用於檢測可溶性pdcd5蛋白的elisa方法和試劑盒的製作方法

2023-09-11 05:30:55 1

專利名稱：用於檢測可溶性pdcd5蛋白的elisa方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫學和生物技術領域，涉及一種用於檢測可溶性PDCD5蛋白的 ELISA方法和試劑盒。該方法和試劑盒可用於自身免疫性疾病、各種炎症、腫瘤等病人的體 液樣品中PDCD5蛋白的檢測，基礎研究中各種生物學樣品(如細胞培養上清液、細胞溶解 液)中的PDCD5蛋白的檢測，以及來源於動物模型的生物學樣品中PDCD5蛋白的檢測。
背景技術：
TFAR19 (TF-1 cell apoptosis-related gene 19)是一種新的程序性細胞死亡 調控基因，2002年國際人類基因命名委員會將其命名為PDCD5 (programmed cell death 5)。該基因進化保守，表達廣泛，其編碼的PDCD5蛋白由125個胺基酸組成，主要定位於細 胞質和核內。前期的功能研究證明PDCD5能夠促進多種腫瘤細胞凋亡，是一種潛在的新的 抑癌基因，其效應機制是通過結合組蛋白乙醯轉移酶Tip60發揮促進腫瘤細胞凋亡的作用 (中國專利 98101869. 6 ;Biochem Biophy Res Comm，1999，254 :203-210 ；Neoplasia, 2009, 10(4) :345-354) 目前，國內外已有多家實驗室利用不同技術發現PDCD5的表達異常與多種疾病 的發生、發展有關。大量的研究報告證明PDCD5在腫瘤細胞中的表達明顯低於正常細胞， 如肝癌(Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98 (26) 15089-15094 ；世界華人消化雜誌，2008， 16(16) :1820-1824 ；中國普通外科雜誌，2008，17 (7) :721-724)、乳腺癌(N Engl J Med, 2001,344 (8) :539-548 ；Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101 (52) :18147-18152)、卵巢上 皮性癌(中國婦產科臨床雜誌，2002，3 (3) 164-167)、口腔鱗癌(北京大學學報(醫學版)， 2005，37 (4):似9-432)、肺癌(J Clin Oncol，2006，24 (11) :1672-1678)、胃癌(Apoptosis, 2006，11 (6) :993-1001)、多發性骨髓瘤(現代醫藥衛生，2007 (21) :3184-3187)、腎透明細 胞癌(南方醫科大學學報，2006，沈(6) =805-809 ；2006, 26 (9) :1316-1318)以及腦膠質瘤 (Oncol Rep. 2008,20(3) :573-579 ；中國臨床神經外科雜誌，2008 年，13 (10) :611-613)等。 其中，PD⑶5的表達與卵巢上皮性癌的FIGO分期、組織學分級、病理類型密切相關。隨FIGO 分期與組織學分級的升高，PD⑶5的表達下調；PD⑶5的低表達還與胃癌和腎透明細胞癌的 不良預後密切相關。還證實了急性髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)病人比慢 性粒細胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia, CML)病人表達更少的PDCD5蛋白，CML病人 尤其是加速/急變期的CML病人，PD⑶5表達量與BCR-ABL表達量呈負相關(北京大學學 報(醫學版)，2002，34 (6) :676-679 ；Leuk Res. 2006，30 (9) :1159-1165)。此外，PD⑶5的異常表達也參與某些自身免疫性疾病和炎症等過程，如系統性紅 斑狼瘡(SLE)(中國病理生理雜誌，2003，19 O) :189-193 ；中華風溼病學雜誌，2002，6 (5) 328-330)、狼瘡性腎炎(臨床兒科雜誌，2003，21 (10) =607-609)、銀屑病(中華皮膚科雜誌， 2004，37 :215-217)、骨關節炎(北京大學學報(醫學版)，2003，35 (5) :481-484)、類風溼性 關節炎(APOPTOSIS, 2007 ； 12 (8) :1433-1441 ；中國生物化學與分子生物學報，2008二4 (6) 563-568 ；中國組織工程研究與臨床康復，2008年(24) :4667-4671)、老年性白內障(眼科研究，2002，20(6) :514-516)、多囊卵巢症候群(PCOS)(北京大學學報(醫學版)，2005， 37(5) =476-479)以及慢性心力衰竭(中華醫學雜誌，2005，85 (10) :676-678)等。上述研究主要是採用免疫組化、免疫螢光以及RT-PCR技術檢測正常人或疾病 狀態下組織細胞內PD⑶5的mRNA和蛋白質表達水平，或者採用間接酶聯免疫吸附實驗 (Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血液中 PDCD5 自身抗體的水平。其 中，間接酶聯免疫吸附實驗是將PDCD5抗原吸附到ELISA酶標板上，加入病人血清標本，再 加入辣根過氧化物酶標記的抗人IgG，最後加入酶底物顯色。根據顏色的深淺判斷PDCD5 自身抗體的水平。這個方法只能檢測PDCD5抗體，一般應用在疾病的晚期，不能準確代表體 內PDCD5的蛋白水平，因為抗原的出現要早於抗體的產生，因此該方法僅可以檢測PDCD5抗 體，而檢測不到PD⑶5抗原。最近日本學者在對弓形蟲PDCD5(TgPDCD5，^Toxoplasma gondiiProgrammed Cell Death 5)的研究中發現，弓形蟲的PDCD5蛋白存在分泌形式，其在弓形蟲感染的宿主細 胞的凋亡中起著重要的作用(Mol BiochemParasitol. 2008 ； 159 (2) :112-120 ;J Vet Med Sci. 2009 Sep ；71 (9) :1183-1189) 人類的PDCD5蛋白是否存在分泌形式國內外還未見報 道。鑑於PDCD5在腫瘤、自身免疫性疾病以及炎症等病人的組織細胞中的表達異常，因而 有必要開發檢測實驗室或臨床生物樣品中可溶性PDCD5蛋白的試劑盒，從而有望將可溶性 PDCD5蛋白作為一種新的生物標記，為疾病的診斷、病程判斷、療效觀察、指導用藥及預後提 供一種輔助檢測手段，也為進一步研究PDCD5蛋白的功能奠定基礎。

發明內容
本發明的目的在於提供一種用於檢測可溶性PD⑶5蛋白的抗體夾心ELISA方法， 實驗結果表明採用該方法能夠檢測臨床病人的血清、血漿、尿液、胸腹水、關節液、腦脊液、 羊水等體液中的可溶性PDCD5蛋白，同時也可用於基礎研究中檢測各種生物學樣品(如細 胞培養上清液、細胞溶解液)中的可溶性PDCD5蛋白，以及用於檢測來自動物模型的生物學 樣品中的可溶性PD⑶5蛋白。本發明的目的還在於提供一種用於檢測可溶性PD⑶5蛋白的抗體夾心ELISA試劑 盒。本發明製得的ELISA試劑盒為PDCD5的基礎研究和臨床應用研究提供了有利的工具。用於實現上述目的的技術方案如下一種用於檢測可溶性PDCD5蛋白的ELISA方法，該方法包括以下步驟(1)將待測樣品與負載PDCD5蛋白第一抗體的固體載體相接觸；(2)加入能夠與檢測標記結合的PD⑶5蛋白第二抗體；(3)加入檢測標記，檢測被結合的檢測標記。在上述方法中，待測樣品可以為血清、血漿、尿液、胸腹水、關節液、腦脊液、羊水、 細胞培養上清液或細胞溶解液。優選地，上述方法包括如下步驟先以系列包含已知濃度的可溶性PD⑶5蛋白的 溶液替代待測樣品重複步驟(1)至(3)，繪製標準曲線；再以待測樣品重複步驟(1)至(3)， 並根據標準曲線得出待測樣品中可溶性PDCD5蛋白的濃度。在上述方法中，優選地，PD⑶5蛋白第一抗體為PD⑶5蛋白的單克隆抗體，例如鼠 抗人PDCD5蛋白的單克隆抗體。
在上述方法中，優選地，PD⑶5蛋白第二抗體為PD⑶5蛋白的多克隆抗體，例如兔 抗人PDCD5蛋白的多克隆抗體。在上述方法中，檢測標記可以為酶、螢光或同位素。本發明還提供了一種用於檢測可溶性PD⑶5的ELISA試劑盒，該試劑盒包括用於捕獲待測樣品中的可溶性PD⑶5蛋白的PD⑶5蛋白第一抗體；能夠與檢測標記結合的PD⑶5蛋白第二抗體；系列包含已知濃度的可溶性PD⑶5蛋白的溶液；檢測標記；檢測檢測標記的工具。在上述ELISA試劑盒中，優選地，PD⑶5蛋白第一抗體為PD⑶5蛋白的單克隆抗體， 例如鼠抗人PDCD5蛋白的單克隆抗體。在上述ELISA試劑盒中，優選地，PD⑶5蛋白第二抗體為PD⑶5蛋白的多克隆抗體， 例如兔抗人PDCD5蛋白的多克隆抗體。在上述ELISA試劑盒中，優選地，檢測標記可以為酶、螢光或同位素。檢測檢測標 記的工具可以為檢測酶、螢光或同位素的工具。具體地，本發明的檢測可溶性PD⑶5蛋白的ELISA方法包括下述步驟(1)收集各種生物樣品，包括各種病人或正常人的體液標本，細胞培養上清液或細 胞裂解液。(2)標準品的稀釋與加樣在鼠抗人PDCD5蛋白的單克隆抗體包被板上設PDCD5 蛋白標準品孔16孔，從200ng/ml開始稀釋，連續稀釋8個濃度200ng/ml，100ng/ml, 50ng/ ml，25ng/ml，12. 5ng/ml，6. 25ng/ml，3. 125ng/ml，l. 56ng/ml,每個標準品設 2 個重複孔， 0. Iml/孔，置37°C下溫育45-60分鐘。(3)加待測樣品採用鼠抗人PDCD5蛋白的單克隆抗體包被板，0. Iml/孔，同時設 空白對照(空白對照孔不加樣品，其餘各步操作相同)，置37°C下溫育45-60分鐘。(4)洗滌棄去上述孔板中的液體，甩幹，每孔加0. 2ml洗滌液洗滌，如此重複3 次，拍幹。(5)加PD⑶5多抗加入用樣品稀釋液稀釋的兔抗人PD⑶5多克隆抗體(1 μ g/ ml)，0. Iml/孔，置37°C下溫育45-60分鐘。(6)洗滌棄去液體，甩幹，每孔加0. 2ml洗滌液洗滌，如此重複3次，拍幹。(7)加辣根過氧化物酶(HRP)-標記的抗兔抗體加入用樣品稀釋液稀釋的該酶標 二抗(0. 2-0. 5 μ g/ml)，置 37°C 下溫育 45-60 分鐘。(8)洗滌棄去液體，甩幹，每孔加0. 2ml洗滌液洗滌，如此重複3次，拍幹。(9)顯色3，3' ,5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)顯色液，0. Iml/孔，輕輕震蕩混勻， 37°C下避光顯色10 15分鐘。(10)終止每孔加終止液50 μ 1，終止反應。(11)測定以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應在 加終止液後15分鐘以內進行。(12)描繪標準曲線，計算濃度。以OD值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標，繪出標 準曲線，並得出回歸方程式。將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度。
本發明的抗體夾心ELISA方法的基礎是抗體的固相化及抗體的酶標記，即結合在 固相載體表面的抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗體既保留其免疫學活性，又保留酶 的活性。例如，受檢標本與固相載體表面的抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成 的抗原抗體複合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗體，通過反應也結合在固 相載體上。加入酶反應的底物後，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質 的量直接相關，根據呈色的深淺進行定性或定量分析。酶的催化效率很高，間接地放大了免 疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度，這種抗體夾心ELISA可應用於微量可溶性 PD⑶5抗原蛋白的檢測。基於上述研究，本發明利用上述ELISA方法和試劑盒成功檢測到了包括人的哺乳 動物的生物學樣品中的可溶性PDCD5蛋白。各種病人和正常人血清中可溶性PDCD5蛋白表 達的檢測結果證明多發性硬化症病人血清中PD⑶5蛋白的水平比正常人高2. 5倍以上； 肝炎病人血清中PD⑶5蛋白的水平比正常人高4倍以上；甲型流感病人血清中PD⑶5蛋白 的水平比正常人高4倍以上；在骨髓瘤和慢性粒細胞白血病病人血清中PDCD5蛋白的水平 略低於正常人，其差異具有顯著性(P < 0. 05)；類風溼關節炎病人血清中PD⑶5蛋白的水 平顯著高於正常人，其差異具有顯著性(P < 0. 05)；系統性紅斑狼瘡病人血清中PD⑶5蛋 白的水平高於正常人，其差異具有顯著性(P < 0. 05)。將上述方法和試劑盒用於檢測血漿、 血清、尿、腦脊液、關節液中的PDCD5蛋白水平，為自身免疫疾病、各種炎症(如肝炎)以及 腫瘤等疾病的診斷、病程判斷、療效觀察，指導用藥及預後提供了一種新的輔助檢測方法。 該檢測方法及其試劑盒取樣方便，操作簡單，靈敏度和準確性更高，更有利於推廣應用。


圖1顯示了 ^festern Blot檢測兔抗人PD⑶5蛋白多克隆抗體與PD⑶5蛋白的反 應性，1 :PDCD5h25 ；2 :PDCD527_125 ；3 :PDCD520_104 ；4 :PDCD534_1M。圖2顯示了 Wfestern Blot檢測鼠抗人PD⑶5蛋白單克隆抗體與PD⑶5蛋白的反 應性，1 :PDCD5h25 ；2 :PDCD5 34-125 ；3 :PDCD\0_125 ；4 :PDCD527_125 ；5 :PDCD5H12。圖3顯示了抗體夾心ELISA方法檢測PD⑶5蛋白的結果；圖4顯示了抗體夾心ELISA方法檢測正常人和多發性硬化症病人血清中PD⑶5蛋 白的結果；圖5顯示了抗體夾心ELISA方法檢測正常人和肝炎病人血清中PD⑶5蛋白的結 果；圖6顯示了抗體夾心ELISA方法檢測正常人和甲型流感病人血清中PD⑶5蛋白的結果。圖7顯示了抗體夾心ELISA方法檢測正常人和類風溼關節炎病人血清中PD⑶5蛋 白的結果。圖8顯示了抗體夾心ELISA方法檢測正常人和系統性紅斑狼瘡病人血清中PD⑶5 蛋白的結果。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。實施例1兔抗人PDCD5 _m蛋白多克隆抗體的製備步驟1 動物免疫M 100 μ g/ml 純化的重組 PDCD534_1M 蛋白(Archives of Biochemistry andBiophysics,486(2) :141-149)與等量弗氏完全佐劑(Complete Freund' sAdjuvant, Sigma公司產品)混合，充分乳化後採用背部多點注射法免疫家兔。2周後同劑量(100 μ g/ ml)純化的重組？00)534_仍蛋白加弗氏不完全佐劑ancomplete Freund's Adjuvant, Sigma 公司產品)同法加強免疫。以後每兩周免疫一次(採用100μ g/ml純化的重組？000534,5蛋 白+等量弗氏不完全佐劑)，全程共免疫3次，末次免疫後7天於耳緣靜脈取血，間接ELISA 檢測血清中兔抗人PDCM34J蛋白多克隆抗體的效價，然後心臟取血，收集血清，-20°C凍 存。步驟2 兔抗人PD⑶\4_125蛋白多克隆抗體的純化間接ELISA方法測定兔血清中抗人蛋白多克隆抗體效價為5X 105，將 該血清用HiTrap Protein G(為Amersham Pharmacia Biotech公司產品)親和層析的方 法(按說明書操作)純化兔抗人PDCD5蛋白的多克隆抗體。將純化的抗體進行SDS-PAGE 電泳，按常規方法進行(分離膠濃度為12. 5%，濃縮膠濃度為4. 5% )，鑑定其抗體純度為 90%以上，純化的抗體放_30°C下保存備用。步驟3 :兔抗人PD⑶\4_125蛋白多克隆抗體與PD⑶5蛋白的反應性Western Blot免疫印跡實驗檢測兔抗人PDCM34_1M蛋白多克隆抗體與PDCD5蛋白 的結合反應。將純化的重組 PDCD5 蛋白(PDCD5H，PDCD\7_125，PDO^2chiq4, PDCM34_125)進 行15% SDS-PAGE電泳，按常規方法在Bio-Rad電轉移系統中將凝膠蛋白帶轉移到硝酸纖維 素膜上(Schleicher & Schuell公司產品)，用5%脫脂奶粉在4°C下封閉過夜，加入兔抗 人PD⑶\4_125蛋白多克隆抗體室溫下反應1小時，洗滌三次，每次5-10分鐘。將膜與Alexa Fluor 780-標記的抗兔IgG螢光抗體室溫下避光孵育1小時。洗膜三次，每次5_10分鐘。 固定於膜上的可被紅外線激發的螢光團在780nm激發光的作用下，其波長為820nm的發射 光可被 LI-COR 紅外成像系統(LI-C0R Infrared Imaging System, Odyssey, Lincoln, NE) 的信號檢測器檢測到，所得信號可經Odyssey公司提供的軟體進行分析。結果如圖1所示， 兔抗人PDCD534_1M蛋白多克隆抗體能與PDCD534_1M肽段發生特異反應，說明該多抗能夠識別 胺基酸序列；34位後的PD⑶5蛋白。實施例2鼠抗人PD⑶5蛋白單克隆抗體與PD⑶5蛋白的反應性鼠抗人PD⑶5單克隆抗體的製備參見文獻(中國醫學科學院學報，2000，22(6) 502-504)。Western Blot免疫印跡實驗檢測鼠抗人PDCD5蛋白單克隆抗體與PDCD5蛋白結 合反應反應步驟同實施例1的步驟3。結果如圖2所示，鼠抗人PDCD5蛋白單克隆抗體能 與PD⑶5多肽的N端發生特異反應，與片段不發生特異反應。實施例3雙抗體夾心ELISA方法的建立1、包被將鼠抗人PD⑶5單抗用pH9. 0,0. 5M的碳酸鹽緩衝液稀釋到1 μ g/ml，加 到96孔ELISA板中，0. Iml/孔，置4°C下反應24小時。2、洗滌棄去液體，甩幹，每孔加0. 2ml含0. 05% Tween20的PBS洗滌液洗滌，重
復3次，拍幹。
3、封閉將含0. 05% Tween20和3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS，加到包被過的 ELISA板中，0. 15ml/孔，37°C下反應2小時或封閉過夜。4、洗滌棄去液體，甩幹，每孔加0. 2ml含0. 05% Tween20的PBS洗滌液洗滌，重
復3次，拍幹。5、標準品的稀釋與加樣在鼠抗人PD⑶5單抗包被的板上設PD⑶5蛋白標準品孔 16 孔，從 200ng/ml 開始稀釋，連續稀釋 8 個濃度，200ng/ml，100ng/ml, 50ng/ml, 25ng/ml, 12. 5ng/ml，6. 25ng/ml，3. 125ng/ml, 1. 56ng/ml,每個標準品設 2 個重複孔，0. Iml/ 孔，置 37°C下溫育45-60分鐘。6、加待測樣品鼠抗人PD⑶5單抗包被的板，0. Iml/孔，每個樣品設2個重複孔。 同時設空白對照(空白對照孔不加樣品，其餘各步操作相同)，置37°C下溫育45-60分鐘。7、洗滌棄去液體，甩幹，每孔加0. 2ml含0. 05% Tween20的PBS洗滌液洗滌，重 復3次，拍幹。8、加PD⑶534_1M多抗加入用樣品稀釋液(即PBS，0. 15Mol/L，pH 7. 4的磷酸 鹽緩衝液，配方為=KH2PO4 0. 2g，Na2HPO4 · Iffl2O 2. 9g，KCl 0. 2g，NaCl 8. Og，加蒸餾水至 IOOOmL)稀釋的兔抗人PDCD534_125多克隆抗體(1 μ g/ml)，0· lml/孔，置37°C下溫育45-60 分鐘。9、洗滌棄去液體，甩幹，每孔加0. 2ml含0. 05% Tween20的PBS洗滌液洗滌，重
復3次，拍幹。10、加辣根過氧化物酶(HRP)-標記的抗兔二抗加入用樣品稀釋液稀釋的該酶標 二抗(0. 2-0. 5 μ g/ml)，置 37°C 下溫育 45-60 分鐘。11、洗滌棄去液體，甩幹，每孔加0. 2ml含0. 05% Tween20的PBS洗滌液洗滌，重
復3次，拍幹。12、顯色3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)顯色液，0. Iml/孔，輕輕震蕩混勻， 37°C下避光顯色10 15分鐘。13、終止每孔加終止液50 μ 1，終止反應。14、測定以空白孔調零，450nm波長下依序測量各孔的吸光度(0D值)。測定應在 加終止液後15分鐘以內進行。15、描繪標準曲線，計算濃度。以OD值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標，繪出標 準曲線，並得出回歸方程式。將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度。實施例4抗體夾心ELISA方法檢測PDCD5蛋白將PDCD5蛋白(北京大學學報(醫學版)，2003，34 (4) =360-363)倍比稀釋，從 200ng/ml 開始稀釋，連續稀釋 8 個濃度，200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml ,12. 5ng/ ml, 6. 25ng/ml，3. 125ng/ml，l. 56ng/ml，每個樣品設3個重複孔，0. lml/孔，採用實施例3建 立的ELISA方法重複檢測三次，結果相似，如圖3所示，PDCD5與抗體的反應具有良好濃度 依賴關係，檢測區間為lng/ml-200ng/ml。實施例5ELISA方法檢測正常人和多發性硬化症病人血清中的PD⑶5蛋白分別收集8例正常人(Normal)血清和10例多發性硬化症(Multipl必clerosis， MS)病人的血清，用樣品稀釋液進行1 10稀釋，採用實施例3建立的ELISA方法進行操 作。通過標準曲線計算樣品中可溶性PDCD5蛋白的含量，統計學處理用t檢驗。結果如圖4所示，10例多發性硬化症病人血清中PD⑶5蛋白含量為47. 39士22. 323ng/ml，8例正常人 血清中PD⑶5蛋白含量為20. 49 士 13. 32ng/ml，多發性硬化症病人血清中PD⑶5蛋白含量顯 著高於正常人，差異具有統計學意義(P < 0. 01)。實施例6ELISA方法檢測正常人和肝炎病人血清中的PD⑶5蛋白分別收集42例正常人血清和118例肝炎病人的血清，用樣品稀釋液進行1 10稀 釋，採用實施例3建立的ELISA方法進行操作。通過標準曲線計算樣品中可溶性PDCD5蛋白 的含量，統計學處理用t檢驗。結果如圖5所示，118例肝炎病人血清中PDCD5蛋白的平均 含量為84. 85士09ng/ml，42例正常人血清中PDCD5蛋白的平均含量為20. 35士 12. 35ng/ ml，肝炎病人血清中PD⑶5蛋白含量顯著高於正常人，差異具有統計學意義(ρ < 0. 0001)。實施例7ELISA方法檢測正常人和甲型流感病人血清中的PD⑶5蛋白分別收集42例正常人血清和12例甲型流感病人的血清，用樣品稀釋液進行 1 10稀釋，採用實施例3建立的ELISA方法進行操作。通過標準曲線計算樣品中可溶 性PDCD5蛋白的含量，統計學處理用t檢驗。結果如圖6所示，12例甲型流感病人血清中 PD⑶5蛋白的平均含量為87. 28 士 58. 92ng/ml，42例正常人血清中PD⑶5蛋白的平均含量為 20. 35士 12. 35ng/ml,甲型流感病人血清中PD⑶5蛋白的含量顯著高於正常人，差異具有統 計學意義(P < 0. 0001)。實施例8ELISA方法檢測正常人和類風溼關節炎病人血清中的PD⑶5蛋白分別收集20例正常人血清和20例類風溼關節炎病人的血清，用樣品稀釋液進行 1 10稀釋，採用實施例3建立的ELISA方法進行操作。通過標準曲線計算樣品中可溶性 PDCD5蛋白的含量，統計學處理用t檢驗。結果如圖7所示，20例類風溼關節炎病人血清中 PDCD5蛋白的平均含量為26. 94士沈.12ng/ml,20例正常人血清中PDCD5蛋白的平均含量 為14.觀士3. 23ng/ml，類風溼關節炎病人血清中PD⑶5蛋白的高於正常人，差異具有統計 學意義(P < 0. 05)。實施例9ELISA方法檢測正常人和系統性紅斑狼瘡病人血清中的PD⑶5蛋白分別收集20例正常人血清和35例系統性紅斑狼瘡病人的血清，用樣品稀釋液進 行1 10稀釋，採用實施例3建立的ELISA方法進行操作。通過標準曲線計算樣品中可溶 性PDCD5蛋白的含量，統計學處理用t檢驗。結果如圖8所示，35例系統性紅斑狼瘡病人血 清中PD⑶5蛋白的平均含量為20. 84士 13. 89ng/ml,20例正常人血清中PD⑶5蛋白的平均 含量為14.觀士3. 23ng/ml，系統性紅斑狼瘡病人血清中PD⑶5蛋白的高於正常人，差異具 有統計學意義(P < 0. 05)。實施例10抗體夾心ELISA方法檢測孕、產婦羊水中的PDCD5蛋白收集不同時間的孕、產婦羊水80例，採用實施例3建立的ELISA方法進行操作，通 過標準曲線計算樣品中可溶性PDCD5蛋白的含量，結果總結見表1，80例羊水的PDCD5蛋白 含量為 3. 561 + 1. 068ng/ml (η = 80)。表1 抗體夾心ELISA方法檢測孕、產婦羊水中PD⑶5蛋白的結果(ng/ml)
權利要求
1.一種用於檢測可溶性PD⑶5蛋白的ELISA方法，該方法包括以下步驟(1)將待測樣品與負載PDCD5蛋白第一抗體的固體載體相接觸；(2)加入能夠與檢測標記結合的PDCD5蛋白第二抗體；(3)加入檢測標記，檢測被結合的檢測標記。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述待測樣品為血清、血漿、尿液、胸腹 水、關節液、腦脊液、羊水、細胞培養上清液或細胞溶解液。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟先以系列包 含已知濃度的可溶性PDCD5蛋白的溶液替代待測樣品重複步驟(1)至(3)，繪製標準曲線； 再以待測樣品重複步驟(1)至(3)，並根據標準曲線得出待測樣品中可溶性PDCD5蛋白的濃 度。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其特徵在於，所述PDCD5蛋白第一抗體為 PDCD5蛋白的單克隆抗體，例如鼠抗人PDCD5蛋白的單克隆抗體。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其特徵在於，所述PDCD5蛋白第二抗體為 PDCD5蛋白的多克隆抗體，例如兔抗人PDCD5蛋白的多克隆抗體。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其特徵在於，所述檢測標記為酶、螢光或 同位素。
7.一種用於檢測可溶性PD⑶5的ELISA試劑盒，該試劑盒包括用於捕獲待測樣品中的可溶性PDCD5蛋白的PDCD5蛋白第一抗體；能夠與檢測標記結合的PDCD5蛋白第二抗體；系列包含已知濃度的可溶性PD⑶5蛋白的溶液；檢測標記；檢測檢測標記的工具。
8.根據權利要求7所述的ELISA試劑盒，其特徵在於，所述PDCD5蛋白第一抗體為 PDCD5蛋白的單克隆抗體，例如鼠抗人PDCD5蛋白的單克隆抗體。
9.根據權利要求7或8所述的ELISA試劑盒，其特徵在於，所述PDCD5蛋白第二抗體為 PDCD5蛋白的多克隆抗體，例如兔抗人PDCD5蛋白的多克隆抗體。
10.根據權利要求7至9中任一項所述的ELISA試劑盒，其特徵在於，所述檢測標記為 酶、螢光或同位素。
11.根據權利要求7至10中任一項所述的ELISA試劑盒，其特徵在於，所述檢測檢測標 記的工具為檢測的酶、螢光或同位素的工具。
全文摘要
本發明提供一種用於檢測可溶性PDCD5蛋白的ELISA方法和試劑盒，該方法包括以下步驟(1)將待測樣品與負載PDCD5蛋白第一抗體的固體載體相接觸；(2)加入能夠與檢測標記結合的PDCD5蛋白第二抗體；(3)加入檢測標記，檢測被結合的檢測標記。本發明利用上述ELISA方法和試劑盒成功檢測到了包括人的哺乳動物的生物學樣品中的可溶性PDCD5蛋白。將上述方法和試劑盒用於檢測血漿、血清、尿、腦脊液、關節液中的PDCD5蛋白水平，為自身免疫病、各種炎症(如肝炎)以及腫瘤等疾病的診斷、病程判斷、療效觀察，指導用藥及預後提供了一種新的輔助檢測方法。該檢測方法及其試劑盒取樣方便，操作簡單，靈敏度和準確性更高，更有利於推廣應用。
文檔編號G01N33/68GK102135542SQ201010034529
公開日2011年7月27日 申請日期2010年1月21日 優先權日2010年1月21日
發明者宋泉聲, 張穎妹, 潘歡, 許蘭俊, 陳英玉, 馬大龍 申請人:北京大學