一種酵母和細菌菌群利用活性汙泥合成聚-β-羥丁酸的方法
2023-09-16 13:33:00 1
一種酵母和細菌菌群利用活性汙泥合成聚-β-羥丁酸的方法
【專利摘要】一種酵母和細菌菌群利用活性汙泥合成聚-β-羥丁酸的方法，它涉及一種高效的聚-β-羥丁酸(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)合成方法，具體包括利用序批式生物反應器(SBR)，以活性汙泥為菌源，利用酵母與細菌菌群的共同作用，使這一菌群能夠高效地合成PHB的方法，該方法是：接種時加入人工配水和酵母膏，提供菌群的營養來源，採用厭氧/好氧SBR交替運行的方式進行馴化，每循環包括進水、厭氧培養、好氧培養、沉澱、排水、閒置。在培養過程中逐步提高COD並限制氮源和磷濃度，不斷提高菌群積累PHB的能力。
【專利說明】—種酵母和細菌菌群利用活性汙泥合成聚-β -羥丁酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高效的聚-β -輕丁酸(poly-β-hydroxybutyrate, PHB)合成方法，具體包括利用厭氧/好氧交替的序批式生物反應器(SBR)，酵母與細菌混合菌群，通過調節營養比例馴化酵母與細菌的混合菌群，最終使這一菌群能夠高效地合成PHB。
【背景技術】
[0002]聚β -羥基丁酸酯是微生物合成的羥基脂肪酸線性聚合物，與石油化學合成塑料相似又可生物降解，被譽為「二十一世紀綠色塑料」。PHB具有生物相容、無毒、手性單體等特性，使其在合成血管、心臟支架、縫合線、藥物緩釋劑和生物燃料等領域都有不可替代的應用潛力和開發價值。廉價大規模生產PHB是緩解「能源危機」和消除「白色汙染」的重要舉措。
[0003]現階段PHB的合成與發酵過程多數是採用單菌純培養發酵的方式獲得，生產原料為葡萄糖、蔗糖、丙酸等價格昂貴的精緻碳源，其生產價格是石化合成塑料價格的10倍左右，高昂的生產價格導致其難以規模化生產來代替傳統的石化塑料。利用混合菌群法以活性汙泥為底物合成PHB可以實現不滅菌的開放式培養，很大程度上降低生產成本，又能將工農業廢棄物轉化為重要的化工原料，不僅變廢為寶地解決環境汙染問題，還很大程度上緩解石化能源的危機。
[0004]至今，細菌菌群、嗜鹽古菌、嗜鹽細菌等微生物在開放條件下積累PHB報導很多，但未見利用酵母和細菌混合菌群合成PHB的報導。酵母細胞的體積是細菌的10倍，本身是個「化工廠」，其較大的細胞體積對胞內PHB提取精製提供便利條件。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是為了解決現有方法合成PHB成本高，以及需要進行滅菌等操作，造成操作複雜的問題，而提供了一種酵母和細菌菌群利用活性汙泥合成聚-β_羥丁酸的方法。
[0006]本發明的一種酵母和細菌菌群利用活性汙泥合成聚-β_羥丁酸的方法，它是按照以下步驟進行的:
[0007]將活性汙泥接種到序批式反應器中，活性汙泥與序批式反應器的體積比為(0.07~0.2): 1，採用人工配水，通過逐步提高COD和限制氮和磷濃度的方式，並按照厭氧/好氧交替運行的馴化模式，經過馴化後，即得到聚-β -羥丁酸；
[0008]其中，所述的人工配水組分為:每IL人工配水中含有506_3108mg/L的NaAC、115-150mg/L 的 NH4Cl,65.28-lmg/L 的 KH2PO4、36_40mg/L 的 KCl,14.8-16.8mg/L 的 CaCl2'91.02-101.02mg/L的MgSO4.7Η20、58的酵母膏和ImL的微量元素液；微量元素液組分為:每IL 微量元素液中含有 1000mg 的 EDTA、120mg 的 ZnSO4.7H20、60mg 的 Na2MoO4.2H20、120mg的 MnCl2.4H20、120mg 的 K1、30mg 的 CuSO4.5H20、150mg 的 H3BO3 和 1500mg 的 FeCl3.6H20 ；
[0009]所述的通過逐步提高COD和限制氮源和磷濃度的方式，按照厭氧/好氧交替運行的馴化模式，進行馴化具體操作步驟為:
[0010]一、汙泥活性恢復階段:初始COD濃度為300mg/L、營養物質摩爾比例為COD:N:P=100:5:1的條件下，在厭氧/好氧序批式反應器中進行馴化120~140周期；
[0011]二、富集馴化階段:先將步驟一馴化後的發酵液COD濃度調整至600mg/L、營養摩爾比例調整為COD:N:P = 600:15:6，馴化60~70周期；再將COD濃度調整至1200mg/L,營養摩爾比例調整為COD:N:P = 1200:15:6，繼續馴化60~70周期，即獲得聚- β -羥丁酸；
[0012]所述的序批式反應器的厭氧/好氧交替運行周期為360min，每一周期包括以下程序:7min的進水、IlOmin的厭氧培養、180min的好氧培養、25min的沉澱、3min的排水和25min的閒置。
[0013]本發明包含以下有益效果:
[0014]本發明採用酵母與細菌菌群混合培養合成PHB的方法。混合菌群具有利用農業廢棄秸杆、造紙廠廢水、活性汙泥、食品工業廢水、餐桌廚餘等廢棄物作為原料、在不滅菌條件下合成PHB及其單體的優勢。與純菌相比，不僅減少滅菌設備投資，降低高溫高壓滅菌程序上的能源消耗，還節省精緻生產原料的投資，最大程度上降低生產成本。
[0015]目前，生物合成塑料(PHB)比石化合成塑料生產成本高10倍，價格上無法與傳統塑料相競爭。採用混合菌群開放式不滅菌發酵廉價的廢棄物可以最大程度上降低PHB的合成成本。
[0016]本發明的細菌和酵母混合菌群與現有合成PHB的方法相比具有兩點優勢:
[0017]一、該菌群由酵母和細菌組成，目前已見很多關於細菌菌群、細菌單菌、古細菌合成PHB的報導，而利用酵母和細菌混合菌群合成PHB的研究未見報導。
[0018]二、細菌和酵母混合菌群能夠利用各種廢棄的固體和液體合成PHB及其單體。菌群合成PHB在實際生產過程中，可以減少三方面投資:1)發酵過程中，減少高溫高壓滅菌設備，節約發酵設備的投資；2)生產過程中，減少原料高溫高壓滅菌工藝程序，省略電能和人力資源的能源動力投資；3)生產原料上，廉價工農業廢棄物代替精緻原材料，節約原材料的投資。通過減少設備、生產流程和原料上的資金投入，最大程度減少PHB的生產成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1為實施例2中的混合菌群胞體內PHB儲存形式的15000倍放大圖；
[0020]圖2為實施例2中的混合菌群胞體內PHB儲存形式的20000倍放大圖；
[0021]圖3實施例2中的混合菌群胞體內PHB儲存形式的30000倍放大圖；
[0022]圖4為實施例3中的細菌酵母菌群及其Genbank比對的近緣種系統發育分析樹。
【具體實施方式】
[0023]【具體實施方式】一:本實施方式的一種酵母和細菌菌群利用活性汙泥合成聚-β_羥丁酸的方法，它是按照以下步驟進行的:
[0024]將活性汙泥接種到序批式反應器中，活性汙泥與序批式反應器的體積比為(0.07~0.2): 1，採用人工配水，通過逐步提高COD和限制氮和磷濃度的方式，並按照厭氧/好氧交替運行的馴化模式，經過馴化後，即得到聚-β -羥丁酸；
[0025]其中，所述的人工配水組分為:每IL人工配水中含有506_3108mg/L的NaAC、115-150mg/L 的 NH4Cl,65.28-lmg/L 的 KH2PO4、36_40mg/L 的 KCl,14.8-16.8mg/L 的 CaCl2'91.02-101.02mg/L的MgSO4.7Η20、58的酵母膏和ImL的微量元素液；微量元素液組分為:每IL 微量元素液中含有 1000mg 的 EDTA、120mg 的 ZnSO4.7H20、60mg 的 Na2MoO4.2H20、120mg的 MnCl2.4H20、120mg 的 K1、30mg 的 CuSO4.5H20、150mg 的 H3BO3 和 1500mg 的 FeCl3.6H20 ；
[0026]所述的通過逐步提高COD和限制氮源和磷濃度的方式，按照厭氧/好氧交替運行的馴化模式，進行馴化具體操作步驟為:
[0027]一、汙泥活性恢復階段:初始COD濃度為300mg/L、營養物質摩爾比例為COD:N:P=100:5:1的條件下，在厭氧/好氧序批式反應器中進行馴化120~140周期；
[0028]二、富集馴化階段:先將步驟一馴化後的發酵液COD濃度調整至600mg/L、營養摩爾比例調整為COD:N:P = 600:15:6，馴化60~70周期；再將COD濃度調整至1200mg/L,營養摩爾比例調整為COD:N:P = 1200:15:6，繼續馴化60~70周期，即獲得聚- β -羥丁酸；
[0029]所述的序批式反應器的厭氧/好氧交替運行周期為360min，每一周期包括以下程序:7min的進水、IlOmin的厭氧培養、180min的好氧培養、25min的沉澱、3min的排水和25min的閒置，按照此程序周而復始進行循環。
[0030] 【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:所述的人工配水組分為:每IL人工配水中含有1000~3000mg/L的NaACU20~140mg/L的NH4Cl,5~60mg/L 的 KH2PO4,38 ~40mg/L 的 KC1U5 ~16.8mg/L 的 CaCl2,95 ~100mg/L 的 MgSO4.7H20、5g的酵母膏和ImL的微量元素液；微量元素液組分為:每IL微量元素液中含有1000mg的EDTA、120mg 的 ZnSO4.7H20、60mg 的 Na2MoO4.2H20、120mg 的 MnCl2.4H20、120mg 的 K1、30mg的CuSO4.5H20、150mg的H3BO3和1500mg的FeCl3.6H20。其它與【具體實施方式】一相同。
[0031]通過以下實施例驗證本發明的有益效果:
[0032]實施例1
[0033]本實施例的一種酵母和細菌菌群利用活性汙泥合成聚_β -羥丁酸的方法，它是按照以下步驟進行的:
[0034]I)將活性汙泥接種到序批式生物反應器(SBR)中，採用人工配水，以乙酸鈉為唯一碳源進行馴化；
[0035]2)採用厭氧/好氧交替運行的方式進行馴化，循環的每一周期包含以下程序:進水、厭氧培養、好氧培養(曝氣、攪拌)、沉澱、排水、閒置；
[0036]3)在培養過程中逐步提高COD和限制氮源和磷濃度的方式進行馴化，使混合菌群的PHB合成能力不斷增強。
[0037]在步驟I)中，所述的序批式生物反應器(SBR)有效體積為15L，接種量控制在1-3L，所述的人工配水組分為:每IL人工配水中含有506-1012mg/L的NaAC、115-150mg/L 的 NH4Cl,65.28-lmg/L 的 KH2PO4、36_40mg/L 的 KCl,14.8-16.8mg/L 的 CaCl2'91.02-101.02mg/L的MgSO4.7Η20、58的酵母膏和ImL的微量元素液；微量元素液組分為:每IL 微量元素液中含有 1000mg 的 EDTA、120mg 的 ZnSO4.7H20、60mg 的 Na2MoO4.2H20、120mg的 MnCl2.4H20、120mg 的 K1、30mg 的 CuSO4.5H20、150mg 的 H3BO3 和 1500mg 的 FeCl3.6H20 ；
[0038]在步驟I)所述的酵母膏加入量為5g/L，其主要目的是提供酵母菌。
[0039]在步驟2)中所述的每一個周期包括7min進水+IlOmin厭氧+180min好氧+25min沉澱+3min排水+25min閒置。每周期6h,每天4個周期。
[0040]在步驟3)所述的馴化過程包括兩個馴化階段，馴化第一階段是汙泥的活性恢復階段；第二階段是富集馴化階段。
[0041]所述的馴化培養過程中逐步提高COD和限制氮源和磷濃度的方式進行馴化具體操作步驟為:
[0042]一、汙泥的活性恢復階段:在初始COD濃度為300mg/L、營養比例為COD:N:P =100:5:1的條件下，馴化120~140周期；
[0043]二、富集馴化階段:先將步驟一馴化後的汙泥液COD濃度調整至600mg/L、營養比例調整為COD:N:P = 600:15:6，馴化60~70周期；再將COD濃度調整至1200mg/L，營養比例調整為COD:N:P = 1200:15:6，繼續馴化60~70周期，即獲得聚- β -羥丁酸(PHB)。
[0044]所述的厭氧/好氧交替運行周期的時間為6h，每一周期包括7min的進水、IlOmin的厭氧培養、180min的好氧培養、25min的沉澱、3min的排水和25min的閒置，獲得穩定的PHB高產菌群。
[0045]本實施例的細菌和酵母混合菌群與現有合成PHB的方法相比具有兩點優勢:
[0046]一、該菌群由酵母和細菌組成，而酵母和細菌混合菌群合成PHB在國內外文獻上未見報導。目前已見很多關於細菌菌群、細菌單菌、古細菌合成PHB的報導，而利用酵母和細菌混合菌群合成PHB的研究未見報導。
[0047]二、細菌和酵母混合菌群能夠利用各種廢棄的固體和液體合成PHB及其單體。菌群合成PHB在實際生產過程中，可以減少三方面投資:1)高溫高壓滅菌的發酵設備投資；2)生產過程中原料高溫滅菌的電能和人工消耗；3)廉價工農業廢棄物代替精緻原料的原材料的投資。通過設備和生產流程上最大程度減少PHB的生產成本。
[0048]下面通過實施例對本發明進行進一步說明。
[0049]實施例2:菌群的馴化
[0050]I)活性汙泥活性恢復階段馴化
[0051]取1.5L取自哈爾濱市文昌汙水處理廠二沉池的活性汙泥於SBR中，初始COD為300mg/L，營養摩爾比例為C0D/N/P = 100/5/1，按照這一比例配置的人工配水組分如下表:
[0052]表1人工配水組成成分
[0053]
成分|(mg/.L)
NaAc506.25
NH4Cl115.56
KH2PO465.28
KC 丨36
[0054]
【權利要求】
1.一種酵母和細菌菌群利用活性汙泥合成聚-β -羥丁酸的方法，其特徵在於它是按照以下步驟進行的: 將活性汙泥接種到序批式反應器中，活性汙泥與序批式反應器的體積比為(0.07~0.2): 1，採用人工配水，通過逐步提高COD和限制氮和磷濃度的方式，並按照厭氧/好氧交替運行的馴化模式，進行馴化後，即得到聚_β -羥丁酸； 其中，所述的人工配水組分為:每IL人工配水中含有506-3108mg/L的NaAC、115-150mg/L 的 NH4Cl,65.28-lmg/L 的 KH2PO4、36_40mg/L 的 KCl,14.8-16.8mg/L 的 CaCl2'91.02-101.02mg/L的MgSO4.7Η20、58的酵母膏和ImL的微量元素液；微量元素液組分為:每IL 微量元素液中含有 1000mg 的 EDTA、120mg 的 ZnSO4.7H20、60mg 的 Na2MoO4.2H20120mg的 MnCl2.4H20、120mg 的 K1、30mg 的 CuSO4.5H20、150mg 的 H3BO3 和 1500mg 的 FeCl3.6H20 ； 所述的通過逐步提高COD和限制氮源和磷濃度的方式，按照厭氧/好氧交替運行的馴化模式，進行馴化具體操作步驟為: 一、汙泥活性恢復階段:初始COD濃度為300mg/L、營養物質摩爾比例為COD:N:P =100:5:1的條件下，在厭氧/好氧序批式反應器中進行馴化120~140周期； 二、富集馴化階段:先將步驟一馴化後的發酵液COD濃度調整至600mg/L、營養摩爾比例調整為COD:N:P = 600:15:6，馴化60~70周期；再將COD濃度調整至1200mg/L，營養摩爾比例調整為COD:N:P = 1200:15:6，繼續馴化60~70周期，即獲得聚-β _羥丁酸； 所述的序批式反應器的厭氧/好氧交替運行周期為360min，每一周期包括以下程序:7min的進水、IlOmin的厭氧培養、180min的好氧培養、25min的沉澱、3min的排水和25min的閒置。
2.根據權利要求1所述的一種酵母和細菌菌群利用活性汙泥合成聚_β-羥丁酸的方法，其特徵在於所述的人工配水組分為:每IL人工配水中含有1000~3000mg/L的NaAC、120 ~140mg/L 的 NH4Cl、5 ~60mg/L 的 KH2PO4'38 ~40mg/L 的 KCl、15 ~16.8mg/L 的 CaCl2'95~100mg/L的MgSO4.7H20、5g的酵母膏和ImL的微量元素液；微量元素液組分為:每IL微量元素液中含有 1000mg 的 EDTA、120mg 的 ZnSO4.7H20、60mg 的 Na2MoO4.2H20120mg 的MnCl2.4H20、120mg 的 K1、30mg 的 CuSO4.5H20、150mg 的 H3BO3 和 1500mg 的 FeCl3.6H20。
【文檔編號】C12P39/00GK104178544SQ201410414621
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月21日 優先權日:2014年8月21日
【發明者】劉長莉, 張 傑, 齊英傑, 李天放 申請人:東北林業大學