)移入到50ml錐形燒瓶中。每種酶樣品至少有2瓶，並有一瓶底物空白對照。蓋好錐形瓶，放在水浴中平衡15分鐘。
3.在0時，吸取1ml酶溶液移入經平衡的底物中。打開1號秒表並充分混合溶液。然後，立即吸取10ml反應混合物移入粘度計的粗臂中。
4.約2分鐘後，用橡皮管連在粘度計的細臂上抽吸，使反應混合物超過上標記進入流體頭。讓反應混合物通過上標記自由流下，測定其時間。當反應混合物的彎月面降過上標記時，開動2號秒表。同時，由1號秒表按分記錄反應時間(Tr)。當反應混合物的彎月面降過下標記時，從2號秒表上按秒記錄下時間(Tt)。
5.立即再將反應混合物吸過上標記進入流體頭部。當反應混合物的彎月面自由下降超過上標記時，再重新開動2號秒表。同時，由1號秒表上按分記錄下反應時間(Tr)，由2號秒表按秒記錄時間(Tt)。
6.重複步驟5，直至完成4次測定，歷時(Tr)不超過15分鐘。
7.吸取1ml蒸餾水移入24ml徑緩衝的底物中製備底物空白。再吸取10ml反應混合物移入粘度計的粗臂內。按秒記錄彎月面下降經過兩個標記之間所需的時間(Ts)。以5次測定的平均值作為Ts。
8.吸取10ml經平衡的蒸餾水移入粘度計的粗臂內製成水空白。按秒測定彎月面下降經過2個標記之間所需時間(Tw)。以5次測定的平均值作為Tw。
計算1個纖維素酶單位(CU)定義的是在檢測條件下5分鐘使給定的羧甲基纖維素底物產生相對粘度改變為1的活性。
按下述對四次流出時間(Tt)和反應時間(Tr)各計算其相對流動性(Fr)和(Tm)值Fr＝(Ts-Tw)(Tt-Tw)Tm＝1/2(Ts/60秒/分)+Tr＝(T2/120)+Tr其中Fr＝每一反應時間的相對流動性Ts＝按秒記錄的底物空白流出時間的平均值Tw＝按秒記的水空白流出時間的平均值Tt＝按秒記的反應混合物的流出時間Tr＝從0時開始的按分記的花費的時間，即從向經緩衝的底物加入酶溶液直至開始測定流出時間(Tt)的時間。
Tm＝按分記的反應時間(Tr)加上二分之一轉換成分的流出時間(Tt)。
以四次相對流動性(Fr)為縱座標，以四次反應時間(T)為橫座標作圖。應得到一條直線，其斜率相當於每分鐘相對流動性的改變，而且是與酶濃度成比例的。通過一系列實驗點的最優直線的斜率作為酶活性標準比單一相對流動性數值更好。從圖中確定Fr值為10和5分鐘。它們在流動性上的差異不應大於0.22，也不應小於0.18。未知酶活性的計算按下式進行
CU/g=1000F (Fr10-Fr5)W]]>其中Fr＝反應時間為5分鐘的相對流動性Fr＝反應時間為10分鐘的相對流動性1000＝每克為1000毫克W＝加到反應混合物中的1毫升酶溶液等分試樣中的酶毫克量
權利要求
1.一種生長促進劑，該促進劑由具有一個包含選自下列的一種或多種酶的核心的微粒組成(i)蛋白水解酶；(ii)糖水解酶；(iii)脂肪水解酶；和(iv)以固定化形式存在的纖維水解酶；用水溶性薄膜囊包裹核心，並用含有鹼溶性，酸不溶性聚合物，或高分子量聚合物的腸衣包被核心，聚合物的結構可用能被腸液溶解的脂肪酸或其它物質的通道所取代或含有這些通道。
2.一種權利要求
1所要求的生長促進劑，其中核心包括固定在膠聯基質內的酶。
3.一種權利要求
2所要求的生長促進劑，其中凝膠基質包括K-角叉藻聚糖，明膠，藻酸鹽，纖維素或其衍生物;或膠凝合成聚合物。
4.一種權利要求
1～3中任一項所要求的生長促進劑，其中微粒的大小為25～500μm。
5.一種權利要求
4所要求的生長促進劑，其中顆粒的大小為50～350μm。
6.一種權利要求
1所要求的生長促進劑，其中脂肪酸薄膜包括C12-24脂肪酸。
7.一種權利要求
1所要求的生長促進劑，其中水溶性薄膜是明膠。
8.一種權利要求
1所要求的生長促進劑，其中鹼溶性，酸不溶性聚合物是乙酸鄰苯二甲酸纖維素。
9.一種權利要求
1所要求的生長促進劑，其中高分子量聚合物是甲基丙烯酸丁酯。
10.一種權利要求
1～9中任一項所要求的生長促進劑，每千克所述生長促進劑含有2×103～2×107蛋白酶單位4.1×104～4.3×108澱粉酶單位0.5～5×103脂肪酶單位2×102～2×106纖維素酶單位。
11.一種增進動物生長的方法，該方法包括供給生長促進量的權利要求
1～10中任一項所要求的生長促進劑。
12.一種權利要求
11所要求的方法，其中生長促進劑以與動物飼料混合的方式給動物服用。
13.一種權利要求
1～10中任一項所要求的生長促進劑，該促進劑與可藥用或可獸用的載體或賦形劑結合。
14.一種增進動物生長的方法，該方法包括供給權利要求
13所要求的生長促進組合物。
15.動物飼料，該飼料與權利要求
1～10中任一項所要求的生長促進劑混合。
16.動物飼料，該飼料混有權利要求
13所要求的生長促進組合物。
17.一種動物生長促進劑的生產方法，該方法包括下列步驟(a)使選自下列酶的一種或多種酶固定化(ⅰ)蛋白水解酶;(ⅱ)脂肪水解酶;(ⅲ)纖維水解酶;(ⅳ)糖水解酶;這些酶都在一個核心內;(b)使固定化酶微粒化;(c)用一水溶性機械屏障囊包住這些微粒;和(d)用包括一種鹼溶性，酸不溶性聚合物，或高分子量聚合物的腸衣包被步驟(c)的微粒，聚合物的結構可用能被腸液所溶解的脂肪酸或其它物質的通道取代或含有這些通道。
18.一種權利要求
17所要求的方法，其中使酶在膠聯物內固定化。
19.一種權利要求
17所要求的方法，其中用步驟(c)的水溶性屏障和步驟(d)的包衣噴塗微粒。
20.一種生長促進劑，生長促進組合物，促進動物生長的方法，或動物生長促進劑的生產方法，基本上如上文所述。
專利摘要
本發明涉及一種生長促進劑，它由具有一個包含選自下列的一種或多種酶的核心的微粒組成(i)蛋白水解酶；(ii)糖水解酶；(iii)脂肪水解酶；和(iv)固定化形式的纖維水解酶；用水溶性薄膜囊包囊核心，並用含有鹼溶性，酸不溶性聚合物，或高分子量聚合物的腸衣包被核心，聚合物的結構可用能被腸液溶解的脂肪酸或其它物質的通道取代或含有這些通道。本發明還描述一種增進動物生長的方法，該方法包括供給生長促進量的生長促進劑，還描述一種生產生長促進劑的方法。
文檔編號A61K9/58GK87105846SQ87105846
公開日1988年5月4日 申請日期1987年8月27日
發明者索馬斯·科·薩·英格 申請人:索馬斯·科·薩·英格導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan