運用重組多表位肽蛋白進行鉤端螺旋體感染檢測的方法
2023-09-19 01:51:35
專利名稱：運用重組多表位肽蛋白進行鉤端螺旋體感染檢測的方法
技術領域：
本發明屬於醫學免疫檢測學技術領域，特別地，涉及一種運用重組多表位 肽蛋白進行鉤端螺旋體感染檢測的方法。
背景技術：
鉤端螺旋體病是一種由鉤端螺旋體菌感染而產生的動物傳染性疾病通過 接觸家養或野生的動物宿主或被它們尿液所汙染的環境而傳播給人。鉤端螺旋 體由8種致病的遺傳相異類型和4種非致病的腐生種類組成。鉤端螺旋體還按
血清型情況進行了分類，目前已鑑定出了 230多個致病血清變型。
鉤端螺旋體病廣泛分布於世界各地。由於大範圍的動物物種可作為其宿主， 所以該病被認為是最普遍的人畜共患疾病。該病的早期特徵為發熱、寒戰、頭 痛和嚴重的肌肉痛，由於症狀與出血熱、感冒等相似而常被誤診。在臨床感染 中有5-15%的病人病情發展至產生諸如黃疸、腎機能不全和肺出血等嚴重的多 系統併發症。嚴重的鉤端螺旋體病死亡率為5-50%。
最近幾年該病已出現了新的傳播模式，突出顯示了鉤端螺旋體病正成為公 共健康問題的嚴重性。在發達國家，鉤體病成為消遣性活動和體育運動相關性 疾病發作的原因。在發展中國家，貧困狀況已造成了高死亡率鉤體病在城市或 鄉村的廣泛傳播。不僅如此，鉤體病還造成牛、豬、羊、馬和狗等牲畜和家養 動物的流產、死產、不育、不生長、產奶量低甚至死亡。
目前適當檢測工具的缺乏阻礙了對人和動物鉤體病的控制。雖然經過數十 年的努力，在鉤端螺旋體病的科研和防治方面己取得了一定的成就，但目前鉤 體檢測方法主要有直接暗視野顯微鏡檢查法、改良鍍銀染色法、凝集試驗及凝 集素吸收試驗等。但這些方法不適合急性病例的鑑別。新發展的基於全細胞鉤 端螺旋體抗原製品的酶聯免疫吸附檢測法(ELISA)和其它快速血清學檢測仍需 要進行MAT以確認病例。鉤端螺旋體病的發病機理依賴於感染早期病原體在宿 主體內廣泛散布的能力。鉤體外膜蛋白被認為介導了使其能穿過並散布於宿主組織間的相互作用。此外，外膜蛋白在宿主感染期間可引發免疫反應，因此構 成了通過抗體依賴型吞噬作用和補體介導型致死作用等機制而進行免疫保護的 耙分子。最近有利用重組外膜蛋白作為鉤端螺旋體病的血清學檢測的方法，但 由於鉤端螺旋體的抗原結構複雜，血清型眾多，用常規的以多抗血清為基礎的 血清學方法不利於該病的早期快速檢測。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種運用重組多表位肽蛋白 進行鉤端螺旋體感染檢測的方法
技術領域：
本發明的目的是通過以下技術方案來實現的 一種運用重組多表位肽蛋白 進行鉤端螺旋體感染檢測的方法，採用鉤端螺旋體外膜蛋白優勢抗原決定簇的 重組多表位肽為檢測抗原構建試劑盒或試紙條，檢測鉤端螺旋體抗體IgM或IgG。
進一步地，它包括以下步驟-
(1) 篩選鉤端螺旋體外膜蛋白OmpLl、 LipL21和LipL32的優勢抗原表位；
(2) 根據篩選的表位序列及表達系統的偏愛性，人工合成DNA序列並採用基因 工程手段獲得目的蛋白的編碼基因；
(3) 將合成的基因片段克隆到表達載體中並構建表達該目的蛋白的表達系統；
(4) 根據表達系統的特點選用一定的純化方法提純目的蛋白並獲得高純度的
# 口 廣叩s
(5) 對所述步驟(4)獲得的重組蛋白進行SDS-PAGE分析，確定具有22 kD分 子量的特定蛋白存在；對目標蛋白進行Western Blot分析，確定所獲得 蛋白的免疫反應性。
(6) 以獲得的重組蛋白為抗原，構建ELISA檢測試劑盒或試紙條，檢測目標樣 品中抗鉤體IgG或IgM的存在情況而實現對鉤體病人的檢測。
進"步地所述的目標樣品為人或動物的血清、腦脊液等所有已經脫離人體 或動物體的體液樣品；所述的用於鉤端螺旋體感染檢測的方法是在體外進行的。
本發明的有益效果是本發明用多表位串連表達蛋白作為抗原進行鉤體病 血清學檢測具有特異、快速、方便、靈敏正確、結果可肉眼觀察等特點，且該 檢測方法沒有鉤體不同血清型的限制，有利於其推廣應用。
4圖1為重組質粒的酶切圖譜，圖中，Ml， 50 bp DNA marker; 1， pBacPAK8/BamHI+EcoRI; 2， pBacPAK8-Imp/ BamHI+EcoRI; 3， pBacPAK8-21mp/ BaraHI+EcoRI; 4， pET28a/BamHI+EcoRI; 5， pET28a-21mp/BamHI+EcoRI; M2， 1 kb DNA marker。
圖2為目的蛋白的SDS-PAGE分析圖，圖中，M， protein ladder: 1， pET28a; 2-3， pET28a-21mp超聲波破碎上清；4-5， pET28a-21mp超聲波破碎沉澱；6-7， 2 Imp純化。
圖3 Western Blot分析結果圖，圖中，1， 2， 3，分別為pET28a， pET28a-21mp， 21mp purification與抗體的雜交條帶。 圖4檢測試紙條的設計圖。
具體實施例方式
本發明通過基因工程手段，將鉤端螺旋體外膜蛋白0mpLl、 LipL21、 LipL32 的優勢抗原表位進行串連，通過表達系統在體外進行表達、純化、並製備鉤端 螺旋體菌的抗體檢測試劑盒。該試劑盒能特異性地檢測鉤端螺旋體菌的抗體， 能檢測不同血清型鉤體感染後造成的感染，可用於鉤端螺旋體病的臨床血清學 檢測及環境鉤端螺旋體菌的監測。
本發明的方法包括以下步驟
1. 篩選鉤端螺旋體外膜蛋白0mpLl、 LipL21和LipL32的優勢抗原表位；
2. 根據篩選的表位序列及表達系統的偏愛性，人工合成DNA序列並採用基因工 程手段獲得目的蛋白的編碼基因；
3. 將合成的基因片段克隆到表達載體中並構建表達該目的蛋白的表達系統；
4. 根據表達系統的特點選用一定的純化方法提純目的蛋白並獲得高純度的產
n
5. 對上述(4)所獲得的重組蛋白進行SDS-PAGE分析，確定具有22 kD分子量的特 定蛋白存在；對目標蛋白進行Western Blot分析，確定所獲得蛋白的免疫反應性。
6. 以獲得的重組蛋白為抗原，構建ELISA檢測試劑盒或試紙條，檢測目標樣品 中抗鉤體IgG或IgM的存在情況而實現對鉤體病人的檢測。
其中，目標樣品為人或動物的血清、腦脊液等所有已經脫離人體或動物體 的體液樣品；該方法在體外進行。實施例1. T細胞和B細胞優勢抗原決定簇的篩選
通過 Propred HLA-DR 結合肽預測工具 ProPred (http://www.imtech.res.in/raghava/propred/) 以及 EMBOSS 軟體包 (http:〃bioinfo. hku. hk/EMB0SS/)分別預測了鉤端螺旋體外膜蛋白OmpLl、 LipL21和LipL32的主要T細胞和B細胞抗原表位。將預測的表位片段通過PCR 方法擴增後插入到噬菌體M13KE中在PIII蛋白表面進行展示，純化噬菌體蛋白 並對各篩選表位進行鑑定。
實施例2.包含多表位肽載體的構建
根據表達系統密碼子偏愛性，人工合成了各表位片段串連基因lmp，其中各 表位之間通過柔性肽段進行連接，在合成基因的兩端分別含有BamHI、 BglII和 EcoRI位點，將合成的基因插入到pUC57載體中構建p-l即載體，測序正確後通 過BamHI和EcoRI酶切分離Imp基因，並插入到BglII和EcoRI酶切的p-Imp 載體中構建p-21mp載體，則各個表位在載體中重複兩次。通過BamHI和EcoRI 酶切分離21mp片斷插入到表達載體pET28a中，構建表達載體pET28a-21mp。 pET28a-21即重組質粒經BamHI和EcoRI酶切後可產生大約5300 bp和600 bp 兩條帶，與預期結果相符(圖l)，將酶切正確的陽性pET28a-21mp重組質粒進
行測序(表l)。
表l:合成基因的胺基酸序列
名稱核苷酸序列胺基酸序列
OTATATAGGAGTTGCTCCTAGAMAGCGATTCCTGCTYIGVAPRKAIPA
印ito pe2AGTTCTATCGTCATTCCTGCAGCCGTTGGTATCAAATT GAATGTTACTGAAGACGCTSSIVIPAAVGIKLNVTEDA
epito pe3GCATCTGATGTAGTGAAAAAAATGGTTGGGGAAACAGT AGAATCTGCAASD雨腿VGETVESA
epito pe4GATGCTCTCGTAGCAAAAGCTCAAGAGGTTTCCDALVAKAQEVS
epito pe5AAAAAACTTTTAGTAAGAGGTCTTTACAGAATTTCTTT CACTACCTACMACCAKKLLVRGLYRISFTTYKP
實施例3.工程菌pET28a-21mp/BL21的誘導表達將pET28a-21mp轉入大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)中進行目的蛋白的表達。 具體為挑取pET28a-21mp的單克隆接種到3ml的LB培養基中，37 °C， 220 rpm 震蕩過夜培養；將培養的菌液以1:100的比例重新接種到3 ml LB培養基中， 37 °C， 220 rpm震蕩培養3 h，加入終濃度為1 mM的IPTG， 37 °C ， 220 rpm 誘導4h，離心收集菌體沉澱；將沉澱重懸於1XPBS緩衝液中，進行超聲波破 碎，4 。C離心後，分別取上清和沉澱進行SDS-PAGE分析，在約22kD處出現特 異性表達帶，與預期分子量吻合，且目的蛋白主要以可溶性形式存在。(圖2)。
實施例4.重組多表位肽的純化
將重組多表位肽在優化條件下進行大量表達，即將表達2LMP較高的大腸杆 菌菌株接種到含100 " g/ml卡那黴素的20 ml LB新鮮培養基中，37 °C ， 220 rpm 震蕩過夜培養；將培養的菌液以1:100的比例重新接種到1000 ml LB培養基中， 37 °C， 220 rpm震蕩培養3 h，加入終濃度為1 mM的IPTG， 37 °C， 220 rpm 誘導4 h，離心收集菌體沉澱；將沉澱重懸於20 ml的NTA-0 buffer (20 mM Tris-HC1 (pH 7.9)， 500 mM NaCl， 10% Glycerol)中，進行超聲波破碎，然後 離心收集上清；將上清與4ml提前用NTA-0buffer平衡的Ni-NTA樹脂在4 °C 輕輕混勻，然後加入到層析柱中；分別用NTA-0、 NTA-20、 NTA-60、 NTA_100、 NTA-IOO。 buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,9)， 500 mM NaCl，咪唑的濃度分別 為20 mM、 60 mM、 100 mM、 1000 mM)衝洗樹脂並收集流出液體；對收集液體透 析後進行SDS-PAGE分析(圖2)，根據電泳結果透析高目的蛋白含量的液體然後 80 t:保存。
實施例5.純化後2LMP的免疫活性
將純化的2LMP與鉤端螺旋體免疫兔血清進行Western Blot分析，結果顯 示重組多表位肽與鉤端螺旋體免疫兔血清在約23 kD處有一特異性反應條帶(圖3)。
實施例6. ELISA間接法檢測鉤端螺旋體菌IgM抗體
取待檢血清樣品1 1，加入已包被有融合多表位肽抗原的酶標板中，37 °C 孵育30-60 miri，每塊板設三孔陰性對照，二孔陽性對照， 一孔空白對照。孵育 結束後，棄去板孔中的液體，用洗滌液洗板3-5次，扣幹。加入抗人IgM酶標 抗體，充分混勻，37 'C孵育30-60 min。同上洗板後，加入顯色液O. lml，輕拍混勻，37 。C避光顯色5-15min。每孔加入終止液一滴，輕拍混勻，用450 nm
波長酶標儀測讀OD值，判定結果，見表2。
表2: 利用ELISA方法檢測鉤體病人血清中IgG和IgM抗體。
血清群樣品IgM (+/ -)IgG(+/-)
黃疸出血群5454/054/0
秋季群88/08/0
流感傷寒群2222/022/0
澳洲群18簡18/0
七日熱群1515/015/0
波摩那群2828/028/0
犬群1111/011/0
當450nm波長測得的吸光值大於對照吸光值兩倍時，認為該樣品為陽性(+ )。
實施例7. ELISA間接法檢測鉤端螺旋體菌IgG抗體
取待檢血清樣品1 ix 1，加入已包被有融合多表位肽抗原的酶標板中，37 °C 孵育30-60 min，每塊板設三孔陰性對照，二孔陽性對照， 一孔空白對照。孵育 結束後，棄去板孔中的液體，用洗滌液洗板3-5次，扣幹。加入抗人IgG酶標 抗體，充分混勻，37 。C孵育30-60 min。同上洗板後，加入顯色液O. lml，輕 拍混勻，37 。C避光顯色5-15min。每孔加入終止液一滴，輕拍混勻，用450 nm 波長酶標儀測讀OD值，判定結果，見表2。
實施例8:利用多表位肽抗原快速檢測抗鉤體抗體試紙條的設計
如圖4 (a)所示該試紙條包括一固定在塑料支架上的纖維素膜。頂端的陰 影部分為吸收墊，檢測條帶T (用實線表示)表示重組多表位抗原肽被固定的位 置，對照條帶C (用虛線表示)表示兔抗重組多表位肽血清(用V表示)。條帶下 方為混有金標重組多表位肽(用星狀圖表示)的檢測血清，如果抗鉤體IgM抗 體(用^表示)存在的情況下，則與金標重組多表位肽形成複合物使膠體金顆粒 顏色變化便可直接判斷檢測結果。左側的虛線箭頭表示檢測過程中樣本進入的方向。
圖4 (b)為實際檢測效果圖。左側為沒有抗鉤體IgM抗體的檢測結果；右 側為有抗鉤體IgM抗體的檢測結果。
權利要求
1. 一種運用重組多表位肽蛋白進行鉤端螺旋體感染檢測的方法。其特徵在於，採用鉤端螺旋體外膜蛋白優勢抗原決定簇的重組多表位肽為檢測抗原構建試劑盒或試紙條，檢測鉤端螺旋體抗體IgM或IgG。
2. 根據權利要求1所述的一種運用重組多表位肽蛋白進行鉤端螺旋體感染檢測的方法，其特徵在於，它包括以下步驟(1) 篩選鉤端螺旋體外膜蛋白OmpLl、 LipL21和LipL32的優勢抗原表位；(2) 根據篩選的表位序列及表達系統的偏愛性，人工合成DNA序列並採用基因 工程手段獲得目的蛋白的編碼基因；(3) 將合成的基因片段克隆到表達載體中並構建表達該目的蛋白的表達系統；(4) 根據表達系統的特點選用一定的純化方法提純目的蛋白並獲得高純度的# 口 廣叩？(5) 對所述步驟(4)獲得的重組蛋白進行SDS-PAGE分析，確定具有22kD分 子量的特定蛋白存在；對目標蛋白進行Western Blot分析，確定所獲得 蛋白的免疫反應性。(6) 以獲得的重組蛋白為抗原，構建ELISA檢測試劑盒或試紙條，檢測目標樣 品中抗鉤體IgG或IgM的存在情況而實現對鉤體病人的檢測。
3. 根據權利要求1所述的一種運用重組多表位肽蛋白進行鉤端螺旋體感染檢 測的方法，其特徵在於，所述的目標樣品為人或動物的血清、腦脊液等所有 已經脫離人體或動物體的體液樣品。
4. 權利要求1所述的一種運用重組多表位肽蛋白進行鉤端螺旋體感染檢測的方 法，其特徵在於，所述的用於鉤端螺旋體感染檢測的方法是在體外進行的。
全文摘要
本發明公開了一種運用重組多表位肽蛋白進行鉤端螺旋體感染檢測的方法，是將鉤端螺旋體主要外膜蛋白OmpL1、LipL21和LipL32的優勢T細胞和B細胞抗原表位串連後，亞克隆到表達載體並轉化大腸桿菌構建工程菌，經IPTG誘導高效表達，表達菌的超聲裂解上清純化後包被微孔板，構建抗體檢測ELISA試劑盒，同樣地將上述純化的重組抗原點樣NC膜上，構建膠體金檢測試紙條。檢測抗體是鉤體病人血清中的IgG或IgM。本發明可用於檢測能在人類和其它動物體內引起疾病的鉤端螺旋體感染，包括具有獸醫學重要性的那些鉤端螺旋體的感染。
文檔編號G01N33/569GK101419236SQ200810120368
公開日2009年4月29日 申請日期2008年8月28日 優先權日2008年8月28日
發明者傑 嚴, 林旭璦, 寅 陳 申請人:浙江大學