用於檢測豬瘟病毒、豬圓環病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的基因晶片及檢測方法
2023-09-19 01:49:00 2
專利名稱：用於檢測豬瘟病毒、豬圓環病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的基因晶片及檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物基因技術和計算機數據分析領域，尤其涉及一種用於檢測豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)、豬圓環病毒 2 型(Porcine Circovirus type 2，PCV-2)和豬繁殖與呼吸症候群病毒歐洲型與美洲型(Porcine Reproductive md RespiratorySyndrome Virus Europe type and America type, PRRSE, PRRSVA)基因晶片及晶片的製備方法，以及採用該基因晶片進行檢測或診斷病毒的方法。
背景技術：
隨著規模化豬場的增加，豬疫病的種類也在增加，舊的疫病沒有消滅，新的疫病不斷出現，並且隨著病毒株的變異使豬的疫病日益呈現複雜化和嚴重化趨勢。豬瘟 (ClassicalSwine Fever, CSF)、豬圓環病毒病 2 型(Porcine Circovirus type 2，PCV-2) 和豬繁殖與呼吸症候群(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是目前威脅我國豬的主要傳染性疾病。對於危害全球養豬業發展的豬主要疫病，快速準確診斷是控制該病重要前提。常規的病毒分離診斷方法雖然準確，但費時費力，並且需要專門的技術人員進行操作。基於分子生物學的診斷方法要以RT-PCR和螢光PCR為主。RT-PCR比螢光RT-PCR方法靈敏度低、耗時長；螢光RT-PCR方法具有高靈敏度的特點，但檢測成本高，並且不能同時檢測幾種疾病。近年來，豬癌病毒(ClassicalSwine Fever Virus，CSFV)、豬圓環病毒 2 型 (PorcineCircovirus Virus type 2，PCV2)和豬繁殖與呼吸症候群病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus,PRRSV)已成為危害世界規模化養豬業的重要豬病症候群。這些病原均可導致豬的繁殖障礙，且常成混合感染，不易區分，給臨床鑑別診斷造成較大困難。在這種情況下，如何快速、靈敏、準確地對多種疫病同時做出診斷以及早制定和採取相應防制措施是現代動物疫病檢疫新的發展方向。基因晶片技術是近年來興起的一種早期快速檢測的方法，通過高通量平行檢測病原體的多個基因，可大大提高檢測的靈敏度和精確度，克服了 PCR擴增以單個基因為靶標進行檢測而易出現假陽性及假陰性的缺點，同時通過計算機軟體分析雜交結果，降低了結果判斷的主觀因素，因而能夠快速、準確、高通量地對多種疾病進行早期的快速診斷與排查。但是，目前未有成熟的基因晶片檢測技術應用於豬瘟、豬圓環病毒病和豬繁殖與呼吸症候群(亞型)的檢測。
發明內容
針對現有技術存在檢測費時費力和成本高，且只能對單一病種進行檢測之不足， 本發明的目的是提供一種豬瘟、豬圓環病毒病和豬繁殖與呼吸症候群病毒基因晶片，以及該晶片的製備方法；進一步，本發明還提供採用該基因晶片對豬瘟、豬圓環病毒病和豬繁殖與呼吸症候群三種病同時進行檢測的方法。
本發明採用的技術方案如下一種用於檢測豬瘟、豬圓環病毒病和豬繁殖與呼吸症候群的基因晶片，其特徵在於採用如下表所示的探針序列
權利要求
1. 一種用於檢測豬瘟、豬圓環病毒病和豬繁殖與呼吸症候群的基因晶片，其特徵在於採用如下表所示的探針序列
2.如權利要求1所述基因晶片，其製備方法包括如下步驟根據 GenBank 中已發表的 PCV-2、PRRSVE, PRRSVA, CSFV 的序列，應用 DNAMar 的MEGALIGN程序找出各個病毒的保守區；寡核苷酸潛在的二聚體和特異性用NCBI 即美國生物技術信息中心網站，http //www. ncbi. nlm. nih. gov的BLAST程序結合 PrimerPremier5. 0、01igo6. 0進行鑑定；根據探針、引物設計的相關原則及利用上述軟體設計擴增目的片段的引物序列和探針序列，其序列和特性見下表1、表2 ；合成時在每個探針的5』加上1個氨基和15個T ；正鏈引物用CY-3螢光標記；引物用雙蒸水稀釋為 100 μ mol/L, -20°c保存備用；在氨基化片基上點制的60-mer寡核苷酸探針，質量等級為PAGE級；寡核苷酸探針用無菌水溶解後，再與2X上樣緩衝液，按1 1混合，使點樣終濃度調整為25 μ mol/L，通過晶 S PerSOnalArrayerTM-16個人點樣儀將探針片段有序地點製成6行X 5列的陣列，每條探針橫向重複點3個點；點制好的基因晶片通過37°C水浴放置18h以上後經洗滌、封閉、乾燥後置乾燥器中室溫保存；所述上樣緩衝液為pH 7. 4含0. 5% SDS的200 μ mol/L PBS ； 表1基因晶片引物序列
3.採用權利要求1或2所述基因晶片檢測豬瘟、豬圓環病毒病和豬繁殖與呼吸症候群的方法，包括如下步驟(1)標準病毒基因的擴增按照分子生物學實驗技術提取標準豬瘟病毒、豬圓環病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的DNA或RNA，對RNA進行反轉錄後進行多重PCR體系的構建及優化，對優化好的體系進行帶標記引物的PCR擴增，體系如下PCR體系I 包括PCV-2、PRRSVA、CSFV的三種模板DNA或者cDNA各1 μ L ； 10XPCRBuffer2. 5 μ L ；濃度 25mmol/L 的 MgCl22 μ L ；濃度為 10mmol/L 四種 dNTPsO. 8 μ L ； Taq DNA聚合酶0. 4 μ L ;5端代CY-3標記的10 μ mol/L四種引物各1 μ L，加入無菌水至 25 μ L體系；PCR 體系 II 包括 PRRSVA、PRRSVE 的 cDNA 各 1 μ L ;10XPCR Buffer2. 5 μ L ；濃度 25mmol/L 的 MgCl22 μ L ；濃度為 10mmol/L 四種 dNTPsO. 8 μ L ；Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L ;5 端代CY-3標記的10 μ mol/L兩種引物各1 μ L，加入無菌水至25 μ L體系；PCR反應程序用PCR儀在94°C溫度環境下變性6min ；循環步驟為94°C變性30s， 54°C /581退火308，721延伸lmin，進行；35個循環；最後72°C延伸lOmin，PCR產物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳；(2)基因晶片雜交配製15 μ L的雜交體系5 μ L的帶標記的PCR產物和10 μ L晶片雜交液，晶片雜交液含25%甲醯胺、10XSSC、0. 2% SDS，將兩者混合均勻後放入PCR儀進行高溫變性；變性條件為95°C變性5min後，立即置於冰浴上快速冷卻3min ；將15 μ L雜交體系小心地加入到如權利要求2所述基因晶片的小孔裡，組裝上雜交盒，放入40 42°C的水浴鍋進行雜交2 4h ；(3)對雜交好的晶片清洗及掃描結果分析對雜交好的晶片要進行洗片；將洗好的晶片置於50ml離心管中在臺式冷凍離心機離心aiiin以甩幹，再利用晶芯 LUX&an10K-A微陣列晶片共聚焦雷射掃描儀進行掃描並對結果進行分析；(4)對被檢病毒基因的檢測用設計的引物對被檢病毒基因進行擴增、基因晶片雜交和對雜交好的晶片清洗及掃描結果分析，即將標有螢光染料的擴增產物與晶片上寡核苷酸探針雜交，掃描、分析晶片上螢光信號；其具體操作方法同步驟(1)、(2)和(3)；並與標準病毒基因掃描結果進行比對，獲得檢測結果。
全文摘要
本發明提供了一種豬瘟病毒、豬圓環病毒2型和豬繁殖與呼吸症候群病毒歐洲型與美洲型基因晶片檢測方法，基因晶片採用如下表所示的探針序列本發明採用該基因晶片對豬瘟、豬圓環病毒病和豬繁殖與呼吸症候群三種疾病同時進行檢測的方法。解決了現有檢測技術費時費力和特異性差，或只能對單一病種進行檢測的問題。本發明設計的所有探針在5』端均合成一個連接氨基，並設計有一段15bp長度的多聚T連接臂，結果表明其具有較高的固定效率。本發明建立的帶標記引物的多重PCR擴增技術能夠一次性擴增出多種與對應探針互補的螢光標記DNA，保證固液相中核酸雜交的高度特異性和靈敏性。此外，採用此種標記分法，可以大大縮短檢測時間，降低晶片檢測的成本，更適合推廣到臨床應用中。
文檔編號C12Q1/68GK102234693SQ20111005947
公開日2011年11月9日 申請日期2011年3月11日 優先權日2011年3月11日
發明者葉芬, 吳勝昔, 李應國, 溫海霞, 胡仁建, 蔡家利, 項錦欣 申請人:重慶理工大學