一種基因拷貝數變異的檢測方法
2023-09-16 07:12:30 4
專利名稱：一種基因拷貝數變異的檢測方法
技術領域：
本發明涉及基因拷貝數變異檢測領域，尤其涉及一種利用相似序列結合高分辨熔解曲線分析進行基因拷貝數變異檢測的方法。
背景技術：
拷貝數變異(Copy Number Variations, CNVs)最初是70年前在果蠅Bar基因研究中發現的，後來被認為是動植物基因組中普遍存在的現象，它是指基因組DNA中較大片段的缺失或重複現象。有些拷貝數變異屬於多態性範疇，並不對動植物的表型造成影響，而有些拷貝數變異則通過擾亂基因序列和改變基因含量來影響基因表達，從而造成表型差異和表型適應，也會引起疾病。保守估計至少10%的人類基因組序列存在拷貝數變異的現象。 當功能基因區域如SMN基因、HER2基因等發生拷貝數變異時，可能導致基因產物數量的異常，從而導致非正常表型的出現，引起相關的疾病如脊髓性肌萎縮(SMA)、乳腺癌等。染色體非整倍體(Aneuploidy)也是一種典型的拷貝數變異現象，體細胞內缺失或增加的染色體往往導致危害程度不同的病徵，如特納症候群05，X)、克氏症候群07，XXY)、唐氏症候群07，+21)等。這類遺傳病不僅患病率極高，並且後天幾乎無法根治。因此，針對此類遺傳疾病，人群篩查與產前診斷顯得尤為重要。目前應用於拷貝數變異檢測的技術主要有1.比較基因組雜交(CGH)該技術發展至今，已與晶片技術(Microarray)結合後衍生為晶片比較基因組雜交技術(Array-CGH)。該技術可以在全部染色體或染色體亞帶水平上，對不同基因組之間DNA序列的拷貝數進行檢測，從而發現拷貝數變異。然而該技術解析度在Mb水平，更小片段的拷貝數片段則不易檢出。同時該技術操作繁瑣，通量低、耗時長且成本昂貴，需要較為大量的模板DNA，不利於大範圍的推廣。2. MLPA 全稱為多重連接探針擴增技術，是2002年發展起來的一種拷貝數檢測方法。目前已有相應的試劑盒檢測如SMA、唐氏症候群等疾病。該技術具有較準確的相對定量功能。但是該方法探針製備較為複雜，同時操作步驟繁瑣，耗時長。並且採用毛細管電泳作為分析手段，通量較低、成本較高且屬於開放式操作，易於造成PCR產物的汙染。高分辨熔解曲線分析(High Resolution Melting, HRM)於2003年發明，是一項近年來備受關注的技術，其通過精確的變溫速率控制以及DNA飽和染料的指示，實現了通過研究PCR產物序列的熔解溫度而對PCR產物進行鑑定。由於該技術具有快速、廉價、高通量等優點，已被廣泛應用於單核苷酸多態性(SNPs)、基因突變(Mutation)和表觀遺傳學 (Epigenetic)等研究。目前，已有將HRM應用於基因拷貝數變異研究的報導，但均是通過檢測待測序列內部的SNP位點來實現的。其原理是待測基因在某個SNP位點上是雜合子， 當發生拷貝數變異時，該SNP位點的雜合比例發生了變化，從而在HRM分析中體現出差別。 採用該原理具有以下一些不足之處首先，該方法實現的前提是SNP位點必須是雜合的，否則HRM無法區別兩個等位基因序列。這就使得單個SNP位點僅能用於一部分待測群體，而要囊括所有待測群體則必須採用多個SNP位點聯合檢測，這不僅增加了實驗的成本和設計的難度，而且降低了檢測的通量。並且，單個核苷酸的差異對於熔解曲線的影響較小，甚至於有些差異幾乎不影響熔解曲線的偏移。這是造成檢測靈敏度較低的主要因素。
發明內容
本發明的目的在於提供一種基因拷貝數變異的檢測方法。該方法是利用相似序列結合HRM分析進行基因拷貝數變異的檢測。為達到上述目的，本發明採用如下技術方案1)根據待測基因序列在全基因組範圍內篩選相似但不相同的內源性相似序列 (內標法)或者根據待測基因序列人工合成相應的外源性相似序列(外標法)。2)將待測基因序列與相似序列進行比對，設計共同的擴增引物。如有需要，還可設計相應的非標記探針。3)採用共同的引物進行PCR，在一個反應管內同時擴增待測基因序列與相似序列。4) HRM 分析 PCR 產物。所述相似序列與待測基因序列可以是同源關係，也可以是非同源關係。所述相似序列可與待測基因序列位於同一染色體上，也可位於不同染色體上。所述相似序列包括經表觀遺傳學研究方法如重亞硫酸鹽轉化(bisulfite conversion)後形成的相似序列。所述共同的擴增引物可以是一對擴增引物，也可以是多對擴增引物多位點驗證。所述共同的擴增引物與模板可以是完全匹配，也可以是不完全匹配。所述HRM分析採用DNA飽和性染料，包括但不局限於EvaGreen染料、LC Green PLUS染料、ResoLight染料、SYTO 9染料等。所述HRM分析數據處理方式包括但不局限於歸一化處理、溫度平移、差異作圖等。所述方法不僅可應用於基因拷貝數變異檢測，包括但不局限於SMN基因、HER2基因等的檢測；同樣適用於染色體非整倍體檢測，包括但不局限於特納症候群、克氏症候群、 唐氏症候群等的檢測。所述方法具有極高的檢測靈敏度，不僅可應於常規的人群篩查與產前診斷樣本， 同樣適用於嵌合體檢測以及母體外周血中胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA)或RNA樣本的檢測，因此本發明可應用於無創產前診斷(noninvasive prenatal diagnosis)。該方法的主要原理如圖1所示。基因組中，存在著許多相似的序列(similar sequence)，這些序列可能出自同源基因(paralogue)，如ZFX基因與ZFY基因，Dscam基因與DsCam3基因等，也可能出自非同源基因。當基因組中沒有目的基因的相似序列時，還可以人工合成一段相應的外源性相似序列。採用基因組中的內源性相似序列稱為內標法，採用人工合成的外源性相似序列成為外標法。待測基因序列與相似序列的核苷酸組成大部分相同，中間穿插著一些不同，如同多個天然的SNP雜合位點。在HRM的變溫雜交過程中，待測序列與相似序列將相互作用形成特定的熔解曲線。當待測基因發生拷貝數變異時，待測序列與相似序列的比例將發生變化，形成的熔解曲線可明顯區別於野生型待測基因。由於待測基因序列與相似序列之間的區別要遠大於SNP的區別，因此理論上採用相似序列進行 HRM分析將具有比SNP分析更高的靈敏度和特異性。並且，由於相似序列的差異是固定的，不同於SNP位點有純合雜合的區別，因此可以應用於所有待測群體。由於染色體非整倍體造成了整條染色體上的相關基因的拷貝數變異，因此本發明也可通過檢測該染色體上的基因達到檢測染色體非整倍體的目的。同時，CNV不僅存在於人類基因組中，在其他動植物基因組中也存在，例如最近有關於玉米 CNV 的報導(Allelic genome structural variations in maize detected by array comparative genome hybridization. Theor Appl Genet. 2010 Jan ； 120 (2) 355-67)，因此，本發明還可用於其他動植物基因組中CNV的檢測。與現有試劑盒及相關技術相比，本發明具有以下突出優點1)設計簡單、結果準確；2)無需受SNP位點是否雜合的限制，可應用於所有待測群體；3)待測序列與相似序列的區別大於SNP的區別，因此對於HRM的影響更大，有效提高檢測的靈敏度和特異性；4)由於其高靈敏度與高特異性，可適用於微量標本的檢測。如幹血斑標本、羊水細胞、絨毛細胞樣本、母體外周血中的胎兒游離核酸樣本、植物花粉樣本。5)封閉式操作，避免了 PCR產物的汙染；6)操作簡便、快速(Ih)、廉價、高通量；
圖1相似序列結合HRM檢測基因拷貝數變異原理圖。㈧以21號染色體上目標序列檢測為例，在6號染色體上選取相應的內源性相似序列(內標法)。如無內源性相似序列，也可人工合成一段與目標序列相似的外源性序列(外標法)。(B)以內標法為例，目標序列與相似序列內部含有7個核苷酸的差異，用雙向箭頭示出。大寫字母表示引物結合位置。(C)經過同一對引物的PCR擴增以及HRM分析，通過數據處理即可將21三體與正常對照區分開來。圖2採用內標法進行21，18，13三體的檢測。熔解曲線中虛線代表三體標本，實線代表正常對照。統計學分析中，方框的上下邊界指示25%與75%置信區間，方框內的點代表平均值，方框內的橫線代表中值，誤差棒指示5%與95%置信區間。圖3採用內標法進行性染色體非整倍體的檢測。熔解曲線中虛線代表非整倍體標本，實線代表正常對照。統計學分析中，方框的上下邊界指示25 %與75 %置信區間，方框內的點代表平均值，方框內的橫線代表中值，誤差棒指示5%與95%置信區間。圖4正常基因組DNA背景下21三體DNA的檢測。(A)不同比例21三體DNA熔解曲線圖。每條熔解曲線均由10個樣本求平均值所得。(B)統計學分析。方框的上下邊界指示25%與75%置信區間，方框內的點代表平均值，方框內的橫線代表中值，誤差棒指示最大值與最小值。
具體實施例方式以下實施例結合附圖對本發明作進一步的說明，所給出的是本發明的一些具體實施例，這些實施例只是說明而不表示本發明所有的可能性，本發明並不局限於這些實施例中提到的材料、反應條件或參數，任何在相關領域具備經驗的人，都可以按照本發明的原理，利用其它類似材料或反應條件實現本發明所描述的基因拷貝數變異檢測。這些並不脫離本發明描述的基本概念。實施例1內標法檢測人類常染色體拷貝數變異21，18，13三體是人類最常見的三種常染色體非整倍體。21三體又稱唐氏症候群， 活嬰中發生率約1/700。唐氏症候群包含一系列的遺傳病，會導致包括學習障礙、智能障礙和殘疾等高度畸形。該病無法經過後天治癒，因此對於唐氏症候群的產前診斷尤為重要。18 三體和13三體的發病率約為1/5000和1/25000，患病胎兒具有嚴重的畸形與生理缺陷，因此對於二者的產前診斷同樣十分重要。一、材料1、儀器實時螢光PCR儀、移液器、離心機。2、引物設計本發明針對21號染色體上的目標序列在7號染色體上選擇了一段相似序列；針對 18號染色體上的目標序列在9號染色體上選擇了一段相似序列；針對13號染色體上的目標序列在17號染色體上選擇了一段相似序列。一共設計了 3對引物分別對三條染色體的異常情況進行檢測，引物序列如下T21-F :SEQIDNO:1
T21-R :SEQIDNO:2
T18-F :SEQIDNO:3
T18-R :SEQIDNO:4
T13-F :SEQIDNO:5
T13-R :SEQIDNO:6
3、試劑2 χ LightCycler 480 high resolution melting master(Roche) ；Mg2+。二、方法1、樣本的選擇21三體DNA樣本47例，18三體DNA樣本10例，13三體DNA樣本3例，正常對照 DNA樣本48例。上述樣本均經過染色體核型分析驗證。2、PCR 擴增與 HRMPCR 反應體系包括 1 χ LightCycler 480 high resolution melting master, 2. 5mmol/LMg2+, 200nmol/L 上下遊引物，IOOng 基因組 DNA。PCR與HRM反應在Roche LightCycler 480 II儀器上進行，按以下條件進行擴增檢測第一階段95°CIOmin ；第二階段:95V15sec，60°C 15sec，72°C 15sec，35 個循環；第三階段95°C10sec，40°C 10sec，60°C至 95°C每秒採集螢光 20 次，50°C IOsec03、結果分析依次進行歸一化處理、溫度平移和差異作圖。最後以野生型樣本作為基準進行分析。
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從圖2可以看出21，18，13三體患者DNA樣本與正常對照DNA樣本能夠明顯區分。 21三體與18三體檢測的臨床靈敏度與特異性均為100%。13三體檢測的臨床靈敏度為 100%，臨床特異性為97.9%。實施例2內標法檢測人類性染色體拷貝數變異除21三體外，出生後可存活的染色體非整倍體多數為性染色體非整倍體，如45，X 和47，XXY等。性染色體非整倍體發生率較高，如女性中發生45，X的比例為1/2000左右， 而男性中發生47，XXY的比例為1/1000左右。性染色體非整倍體對患者的表型發育具有一定的影響，尤其在生殖系統方面。雖然性染色體非整倍體無法治癒，但是早期發現性染色體非整倍體後在發育期間輔以激素治療，可以有效減輕病徵，因此，性染色體的早期與快速診斷顯得尤為重要。一、材料1、儀器實時螢光PCR儀、移液器、離心機。2、引物設計本發明針對X染色體上的兩個目標序列在3號染色體和Y染色體上分別選擇了一段相似序列，這樣即可分析X染色體與常染色體的數目比例，也可分析X染色體與Y染色體的數目比例。一共設計了 2對引物進行檢測，引物序列如下X3-F :SEQ ID NO 7X3-R :SEQ ID NO 8XY-F :SEQ ID NO 9XY-R SEQ ID NO 103、試劑2 χ LightCycler 480 high resolution melting master(Roche) ；Mg2+。二、方法1、樣本的選擇特納症候群05，X)DNA樣本8例，克氏症候群07，XXY) DNA樣本14例，正常男性 DNA樣本M例，正常女性DNA樣本M例。上述樣本均經過染色體核型分析驗證。2、PCR 擴增與 HRMPCR 反應體系包括 1 χ LightCycler 480 high resolution melting master, 2. 5mmol/LMg2+, 200nmol/L 上下遊引物，IOOng 基因組 DNA。PCR與HRM反應在Roche LightCycler 480 II儀器上進行，按以下條件進行擴增檢測第一階段95°CIOmin ；第二階段:95V15sec，60°C 15sec，72°C 15sec，35 個循環；第三階段95°C10sec，40°C 10sec，60°C至 95°C每秒採集螢光 20 次，50°C IOsec03、結果分析依次進行歸一化處理、溫度平移和差異作圖。以野生型樣本作為基準進行分析，最後根據表一進行結果判斷。從圖3可以看出特納症候群與克氏症候群患者DNA樣本與正常對照DNA樣本能夠明顯區分。兩個檢測的臨床靈敏度與特異性均為100%,
權利要求
1.一種基因拷貝數變異的檢測方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟1)根據待測基因序列在全基因組範圍內篩選相似但不相同的內源性相似序列或者人工合成相應的外源性相似序列；2)將待測基因序列與相似序列進行比對，設計共同的擴增引物；如有需要，還可設計相應的非標記探針；3)採用共同的引物進行PCR，在一個反應管內同時擴增待測基因序列與相似序列；4)高分辨熔解曲線分析PCR產物。
2.根據權利要求1所述的一種基因拷貝數變異的檢測方法，其特徵在於所述相似序列與待測基因序列為同源關係，或是非同源關係。
3.根據權利要求1所述的一種基因拷貝數變異的檢測方法，其特徵在於所述相似序列與待測基因序列位於同一染色體上，或位於不同染色體上。
4.根據權利要求1所述的一種基因拷貝數變異的檢測方法，其特徵在於所述相似序列包括經亞硫酸鹽轉化後形成的相似序列。
5.根據權利要求1所述的一種基因拷貝數變異的檢測方法，其特徵在於所述共同的擴增引物為一對擴增引物，或是多對擴增引物多位點驗證。
6.根據權利要求1所述的一種基因拷貝數變異的檢測方法，其特徵在於所述共同的擴增引物與模板完全匹配，或是不完全匹配。
7.根據權利要求1所述的一種基因拷貝數變異檢測的方法，其特徵在於所述高分辨熔解曲線分析採用DNA飽和性染料。
8.根據權利要求1所述的一種基因拷貝數變異檢測的，其特徵在於所述的DNA飽和性染料包括EvaGreen染料、LC Green PLUS染料、ResoLight染料或SYTO 9染料。
9.根據權利要求1所述的一種基因拷貝數變異的檢測方法，其特徵在於所述高分辨熔解曲線分析數據處理方式包括歸一化處理、溫度平移和差異作圖。
全文摘要
本發明涉及基因檢測領域，尤其涉及一種基因拷貝數變異的檢測方法。該方法通過挑選與待測基因序列相似但不相同的內源性或外源性相似序列，設計相應的引物對待測基因序列與相似序列同時進行擴增，隨後進行高分辨熔解曲線分析。當待測基因發生拷貝數變異時，其高分辨熔解曲線分析結果將與野生型待測基因分析結果明顯區分，從而達到檢測的目的。本發明所述方法不僅可應用於基因拷貝數變異檢測，同樣適用於染色體非整倍體檢測。本發明所述方法不僅適用於基因拷貝數變異和染色體非整倍體的人群篩查與常規產前診斷，同樣適用於無創產前診斷。本發明所述方法具有快速、準確、高靈敏度、高特異性、高通量、低成本、無汙染等優點。
文檔編號C12Q1/68GK102409088SQ201110284638
公開日2012年4月11日 申請日期2011年9月22日 優先權日2011年9月22日
發明者周裕林, 左正宏, 郭奇偉 申請人:郭奇偉