高純度蚓激酶的製備方法及由其製備的藥物製劑的製作方法
2023-09-16 02:53:45 1
專利名稱：高純度蚓激酶的製備方法及由其製備的藥物製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及蚓激酶的製備方法，更具體地說，涉及高純度蚓激酶的製備方法和由其製備的可供口服、肌注及靜脈給藥的多種劑型的藥物製劑。
背景技術：
血栓性疾病的高發病率、高死亡率及高致殘率嚴重威脅人類的生存，溶栓性藥物是治療該病的首選用藥。目前臨床上使用的溶栓性藥物中普遍存在易引起出血的副作用；有的價格昂貴，一般百姓難以承受；有的穩定性較差，保存條件要求較高，給用藥者帶來很多不便；有的品種給藥方式單一，只有口服、或只有靜脈或肌肉注射，使用藥範圍受到很大限制。
蚯蚓在中藥中統稱為地龍，可分為雙胸蚓(Bimastos)、赤子愛勝蚓(Eisenia Foetida Sarigny)、鋸齒遠蚓(Amynthasdancataa)及參環毛蚓(廣地龍)等不同種屬，在我國早已被列入藥源，其中作為活血化瘀應用已有幾千年的歷史。研究表明，新鮮的蚯蚓體內含有多種蛋白酶類，其中一組具有強烈溶解纖維蛋白及血栓作用的絲氨酸蛋白酶由日本Mihara等於八十年代首次發現，命名為蚓激酶(Thromb Heamostas 1983，50258～263)，由此引起了國內外諸多學者的關注，開始了對蚓激酶從分離純化和理化性質到藥效學研究與臨床應用等方面的廣泛研究。大量的研究證實蚓激酶廣泛存在於不同種屬蚯蚓體內，是一組富含酸性胺基酸，等電點pl3～5，分子量20000～40000道爾頓，具有激酶和纖溶酶雙重功能的絲氨酸蛋白酶它既可類似纖溶酶直接降解纖維蛋白及纖維蛋白原，又類似尿激酶、鏈激酶等激活纖溶酶原形成纖溶酶，起到纖溶酶原激活劑的作用。蚓激酶的最大特點是穩定性好，纖溶活性強，藥理作用明顯，副作用小，可做成各種劑型的藥品，且來源廣泛，具有廣泛開發價值。近20年來，不少單位的研究人員都在力求將蚓激酶的研究推向實際應用，先後有各種各樣的分離純化技術問世，但是直到目前為止，還沒有一套成熟的製備高純度蚓激酶技術真正轉化為生產。
發明內容
本發明的目的在於提供一種高純度蚓激酶的製備方法，該方法的特點是得到的高純度蚓激酶的比活達到每毫克蛋白20萬單位以上；經高效液相色譜測試為單一組分；在SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳上呈現一條帶，分子量為32000±2000道爾頓；胺基酸序列分析，N-末端10個胺基酸序列為Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-Pro-Tyr本發明的再一個目的在於提供以高純度蚓激酶為原料藥製成的可供口服、肌注、以及靜脈注射與靜脈輸液多種途徑給藥的藥物製劑。
本發明公開一種高純度蚓激酶的製備方法，包括以下步驟(1)蚓激酶粗品的提取取鮮活蚯蚓用水洗淨，加入食鹽處理；加入pH6.8～8.3的緩衝液，用膠體磨製備勻漿；將勻漿液速凍，再融化；將勻漿液加熱，去除對熱不穩定的雜蛋白；將勻漿液離心，取上清液；上清液經超濾濃縮，截留分子量為10000～50000道爾頓的組分，冷凍乾燥即為蚓激酶粗品。
(2)蚓激酶粗品的純化將步驟(1)中的蚓激酶粗品溶於緩衝液中，離心，取上清液用離子交換層析分離，得到活性組分；(3)蚓激酶活性組分的再純化將步驟(2)中的蚓激酶活性組分用親和層析平衡緩衝液溶解，用單克隆抗體親合層析柱進行再純化，用緩衝液平衡至流出液在蛋白檢測儀上繪出穩定的基線後，再用含有洗脫劑的親和層析洗脫液洗脫，收集活性洗脫峰，冷凍乾燥得到高純度的蚓激酶。
本發明公開的高純度蚓激酶的製備方法中，蚯蚓包括雙胸蚓、赤子愛勝蚓、參環毛蚓或鋸齒遠蚓。
本發明公開的高純度蚓激酶的製備方法中，緩衝液為磷酸鹽緩衝液或三羥甲基氨基甲烷-鹽酸。
本發明公開的高純度蚓激酶的製備方法中，步驟(2)中離子交換層析採用羧甲基葡聚糖凝膠柱、二乙氨基葡聚糖凝膠柱或瓊脂糖凝膠柱層析，先用緩衝液平衡脫洗，再用含有0～0.5mol/LNaCl緩衝液進行梯度洗脫。
本發明公開的高純度蚓激酶的製備方法中，步驟(3)中單克隆抗體親和層析柱是由蚓激酶抗體偶聯到經過溴化氰活化處理的羧甲基葡聚糖凝膠、二乙氨基葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠的多糖基質上製得的。
本發明公開的高純度蚓激酶的製備方法中，蚓激酶抗體由如下步驟製備得到用高效液相色譜純化並經定性的蚓激酶與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對小鼠皮下注射免疫；取經免疫的小鼠脾B淋巴細胞懸液與鼠骨髓瘤細胞混合，加入分子量為40000～60000聚乙二醇作用後，將細胞混合液分別接種在多孔細胞培養板孔內；將接種細胞混合液的細胞培養板置於CO2培養箱內培養，按時間階段選擇不同的培養基；收集細胞分泌液，對單克隆抗體進行篩分得到穩定的蚓激酶抗體。
本發明公開的高純度蚓激酶的製備方法中，經免疫的小鼠脾B淋巴細胞懸液與鼠骨髓瘤細胞按5～10∶1的比例混合。
本發明公開的高純度蚓激酶的製備方法中，培養基的選擇按照第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養基，第5～10天改用HT培養基，10天後改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養基。
按照另一方面，本發明公開一種由上述方法製得的高純度蚓激酶，其比活達到每毫克蛋白20萬單位以上；經高效液相色譜測試為單一組分；在SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳上呈現一條帶，分子量為32000±2000道爾頓；胺基酸序列分析，N-末端10個胺基酸序列為Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-Pro-Tyr按照又一方面，本發明還公開了由本發明的高純度蚓激酶為原料藥製備的藥物製劑，其包含有治療有效量的本發明的高純度蚓激酶、藥學上可接受的藥用輔料。使用常用的藥物製劑的製備方法可以製成下列劑型的藥物製劑(1)蚓激酶口服腸溶劑(片劑、膠囊等)；(2)蚓激酶注射液；(3)注射用蚓激酶；(4)靜脈注射用蚓激酶；(5)凍幹靜脈注射用蚓激酶。
本發明公開的高純度蚓激酶的製備方法中，採用單克隆抗體技術實現蚓激酶活性組分的再純化。單克隆抗體技術是將具有分泌特定抗體能力的B淋巴細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞。通過有限稀釋法從雜交瘤細胞中篩選出特定的一個細胞集落(即克隆)，再由該集落的細胞不斷培養增殖而形成細胞系，由此細胞分泌的抗體即為單克隆抗體。單克隆抗體的主要特點是①抗體的分子結構高度均一，甚至胺基酸序列及空間構型均相同；②抗體識別的是抗原分子上單一抗原位區，且所有抗體分子均相同，由此具有高度特異性；③產生抗體的細胞是無性細胞系，可長期傳代並保存，因此只要該細胞系建立，便可持續穩定地生產同一性質的抗體。
通過本發明公開的製備方法得到的高純度蚓激酶，其纖溶活性達到每毫克蛋白20萬單位以上；依照電泳法(中國藥典2000年版二部附錄V F第五法SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法)顯示為一條帶，分子量應為32000±2000道爾頓；依照高效液相色譜法測定(中國藥典2000年版二部附錄VI H)，呈現一個峰的水平，電泳法和高效液相色譜法(HPLC)測定結果都表明高純度蚓激酶為單一組分；胺基酸序列分析，N-末端10個胺基酸序列為Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-Pro-Tyr；經瓊脂糖-纖維蛋白平板法測定，高純度蚓激酶樣品出現的纖溶圈比同樣濃度的蚓激酶標準品更為清晰。
取高純度蚓激酶，用氯化鈉注射液製成每1ml含20000單位的溶液，按熱原檢查法(中國藥典2000年版二部附錄XI D)，家兔每1kg體重注射1.0ml，應符合規定；取高純度蚓激酶，加氯化鈉注射液製成每1ml中含20000單位的溶液，按異常毒性檢查法(中國藥典2000年版二部附錄XI C)，靜脈注射給藥，應符合規定；取高純度蚓激酶，用氯化鈉注射液製成每1ml中含5000單位的溶液進行過敏試驗。試驗方法取體重250-350g豚鼠6隻，間日腹腔注射供試品溶液0.5ml，連續3次。然後將動物分成兩組，每組3隻，分別在第一次注射後第14日及第21日靜脈注射供試品溶液1.0ml進行攻擊。仔細觀察注射後15min內豚鼠的反應，均不得出現過敏性反應。如有豎毛、呼吸困難、噴嚏、乾嘔或咳嗽3聲等現象中的兩種或兩種以上者；或囉音、抽搐、虛脫或死亡現象之一者，應判為陽性。
經鑑定，高純度蚓激酶的熱原、異常毒性和過敏檢查均符合規定。
圖1為蚓激酶粗品提取工藝流程圖；圖2為蚓激酶粗品純化和活性組分再純化工藝流程圖；圖3為注射用蚓激酶和凍幹靜脈注射用蚓激酶製劑生產工藝流程圖；圖4為蚓激酶注射液和靜脈注射用蚓激酶製劑生產工藝流程圖；
圖5為蚓激酶腸溶膠囊生產工藝流程圖；圖6為蚓激酶腸溶片生產工藝流程圖；圖7為蚓激酶SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜；圖8為蚓激酶高效液相色譜圖；以及圖9-A、9-B和9-C為蚓激酶效價測定瓊脂糖-纖維蛋白平板圖譜。
具體實施例方式
實施例1～3為單克隆抗體親和層析柱的製作方法。
實施例1用高效液相色譜純化並經定性的蚓激酶50μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強免疫。
取經免疫的小鼠脾B淋巴細胞懸液與鼠sp2/10骨髓瘤細胞按5∶1的比例混合，加入分子量40000的50％聚乙二醇作用後，將細胞混合液分別接種在多塊96孔細胞培養板孔內。
將接種細胞混合液的細胞培養板置於CO2培養箱內培養。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養基，第5～10天改用HT培養基，10天後改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養基培養。收集細胞分泌液，用酶聯免疫法對單克隆抗體進行篩選及效價測定，將分泌特異性蚓激酶抗體的細胞挑選出來傳代培養，建立細胞系，由此可獲得穩定的抗體。
用溴化氰活化4B-Sepharose瓊脂糖凝膠，把得到的蚓激酶抗體偶聯到多糖基質上，從而製成單克隆抗體親和層析柱。
實施例2用高效液相色譜純化並經定性的蚓激酶250μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強免疫。
取經免疫的小鼠脾B淋巴細胞懸液與鼠sp2/10骨髓瘤細胞按8∶1的比例混合，加入分子量50000的50％聚乙二醇作用後，將細胞混合液分別接種在多塊96孔細胞培養板孔內。
將接種細胞混合液的細胞培養板置於CO2培養箱內培養。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養基，第5～10天改用HT培養基，10天後改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養基培養。收集細胞分泌液，用酶聯免疫法對單克隆抗體進行篩選及效價測定，將分泌特異性蚓激酶抗體的細胞挑選出來傳代培養，建立細胞系，由此可獲得穩定的抗體。
用溴化氰活化二乙氨基葡聚糖凝膠，把得到的蚓激酶抗體偶聯到多糖基質上，從而製成單克隆抗體親和層析柱。
實施例3用高效液相色譜純化並經定性的蚓激酶500μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強免疫。
取經免疫的小鼠脾B淋巴細胞懸液與鼠sp2/10骨髓瘤細胞按10∶1的比例混合，加入分子量60000的50％聚乙二醇作用後，將細胞混合液分別接種在多塊96孔細胞培養板孔內。
將接種細胞混合液的細胞培養板置於CO2培養箱內培養。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養基，第5～10天改用HT培養基，10天後改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養基培養。收集細胞分泌液，用酶聯免疫法對單克隆抗體進行篩選及效價測定，將分泌特異性蚓激酶抗體的細胞挑選出來傳代培養，建立細胞系，由此可獲得穩定的抗體。
用溴化氰活化羧甲基葡聚糖凝膠，把得到的蚓激酶抗體偶聯到多糖基質上，從而製成單克隆抗體親和層析柱。
實施例4稱取10kg鮮活太平二號-赤子愛勝蚓置不鏽鋼桶內，用水洗淨泥沙，加100g食鹽攪拌10～20nin，再用水清洗乾淨。取出後在膠體磨中加10升0.05mol/L磷酸鹽緩衝液製備勻漿。勻漿液放-20℃冷凍過夜，次日取出置水浴中儘快融化，反覆3次。第3次融化後先加熱至50℃保持20min，再繼續加熱至80℃保持5min，迅速在冰水中冷卻至室溫。3000rpm離心30min，取上清。沉澱加5升同樣緩衝液攪拌30min，再次離心，合併兩次離心得到的上清液。
先用50K超濾器超濾取透過液，再用10K超濾器超濾濃縮到1升左右，加10升0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)離子交換層析緩衝液繼續超濾濃縮到500ml左右，在4℃3500rpm離心10min，取上清液上羧甲基葡聚糖凝膠離子交換層析柱，用0.05mol/L Tris-HCl緩衝液平衡至基線平穩，用含有0.1mol/L氯化鈉的上述緩衝液洗脫，收集各組分。經HPLC分析，取保留時間8～10min收集的各組分樣品，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測，將出現溶圈具有纖溶活性的組分合併，用10K超濾器濃縮到1升左右，加10升親和層析平衡緩衝液，繼續超濾濃縮至200～300ml，上實施例1中的親和層析柱，再用2倍柱床體積Tris-HCl親和層析平衡緩衝液平衡至基線平穩，改用含有洗脫劑的親和層析洗脫液洗脫。分別收集各洗脫峰。同離子交換層析法鑑定收集到的各組分的纖溶活性。
經活性檢測，收集的第2峰具有很高的纖溶活性，取2峰組分適當稀釋，用高效液相色譜法檢測，獲得單組分圖譜，其保留時間為9.586min，用SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳測定分子量為33000道爾頓。
熱原、異常毒性、過敏檢查，均符合規定。
實施例5稱取10kg鮮活雙胸蚓，用飲用水洗淨泥沙，加200g食鹽攪拌10～20nin，再用水洗淨。取出後在膠體磨中加15升0.05mol/L Tris-HCl緩衝液製備勻漿。勻漿液放-20℃冷凍過夜，次日取出置水浴中儘快融化，反覆3次。第3次融化後先加熱至50℃保持25min，再繼續加熱至80℃保持4min，迅速在冰水中冷卻至室溫。3500rpm離心20min，取上清。沉澱加5升同樣緩衝液攪拌30min，再次離心，合併兩次離心得到的上清液。
先用50K超濾器超濾取透過液，再用10K超濾器超濾濃縮到500ml左右，調pH值至7.8，在4℃3500rpm離心10min，上清液上二乙氨基葡聚糖凝膠(DEAE-Sephadex A-50)離子交換層析柱，用0.05mol/L磷酸鹽緩衝液平衡至基線平穩，用含有0.3mol/L氯化鈉的上述緩衝液洗脫，收集各組分。經HPLC分析，取保留時間8～10min收集的各組分樣品，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測，將出現溶圈具有纖溶活性的組分合併，用10K超濾器濃縮到1升左右，加10升親和層析平衡緩衝液，繼續超濾濃縮至200～300ml，上實施例2中的親和層析柱，再用2倍柱床體積Tris-HCl親和層析平衡緩衝液平衡至基線平穩後，改用含有洗脫劑的親和層析洗脫液洗脫，分別收集各洗脫峰。同離子交換層析法鑑定收集到的各組分的纖溶活性。
經活性檢測，收集的第2峰具有很高的纖溶活性，取2峰組分適當稀釋，用高效液相色譜法檢測，獲得單組分圖譜，其保留時間為9.711min，用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳測定分子量為32000道爾頓。
熱原、異常毒性、過敏檢查，均符合規定。
實施例6稱取10kg鮮活鉅齒遠蚓，用飲用水洗淨泥沙，加300g食鹽攪拌10～20nin，再用水清洗乾淨。取出後在膠體磨中加20升0.02mol/L磷酸鹽緩衝液製備勻漿。勻漿液放-20℃冷凍過夜，次日取出置水浴中儘快融化，反覆3次。第3次融化後先加熱至50℃保持30min，再繼續加熱至80℃保持2min，迅速在冰水中冷卻至室溫。4000rpm離心15min，取上清，沉澱加5升同樣緩衝液攪拌30min，再次離心，合併兩次離心得到的上清液。
先用50K超濾器超濾取透過液，再用10K超濾器超濾濃縮到1升左右，加10升0.02mol/L Tris-HCl離子交換層析緩衝液，繼續濃縮至500ml左右，在4℃3500rpm離心10min。上清液上瓊脂糖凝膠離子交換層析柱，用0.02mol/LTris-HCl緩衝液平衡至基線平穩，用含有0.4mol/L氯化鈉的上述緩衝液洗脫，收集各組分。經HPLC分析，取保留時間8～10min收集的各組分樣品，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測，將出現溶圈具有纖溶活性的組分合併，用10K超濾器濃縮到1升左右，加10升磷酸鹽親和層析平衡緩衝液，繼續超濾濃縮至200～300ml，上實施例3中的親和層析柱，再用2倍柱床體積親和層析平衡緩衝液平衡至基線平穩後，改用含有洗脫劑的親和層析洗脫液洗脫。分別收集各洗脫峰。同離子交換層析法鑑定收集到的各組分的纖溶活性。
經活性檢測，收集的第2峰具有很高的纖溶活性，取2峰組分適當稀釋，用高效液相色譜法檢測，獲得單組分圖譜，其保留時間為9.693min，用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳測定分子量為32200道爾頓。
熱原、異常毒性、過敏檢查，均符合規定。
實施例7稱取10kg鮮活參環毛蚓(廣地龍)，用飲用水洗淨泥沙，加500g食鹽攪拌10～20nin，再用水清洗乾淨。取出後在膠體磨中加30升0.02mol/L磷酸鹽緩衝液製備勻漿。勻漿液放-20℃冷凍過夜，次日取出置水浴中儘快融化，反覆3次。第3次融化後先加熱至50℃保持40min，迅速在冰水中冷卻至室溫。3500rpm離心25min，取上清，沉澱加5升同樣緩衝液後攪拌30min，再次離心，合併兩次離心得到的上清液。
先用50K超濾器超濾取透過液，再用10K超濾器超濾濃縮到500ml左右，調pH值至8.8。在4℃3500rpm離心10min，上清液上DEAE-Sephadex A-50離子交換層析柱，用0.02mol/L Tris-HCl緩衝液平衡至基線平穩，用含有0.5mol/L氯化鈉的上述緩衝液洗脫，收集各組分。經HPLC分析，取保留時間8～10min收集的各組分樣品，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測，將出現溶圈具有纖溶活性的組分合併。用10K超濾器濃縮到1升左右，加10升親和層析平衡緩衝液，繼續超濾濃縮至200～300ml，上實施例3中的親和層析柱，用2倍柱床體積Tris-HCl親和層析平衡緩衝液平衡至基線平穩後，改用含有洗脫劑的親和層析洗脫液洗脫，分別收集各洗脫峰，同離子交換層析法鑑定收集到的各組分的纖溶活性。
經活性檢測，收集的第2峰具有很高的纖溶活性，取2峰組分適當稀釋，用高效液相色譜法檢測，獲得單組分圖譜，其保留時間為9.806min，用SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳測定分子量為30500道爾頓。
熱原、異常毒性、過敏檢查，均符合規定。
實施例8為注射用蚓激酶與凍幹靜脈注射用蚓激酶製劑生產工藝。
圖3為注射用蚓激酶與凍幹靜脈注射用蚓激酶製劑生產工藝流程圖。
首先，在局部百級潔淨區內按配製處方將蚓激酶原料藥與白蛋白、磷酸鹽、氯化鈉、右旋糖酐等輔料準確稱量在配液容器內；加注射用水充分溶解或稀釋，攪拌混勻後，得到製劑中間體；除菌過濾，其中過濾前後應對除菌過濾系統進行完整性測試。然後，將過濾後的中間體按裝量裝入抗生素瓶，在分裝過程中應進行至少4次裝量檢查，保證每一隻瓶內裝入的藥量準確。最後，將裝入藥品的抗生素瓶碼在凍幹箱各層的隔板上，按照品種凍幹曲線進行速凍至零下20～30℃，維持8小時；然後抽真空，在真空狀態下緩慢升溫至35～40℃，保持一定時間，再降至室溫後取出。壓塞、軋蓋得成品。經過成品質量檢驗合格後，進行包裝，入成品庫存放。
實施例9為蚓激酶注射液與靜脈注射用蚓激酶製劑生產工藝。
圖4為蚓激酶注射液與靜脈注射用蚓激酶製劑生產工藝流程圖。
首先，在局部百級潔淨區內按配製處方將蚓激酶原料藥與白蛋白、磷酸鹽、氯化鈉等輔料準確稱量在配液容器內；加注射用水充分溶解或稀釋，攪拌混勻後，得到製劑中間體；除菌過濾，其中過濾前後應對除菌過濾系統進行完整性測試。然後，將過濾後的中間體按裝量裝入抗生素瓶同時壓塞、軋蓋即得成品，在分裝過程中應進行至少4次裝量檢查，保證每一隻瓶內裝入的藥量準確。最後，經過成品質量檢驗合格後，進行包裝，入成品庫存放。
實施例10為蚓激酶腸溶膠囊製劑生產工藝。
圖5為蚓激酶腸溶膠囊製劑生產工藝流程圖。
首先，在十萬級潔淨區內將蚓激酶原料藥與澱粉、乳糖、硬酯酸、滑石粉、明膠等輔料準確稱量在製劑容器內，充分混合均勻，得到製劑中間體。然後，取外觀、長度、厚度、臭味、水分、脆碎度、融化時限、熾灼殘渣及微生物學檢查均符合規定的膠囊殼，填充中間體藥粉，得到半成品。最後蓋上膠囊上節、壓平打光，製得成品。經過成品質量檢驗合格後，用玻璃瓶或塑料瓶密閉包裝，入成品庫，放置在陰涼乾燥處，溫度不得超過25℃，相對溼度不得超過45％。
實施例11為蚓激酶腸溶片生產工藝。
圖6為蚓激酶腸溶片生產工藝流程圖。
首先，在十萬級潔淨區內將蚓激酶原料藥與乳糖、澱粉漿、羧甲基纖維素鈉等輔料準確稱量在製劑容器內，充分混合均勻，得到製劑中間體。然後，進行制粒與壓片，在壓片過程中隨時注意片劑的外觀，定時抽查藥片的重量差異、硬度和崩解時限。最後，包腸溶衣得到成品。經過成品質量檢驗合格後，進行包裝，入成品庫，貯存在陰涼、通風、乾燥處，注意防止受潮、發黴、變質。
權利要求
1.一種高純度蚓激酶的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)蚓激酶粗品的提取取鮮活蚯蚓用水洗淨，加入食鹽處理；加入pH6.8～8.3的緩衝液，用膠體磨製備勻漿；將勻漿液反覆凍融；將勻漿液加熱，去除對熱不穩定的雜蛋白；將勻漿液離心，取上清液；上清液經超濾濃縮，截留分子量為10000～50000道爾頓的組分，冷凍乾燥製得蚓激酶粗品；(2)蚓激酶粗品的純化將步驟(1)中獲得的蚓激酶粗品溶於緩衝液中，離心，取上清液用離子交換層析柱分離，得到蚓激酶活性組分；(3)蚓激酶活性組分的再純化將步驟(2)中的蚓激酶活性組分用親和層析平衡緩衝液溶解，用單克隆抗體親合層析柱進行再純化，用緩衝液平衡至流出液在蛋白檢測儀上繪出穩定的基線後，再用含有洗脫劑的親和層析洗脫液洗脫，收集活性洗脫峰，冷凍乾燥得到高純度的蚓激酶。
2.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，蚯蚓包括雙胸蚓、赤子愛勝蚓、鋸齒遠蚓或參環毛蚓。
3.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，其中步驟(2)中離子交換層析採用羧甲基葡聚糖凝膠柱或二乙氨基葡聚糖凝膠柱或瓊脂糖凝膠柱層析，先用緩衝液平衡脫洗，再用含有0～0.5mol/LNaCl的緩衝液進行梯度洗脫。
4.如權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，其中所述的緩衝液為磷酸鹽緩衝液或三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液。
5.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，其中步驟(3)中單克隆抗體親和層析柱是由蚓激酶抗體偶聯到經過溴化氰活化處理的羧甲基葡聚糖凝膠、二乙氨基葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠的多糖基質上製得的。
6.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，蚓激酶抗體由如下步驟製備得到用高效液相色譜純化並經定性的蚓激酶與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對小鼠皮下注射免疫；取經免疫的小鼠脾B淋巴細胞懸液與鼠骨髓瘤細胞混合，加入分子量為40000～60000的聚乙二醇作用後，將細胞混合液分別接種在多孔細胞培養板孔內；將接種細胞混合液的細胞培養板置於CO2培養箱內培養，按時間階段選擇不同的培養基；收集細胞分泌液，對單克隆抗體進行篩分得到穩定的蚓激酶抗體。
7.如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，經免疫的小鼠脾B淋巴細胞懸液與鼠骨髓瘤細胞的混合比例按5～10∶1。
8.如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，培養基的選擇按照第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養基，第5～10天改用HT培養基，10天後改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養基。
9.一種由權利要求1中所述方法製得的高純度蚓激酶，其特徵在於，所述蚓激酶的比活達到每毫克蛋白20萬單位以上；經高效液相色譜測試為單一組分；在SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳上呈現一條帶，分子量為32000±2000道爾頓；胺基酸序列分析，N-末端10個胺基酸序列為Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-Pro-Tyr
10.一種由權利要求1所述方法製得的或權利要求10所述的高純度蚓激酶製得的藥物製劑，其特徵在於，其包含治療有效量的權利要求1所述方法製得的或權利要求10所述的高純度蚓激酶、藥學上可接受的藥用輔料。
全文摘要
本發明公開一種高純度蚓激酶的製備方法及以其為原料藥的製劑。本發明通過採用單克隆抗體技術實現蚓激酶活性組分的再純化，從而得到高純度蚓激酶，該方法的特點是所獲酶的專一性強，活性高，達到每毫克蛋白20萬單位以上；經高效液相色譜測試為單一組分；在SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳上呈現一條帶，分子量為32000±2000道爾頓；胺基酸序列分析，N－末端10個胺基酸序列為Ile－Val－Gly－Gly－Ile－Glu－Ala－Arg－Pro－Tyr，以所述高純度蚓激酶為原料藥可以製成可供口服、肌注、以及靜脈注射與靜脈輸液多種途徑給藥的製劑，用於血栓性疾病的治療。
文檔編號A61K38/48GK1603405SQ03134768
公開日2005年4月6日 申請日期2003年9月29日 優先權日2003年9月29日
發明者馬驫, 魏化偉, 吳丹, 宋夢薇, 張穎 申請人:北京賽生藥業有限公司