C-19位修飾的格爾德黴素衍生物及其製備方法
2023-09-16 02:09:10 1
專利名稱：C-19位修飾的格爾德黴素衍生物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及利用自發反應獲得一系列C-19位修飾的格爾德黴素衍生物及其製備方法。
背景技術：
格爾德黴素(geldanamycin，GDM)是一類苯安莎類抗生素，具有抗原蟲，抗腫瘤， 抗病毒以及免疫調節等多種生物活性[Sasaki K et al. J Antibiot (Tokyo) 1979，32 (8) 849-851]；[陶佩珍等，中國專利ZL97100523 ；中國抗生素雜誌，1997,22 :368-372]。近期發現，GDM還具有調節上皮氮氧合酶活性以及抗炎作用[Murphy P et al. Journal of Neuroscience Research, 2002,67 (4) :461-470]。其抗腫瘤活性機制是以熱休克蛋白 90(Hsp90)為靶向分子，通過競爭性地與Hsp90末端的ATP/ADP結構域結合，特異性地抑制 Hsp90與多種腫瘤相關蛋白的相互作用，降低蛋白穩定性，促進其降解，從而抑制腫瘤細胞生長信號通路[Whitesell L et al. Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 1994,91 :8324-8328] 但是，GDM還存在毒性大及水溶性差等缺點，由於水是人體的基本介質，藥物在吸收部位必須具有一定的水溶解度，藥物處於溶解狀態才能被吸收。水溶性差會影響其生物利用度，這些缺陷將限制其開發成為有效藥物。因此，尋找一種低毒性，水溶性好的衍生物，已成為深入研究的主要目標。目前，已有3個C-17位進行取代的GDM衍生物17-AAG，17-DMAG, IPI-504 進入臨床試驗[Heath EI et al. Clin Prostate Cancer, 2005,4 :138-141] ； [Ramanathan RK, et al. J Clin Oncol,2010,28(9) :1520-1526] ； [Oh WK, et al. Urology,2011,78 (3) 626-630]。在對GDM的毒副作用研究中發現，GDM的C-19位可以與穀胱甘肽的巰基自發連接， 形成複合物，暗示GDM的C-19位可以與某些重要蛋白的巰基進行自發連接，從而影響這些蛋白的正常功能。因此，GDM的C-19位是GDM的毒副作用的關鍵位點[Cysyk RL et al. Chem Res Toxicol, 2006,19 :376-381]。從理論上來說，C-19位修飾的GDM衍生物，能夠降低GDM 類抗生素的毒副作用。目前，通過化學合成以及生物修飾的方法，已經獲得了一些C-19位修飾的GDM衍生物。Schnur RC等人對GDM進行化學衍生，獲得了一系列C-19位取代的 ⑶M 衍生物，包括 19-Br-⑶M、19-CH = N-N[ (CH2) J2NCH3-⑶M、19-cyclopropylamino-⑶M、 19-azepine-GDMU-oxo-19-cyclized-N-methyl-tert-butylamine-GDM 等，但其對人乳腺癌細胞SKBR-3的IC50彡1500nM,對比GDM(IC50為70ηΜ)，活性有所降低[Schnur RC et al. J Med Chem, 1995，38 :3806-3812]。Shan GZ 等人在合成 C-17 修飾的 GDM 衍生物時，得到了一個 C-17，C-19 均引入一個基團的衍生物 17，19-di-(R)-THFM-17-demethoxy-⑶M，這個化合物抗HCV病毒活性較GDM以及只有C-17修飾的衍生物[17- (2 『 - (R) -THFM)-17-de methoxy-GDM]，大幅度減低，但其細胞毒性CC5tl也降低了數倍[Shan GZ et al. JAntibiot, 2011,64 :177-182] 本實驗室最近幾年從 Sti^ptomyces hygroscopicus 17997 及其 gdmP 變株中發現了 19-SCH3-⑶M、4，5-dihydro-19-SCH3-ffl)M、thiazino-GDM 以及 4， 5-dihydro-thiazino-GDM,這幾個化合物的生物活性雖然略遜於GDM，但其水溶性卻較GDM有明顯的提高[Liu X et al.J Antibiot，2011，64 :519-522] ； [Ni S et al. J Microbiol Biotechnol，2011，21(6) :599-603] ； [Lin L et al.Biosci Biotechnol Biochem，2011， 75(10) :2042-2045]。本發明的目的是利用GDM C-19位與巰基能自發反應形成衍生物的原理，有目的地選擇一些前體物，以期獲得具有活性、水溶性好、毒性低的衍生物。本發明利用GDM C-19位與巰基自發反應形成所述衍生物及其抗腫瘤用途，迄今尚未見有相關報導。
發明內容
1.提供了 11個C-19位修飾的GDM新衍生物及其製備方法，採用適當的溶劑如醇類、緩衝液等將GDM與含巰基的化合物在室溫避光條件下或在有氧及加入氧化劑的條件下進行反應。2、目標化合物的純化將形成的化合物進行濃縮，以醇類為反應溶劑時直接旋蒸，以緩衝液為反應溶劑時用乙酸乙酯提取後旋蒸，濃縮後溶於甲醇，經過製備HPLC獲得純品。3、目標化合物的結構鑑定經低分辨、高分辨質譜確定目標化合物的滷素含量、分子量和分子式，經過MS/MS， 1H-NMR以及重水交換確定化合物的結構。4、採用人肝癌細胞!feph MTT法實驗以及猴腎(Vero)細胞實驗，評價了目標化合物的抗腫瘤活性及毒性。5.、採用HPLC測定了這些衍生物在緩衝液中的溶解度。發明效果本發明通過GDM C-19位能與巰基進行自發反應，引入了 4個含滷的前體以及2個沒有滷素的前體，合成了 11個GDM衍生物。通過抗腫瘤活性、細胞毒性以及水溶性測試發現，這些化合物都具有一定的抗腫瘤活性，毒性比GDM低，且大部分衍生物的水溶性較GDM 提高數倍，顯示其有可能開發為臨床有應用前景的藥物。實施方案以下所列實施例是為幫助本領域技術人員更好地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。 GCP-I，GCP-2，GCP-X的製備及結構解析稱取50mg GDM(89ymol)於單口燒瓶中，加入20mL甲醇，室溫攪拌，得橙黃色懸濁液。加入3-氯-1-丙硫醇(Chloro-l-propanethiol，500ymol)，室溫下避光反應。48小時後待反應液為橙紅色，減壓蒸乾，溶於甲醇，用製備液相進一步分離純化。製備色譜用島津LC-10A色譜系統，色譜柱為ODS-C18 :150 X 20mm，流動相為40-100 %甲醇，30min梯度洗脫，流速 10mL/min，檢測波長為 254nm，304nm。在保留時間 RT 16. 2min、19. 9min禾Π 18. 4min 分別獲得純度達到90%以上的GCP-I約;3mg，GCP-2約10mg，GCP-X約15mg。進行ESI-MS， HRFAB-MS，1H-NMR 分析。GCP-I從ESI-MS中的分子離子峰693 [M+Na] +，和709 [M+K] +，推測其分子量為 670;且同位素峰695與693按1 3的比例存在，證實GCP-I中含有1個Cl原子。通過HRFAB-ESI-MS得出精確分子質量為693. 25780，推測其分子式為C32H47O9N2ClNaS,理論值為 693.25830。將GCP-I的1H-WR譜與GDM相比較，可以發現，在δ 6. 165處有2個氫信號， 並能被D2O交換後取代，證實GCP-I為氫醌型衍生物；在δ 1. 938，2. 045，2. 710，3. 579處多出了 6個氫信號，為串聯的3個亞甲基；且未檢測到在δ 7.2左右C-19位的氫原子。證實， GCP-I 的化學結構為 19- (3-氯丙硫)-氫醌 GDM (19- (3-Chloropropylthio) -hydroquinone -GDM)，與預期相符。GCP-I 的 1H-NMR 數據=1H-NMR(600 兆，CDCl3) δ (ppm) 0. 743 (bro,3H, CH3)；
1.142(bro,3H, CH3) ； 1. 259 (t，1H，J = 7. 2Hz) ； 1. 447 (bro, 1H) ； 1. 572 (m, 1H) ； 1.725 (s， 3H, CH3) ；1.938(m，2H) ；2. 045 (s, 1H) ；2. 143(s,3H, CH3) ；2. 612 (m, 1H) ；2. 710 (m, 1H)；
2.777 (m, 1H) ；2. 859 (m, 1H) ；3. 161 (bro, 1H) ；3. 339 (s, 6H, 20CH3) ；3. 410 (bro, 1H)； 3.579(m，2H) ；3.835(s，3H，OCH3) ；4.127(q，lH，J = 7. 2Hz) ；4. 623 (bro, 2H, CONH2)； 4. 953 (s，1H) ；5. 418 (bro, 1H) ；5. 497 (d, 1H, J = 8. 4Hz) ；6. 165 (s, 2H, 20H) ；6. 474 (t, 1H, J =11. 4Hz) ；8. 454 (bro, 1H, NH) GCP-X從ESI-MS中的分子離子峰655 [M+Na]+，和671 [M+K]+，推測其分子量為632 ； 且未檢測到Cl元素的同位素峰。通過HRFAB-ESI-MS得出精確分子質量為655.沈361，推測其分子式為C32H44O9N2NaS,理論值為655.沈597。從1H-NMR譜中可以發現，除了未檢測到C-19 位的H原子，也沒發現任何一個酚羥基的信號，而且沒有檢測到內醯環的NH，說明NH上的活潑氫攻擊游離的Cl原子，形成了環狀的結構。而1H-NMR譜的數據與預測的這個化合物完全相符,證明 GCP-X 的化學結構為 19，22-環-丙硫-GDM(19，22-cyclized-propylthio-GDM)。GCP-X 的 1H-NMR 數據=1H-WR(600 兆，CDCl3) δ (ppm) :0.633(d，3H，CH3, J = 6. 6Hz) ；1.046(d，3H，CH3, J = 6. 6Hz) ； 1. 241 (bro, 1H) ； 1. 368 (m, 1H) ；1.571(s，3H，CH3)； 1. 612 (m, 1H) ；1.965(s，3H，CH3) ；2. 157 (m, 1H) ；2. 182 (m, 1H) ； 2. 266 (m, 1H) ；2.314(s，lH， 0H) ；2. 450 (m, 1H) ；2. 463 (m, 1H) ；2. 626 (m, 1H) ；2. 836 (m, 1H) ；2. 870 (m, 1H) ；3. 120(s,3H, OCH3) ；3. 289 (s，3H，OCH3) ；3.392(s，3H，OCH3) ；3. 511 (m, 1H) ；3.544(m，2H) ；3. 992 (m, 1H)； 4. 534 (bro, 2H, CONH2) ；4. 998 (d, 1H, J = 10. 2Hz) ；5.161(m，lH) ；5. 178 (m, 1H) ；6.290 (t， 1H, J=Il. 4Hz) ；6. 390 (d, 1H, J = 12Hz)。GCP-2從ESI-MS中的分子離子峰691 [M+Na]+，和707[M+K]+，推測其分子量為 668;且同位素峰693與691按1 3的比例存在，證實GCP-2中含有1個Cl原子。通過 HRFAB-ESI-MS得出精確分子質量為691. M235，推測其分子式為C32H45O9N2ClNaS,理論值為 691. 242650 GCP-2與GCP-I相比，少了 2個氫，且GCP-2較GCP-I穩定，推測其為醌式衍生物。根據1H-NMR譜的數據證明，GCP-2的化學結構為19-(3-氯丙硫)-GDM(19-(3-Chlorop ropyIthiο)-⑶Μ)。以下列出了 GCP-2的各種化學圖譜的數據。GCP-2 的 1H-NMR 數據=1H-NMR(600 兆，CDCl3) δ (ppm) :0. 754(d，3H，CH3, J =6. 6Hz) ； 1.008(d，3H，CH3, J = 6. 6Hz) ； 1· 259 (t，1H，J = 7. 2Hz) ；1. 521 (bro, 1H)； 1.546(s，3H，CH3) ； 1. 629 (m, 1H) ；2. 024(s,3H, CH3) ；2. 044 (s, 1H) ；2.094(m，2H) ；2.472 (m， 2H) ；2. 515 (bro, 1H, 0H) ；2. 580 (m, 1H) ；3. 038 (m, 1H) ；3. 215 (s,3H, OCH3) ；3. 317 (m, 1H) ；3. 336 (s，3H，OCH3) ；3.595 (t，lH，J = 6Hz) ；3. 670 (m, 2H) ；4.059(s，3H，OCH3)； 4. 127 (m, 1H) ；4. 610 (bro, 2H, CONH2) ；5. 075 (d, 1H, J = 6. 6Hz) ；5. 434 (d, 1H, J = 7. 8Hz)；5. 496 (bro, 1H) ；6. 423(t，lH，J = 11. 4Hz) ；6. 640 (bro, 1H) ；7. 432 (bro, 1H, NH)。其中 GCP-I為淺橙色，GCP-2和GCP-X為橙紅色。其結構如式(1)所示。
權利要求
1. C-19位修飾的格爾德黴素GDM衍生物，其特徵是，所述衍生物是以格爾德黴素為起始，與含巰基的不同前體物，在溶劑中自發形成一組新的19-含硫衍生物，具體結構如下所示19-(3氟苯硫)-氫醌GDM19-(3-氟苯硫)-GDM19-(4-溴苯硫)-氫醌GDM
2.製備權利要求1所述衍生物的方法，其特徵是，19-(3-氯丙硫)-氫醌GDM、19- (3-氯丙硫)-GDM和19，22-環-丙硫-GDM的製備是，稱取⑶M，加入甲醇，室溫攪拌，加入 3-氯-1-丙硫醇，室溫下避光反應48小時，減壓蒸乾，溶於甲醇，用製備液相進一步分離純化，保留時間16、20和18分鐘，分別獲得淺橙色的19-(3-氯丙硫)-氫醌GDM、橙紅色的 19- (3-氯丙硫)-GDM和19，22-環-丙硫-GDM的純品。
3.製備權利要求1所述衍生物的方法，其特徵是，19-(3-氟苯硫)_氫醌GDM的製備是稱取GDM，加入甲醇，室溫攪拌，加入3-氯-1-氟苯硫酚，室溫下避光反應48小時，減壓蒸乾，溶於甲醇，用製備液相進一步分離純化，保留時間18分鐘獲得淺橙色的19-(3-氟苯硫)_氫醌GDM ；將所得19-(3-氟苯硫)-氫醌GDM在!^eCl3溶液中進行氧化，乙酸乙酯提取， 蒸乾，溶於甲醇，製備液相進一步分離，保留時間M分鐘，獲得橙紅色19-(3-氟苯硫)_GDM 的純品。
4.製備權利要求1所述衍生物的方法，其特徵是，19-(4-溴苯硫)-氫醌GDM的製備是， 稱取GDM，加入甲醇，室溫攪拌，加入4-溴苯硫酚，室溫下避光反應48小時，減壓蒸乾，溶於甲醇，用製備液相進一步分離純化，保留時間19分鐘，獲得橙紅色的19-(4-溴苯硫)-氫醌 GDM ；將所得19- (4-溴苯硫)-氫醌GDM在FeCl3溶液中進行氧化，乙酸乙酯提取，蒸乾，溶於甲醇，用製備液相進一步分離，保留時間25分鐘，獲得橙紅色19-(4-溴苯硫)_GDM的純
5.製備權利要求1所述衍生物的方法，其特徵是，19-(2,5-二氯苯硫)_氫醌GDM的19-(4-溴苯硫)-GDM 19-(2,5-二氯苯硫)-氫醌 GDM 19-(2,5-二氯苯硫)-GDM製備是，稱取GDM，加入甲醇，室溫攪拌，加入2，5- 二氯苯硫醇，室溫下避光反應48小時，減壓蒸乾，溶於甲醇，用製備液相進一步分離純化，保留時間20分鐘，獲得19-(2,5-二氯苯硫)_氫醌GDM ；將所得19-(2,5- 二氯苯硫)_氫醌GDM在FeCl3溶液中進行氧化，乙酸乙酯提取，蒸乾，溶於甲醇，用製備液相進一步分離，保留時間31分鐘，獲得19-(2,5-二氯苯硫)-GDM的純品。
6.製備權利要求1所述衍生物的方法，其特徵是，噻唑GDM的製備是，將GDM溶於甲醇， 加入磷酸緩衝液，室溫攪拌，加入半胱氨酸，室溫下避光反應48小時，乙酸乙酯提取，減壓蒸乾，溶於甲醇，用製備液相進一步分離純化，保留時間12分鐘，獲得噻唑GDM。
7.製備權利要求1所述衍生物的方法，其特徵是，19-(2-乙醯胺硫)-GDM的製備是， 將GDM溶於甲醇，加入磷酸緩衝液，室溫攪拌，加入2-巰基乙胺，室溫下避光反應48小時， 乙酸乙酯提取，減壓蒸乾，溶於甲醇，用製備液相進一步分離純化，保留時間14分鐘，獲得 19-(2-乙醯胺硫)-GDM。
8.權利要求1、2、3、4、5、6或7所述衍生物在製備抗肝癌藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及利用自發反應獲得一組C-19位修飾的格爾德黴素衍生物及其製備方法，所述衍生物是採用適當的溶劑如醇類、緩衝液等將GDM與含巰基的化合物在室溫避光或有氧及加氧條件下反應所得產物，通過抗腫瘤活性、細胞毒性以及水溶性測試發現，這些化合物都具有一定的抗腫瘤活性，毒性比GDM低，且大部分衍生物的水溶性較GDM提高數倍，顯示其有可能開發為臨床有應用前景的藥物。
文檔編號C07D225/06GK102391183SQ201110328550
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月26日 優先權日2011年10月26日
發明者倪四陽, 林靈, 王以光, 赫衛清 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所