一種新的人蛋白質及其編碼序列,以及製法和用途的製作方法

2023-10-19 02:39:37

專利名稱：一種新的人蛋白質及其編碼序列,以及製法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發明涉及人OSP的cDNA序列，該cDNA編碼的蛋白是大鼠PRAP和小鼠m17HSD7的同系物。本發明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
生物體的各個組織器官的發育在時空上受到機體的嚴密調控。在不同組織中，在生物體不同的發育階段中，往往有一特異性的蛋白表達。這些蛋白或是對組織的發育有調控作用，或是由組織發育到一定階段後才被誘導表達行使一定的功能。
早在1990年，Mclean等(Mclean et al．Endocrinology 1990，126(4)1796-1805)就報導在懷孕大鼠中特異表達黃體(corpus luteum)中的一個約32KDa的蛋白。他們進一步的研究表明，該蛋白僅在大黃體細胞(large luteal cell)中被表達和磷酸化，並且它的表達可以受到黃體中合成的雌激素的調控。這樣，該蛋白被認為是大黃體細胞和雌激素的功能的一個重要的標記。二年後，他們又報導該蛋白在孕中期的大鼠的大黃體細胞中有大量的表達，而這一時期又恰好是黃體細胞體積顯著增加，功能顯著增強的時期。研究同時顯示該蛋白的表達受到多種tropichormones(包括雌激素和催乳素(PRL))的調控。這些結果表明該蛋白可能在黃體的生長和功能調控方面有著重要作用(Parmer et al．Endocrinology，1992，131(5)2213-2221)。
1996年，同一實驗室應用功能克隆法，成功地克隆了編碼這一蛋白的cDNA(Duan et al．J．Biol．Chem．1996，341(26)15602-15607)。該cDNA推導的胺基酸序列與已知的蛋白沒有顯著的同源性。運用免疫沉澱法發現，該蛋白可與PRL受體結合。已知PRL受體具有多種構型。如，在大鼠中就有兩種PRL受體，一種為長鏈受體，另一種為短鏈受體。兩者具有相同的胞外和穿膜區，但是其胞內部分的長度和胺基酸序列是不同的(Boutin et al．Cell 1988，5369-77；Shirota et al．Mol．Endocrinol．1990，41136-1143；Zhang et al．Biochem．Biophys．Res．Commun1990，168415-422)。當PRL與長鏈受體結合後，可以通過Jak2-STAT5途徑進而誘導相應的蛋白表達。但對同短鏈受體在PRL信號傳導中的作用則不甚明了。為了探明所發現的蛋白究竟與哪一種PRL受體結合，運用重組蛋白的手段研究發現該蛋白與PRL短鏈受體結合，並因此而被命名為催乳素受體相關蛋白(PRLreceptor associated protein，PRAP)。以上事實提示PRAP在介導PRL的信號傳導中發揮重要作用。
有趣的是不久以後，Nokelainen等(Nokelainen，et al．MolecularEndocrinology 1998，121048-1059)又報導在小鼠中克隆了一個新的cDNA，該cDNA編碼一37KDa的蛋白(被命名為m17HSD7，17 β-Hydroxysteroiddehydrogenases／17-ketosteroid reductases 7(17 β-羥基類固醇脫氫酶／17-酮類固醇還原酶7))，並與大鼠PRAP(rPARP)具有89％的同一性。結構分析發現，該37KDa蛋白具有短鏈脫氫酶／還原酶家族成員的特徵。對m17HSD7及rPARP的酶活性分析發現兩者都可催化雌酮(E1)向雌二酮(E2)的轉變。以上證據以表明m17HSD7和rPARP是17HSD家族成員。
然而，在本發明之前，還沒有公開或分離出人OSP的序列。
本發明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼大鼠PRAP和小鼠m17HSD7的同系物，本發明的cDNA被命名為人OSP。
本發明的另一個目的是提供一種新的人的大鼠PRAP和小鼠m17HSD7的同系物蛋白，該蛋白被命名為人OSP蛋白。本發明涉及的OSP cDNA和蛋白質與上述大鼠PARP和小鼠m17HSD7有高度的同源性，被認為是它們在人中的同系物，即可能是人PRL短鏈受體或是人17HSD家族成員之一(迄今已在人中發現了4種不同的17HSD)。
本發明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產所述的新的人OSP多肽的方法。
本發明還提供了這種人OSP核酸序列和多肽的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人OSP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO．4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離的人OSP蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO．4胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO．4序列的多肽。
在本發明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發明的另一方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發明的另一方面，提供了一種產生具有人OSP蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人OSP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成人OSP蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人OSP蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人OSP蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人OSP蛋白活性的多肽。
在本發明的一個具體實施方案中，本發明的分離的多核苷酸全長為1193個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO．3，其中開放讀框位於30-1055位核苷酸。
在本發明中，「分離的」、「純化的」或「基本純的」DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語「人OSP蛋白(或多肽)編碼序列」指編碼具有人OSP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO．3中30-1055位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID NO．3序列的編碼框30-1055位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID NO．3中30-1055位核苷酸序列同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO．4所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術語還包括與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人OSP相同功能的蛋白的、SEQ ID NO．4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和／或取代，以及在5』和／或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，「基本純的」蛋白質或多肽是指其至少佔樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語「人OSP蛋白多肽」指具有人OSP蛋白活性的SEQ ID NO．4序列的多肽。該術語還包括具有與人OSP蛋白相同功能的、SEQ ID NO．4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和／或取代，以及在C末端和／或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和／或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人OSP蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人OSP DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人OSP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人OSP多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了人OSP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人OSP多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
發明還提供人OSP蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人OSP多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，「人OSP保守性變異多肽」指與SEQ ID No．4的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。
表1
本發明還包括人OSP多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用於抑制細胞內人OSP的表達。
本發明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人OSP多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼人OSP的核酸分子。
本發明還包括檢測人OSP核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於人OSP多肽的編碼序列，並可位於該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然後將編碼本發明多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰近，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發明還包括對人OSP DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於人OSP基因產物或片段。較佳地，指那些能與人OSP基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制人OSP蛋白的分子，也包括那些並不影響人OSP蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人OSP基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No．4，946，778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的人OSP基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人OSP或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur．J．Immunol．6511，1976；Kohler等人，Eur．J．Immunol．6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N．Y．，1981)。本發明的抗體包括能阻斷人OSP功能的抗體以及不影響人OSP功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人OSP基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與人OSP基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E．Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
本發明的人OSP核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
在本發明的一個實施例中，人OSP的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人卵巢λgtllcDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物-A5′-TCACTGCTTGGAAGTGTGAGTGC-3′為正向引物，寡核苷酸B5′-CTACATGCGCATGCCACCACACC-3′為反向引物，進行PCR。對擴增產物進行測序後得到SEQ ID NO．3的全長cDNA序列。
人OSP是一種在孕中期卵巢中特異表達的蛋白，它被認為可能是一種新的PRL的短鏈受體，從而在PRL的功能發揮中起重要作用。同時OSP還具有短鏈脫氫酶／還原酶家族的特徵。對OSP在大鼠和小鼠中的同系物的研究發現它們都有催化E1向E2轉化的酶學活性，提示OSP也具有該種酶學活性，從而在E2的合成中發揮作用。
此外，由於本發明的人OSP具有源自人的天然胺基酸序列，因此，與來源於其他物種的同族或同類蛋白相比，預計在施用於人時將具有更高的活性和／或更低的副作用(例如在人體內的免疫原性更低或沒有)。
在附圖中，

圖1為本發明的人OSP與大鼠rPARP(AAC52623)及小鼠m17HSD7(CAA75742)等3種蛋白的胺基酸序列同源比較圖。其中，相同的胺基酸在序列下方用「*」標出，相似的胺基酸用「」或「．」標出。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1人OSP的cDNA序列的克隆和測定1．引物擴增以人卵巢λgtllcDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物--A5′-TCACTGCTTGGAAGTGTGAGTGC-3′(SEQ ID NO1)為正向引物，寡核苷酸B5′-CTACATGCGCATGCCACCACACC-3′(SEQ ID NO2)為反向引物，進行PCR．A／B的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、66℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環，最後72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到約1200bp的目的片段。
2．PCR產物的測序將上述PCR擴增產物A／B與pGEM-T載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質粒，用SequiThermEXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對質粒進行測序，最後用電腦軟體拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1193bp，詳細序列見SEQ ID NO．3，其中開放讀框位於30-1055位核苷酸。
根據得到的全長cDNA序列推導出人OSP的胺基酸序列，共341個胺基酸殘基，其胺基酸序列詳見SEQ ID NO．4．實施例2同源比較用本發明的人OSP的cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB資料庫及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR資料庫中，用BLAST程序進行核酸和蛋白同源檢索。結果發現，它們與大鼠PARP(AAC52623)及小鼠m17HSD7(CAA75742)具有很高的同源性，同源比較發現它們在蛋白水平上的同一性分別達到了79．2％和74．2％(圖1)。大鼠PARP被認為是PRL短鏈受體的一種(Duan et al．J．Biol．Chem．1996，341(26)15602-15607)；並且，其它實驗還發現PARP與小鼠m17HSD7都具有催化雌酮(E1)向雌二酮(E2)的轉變的酶活性，被認為是一種新的17HSD。根據結構決定功能，結構相似功能相關的生物學原理，可以依據PARP和17HSD7的功能來推測本發明蛋白的功能。
PRL對於黃體的功能具有重要意義。它能通過誘導促黃體素釋放激素受體mRNA水平的提高，增強促黃體素釋放激素受體在受孕大鼠的黃體中的活性(Gibori Richards Endocrinology 1978，102767-774；Segaloff et al．Mol Endocrinol1990，41856-1865)。它還能維持黃體中升高的雌激素的水平(Gibori et al．BiolReprod 1979，21419-424；Gibori et al．Endocrinology 1978，1176-1182；Basuray etal．Biol Reprod 1983，28551-556)。除此之外，PRL還能刺激黃體蛋白的合成，因此可能與導致大黃體細胞的過度生長有關(Albarracin et al．J．Biol．Chem．1994，269，7772-7776)。PRL還能通過抑制20α-羥基類固醇脫氫酶(20α-hydroxysteroid dehydrogenase)的表達來維持孕酮的高水平，從而減少孕激素轉變為非活性的形式(Albarracin et al．Endocrinology 1994，1342453-2460)。
雖然已有大量關於PRL重要功能的報導，然而對於其作用機制的研究卻仍不清。已知PRL受體具有多種構型，如，在大鼠中就有長鏈和短鏈兩種PRL受體，另外還有一種中間形態的受體被克隆(Ali et al．J．Biol．Chem．1991，266，20110-20117)。研究發現，在Nb2細胞中長鏈與中間形態受體都可以通過與蛋白激酶來傳遞信號。然而，對短鏈受體的作用卻不甚了解。然而，PRL短鏈受體在許多組織中的廣泛表達特性(Nagano et al．J．Biol．Chem．2691337-13345)暗示它在信號傳遞過程中發揮了特定的作用。另外一些證據表明短鏈受體也能傳遞信號並刺激細胞的增殖(Das et al．Mol Endocrinol 1995，91750-1759)。在大鼠中發現在黃體細胞中PRAP能與PRL短鏈受體結合暗示短鏈受體對於PRL的功能同樣是重要的，並且PRAP可能在其中發揮了特定的作用。
對PRAP的表達特徵分析同樣支持上述推測。Duan等(Duan et al．Endocrinology 1997，138(8)3216-3221)發現PRAP僅在黃體組織中有表達(有5．5、4．3和1．8Kb三種轉錄本)，而在其它檢測的組織中沒有發現表達的跡象。雌二醇可以上調PRAP(尤其是4．3和1．8Kb轉錄本)的表達。另外，雖然PRAP的mRNA和蛋白在孕早期很難被檢測到，然而在孕中期它們的表達量卻急劇上升。PRAP的這種組織和發育過程中的特異表達特徵，以及它受雌二醇上調表達的特點說明PRAP對於雌二醇和PRL在黃體中的功能的發揮可能有重要的關係。
然而，Nokelainen等(Nokelainen，et al．Molecular Endocrinology 1998，121048-1059)又報導在小鼠中克隆了一個與PRAP高度同源的cDNA，m17HSD7。他們在對PRAP和m17HSD7的結構分析中發現，兩種蛋白都具有短鏈脫氫酶／還原酶家族成員的特徵。酶學分析發現兩者都可催化雌酮(E1)向雌二酮(E2)的轉變。以上證據以表明m17HSD7和rPARP是17HSD家族成員之一。此對本發明的蛋白序列進行分析，同樣也發現了短鏈脫氫酶／還原酶家族的保守序列。該保守序列的特徵為[LIVSPADNK]-x(12)-Y-[PSTAGNCV]-[STAGNQCIVM]-[STAGC]-K-{PC}-[SAGFYR]-[LIVMSTAGD]-x(2)-[LIVMFYW]-x(3)-[LIVMFYWGAPTHQ]，其中[]內的胺基酸符號表達其中任意的一個胺基酸，x(n)表示n個任意胺基酸，{}表示該位不可能為括號內的胺基酸。在本發明的蛋白序列中，符合該保守序列的是S180LEDFQHSKGKEPYSSSKYATDLLSVAL207，其中S180，Y193和K197是對催化活性重要的三個殘基(Puranen et al．Endocrinology 1997，1383532-3539；Ghosh et al Structure 1995，3503-513；Puranen et al Mol Endocrinol 1997，1177-86)。據Nokelainen等對m17HSD7的酶動力學研究，雌酮是其優先底物，因此，它可能在雌二醇的合成中是必需的。
由於本發明的OSP蛋白在一級結構上與PRAP和m17HSD7有著高度的相似性，並且如上分析，它也具有HSD家族的結構特徵，因此它被認為與PRAP和m17HSD7一樣，可能是人中PRL的又一新的短鏈受體，從而在PRL和黃體的功能發揮中起作用；並且／或者具有17HSD的酶活，從而在合成雌二醇或其它物質中發揮作用。
另外，用prosite程序對本發明OSP蛋白的序列分析中，發現其N末端(1-19位)是一信號肽序列，因而OSP是一個分泌蛋白。
本發明的人OSP除了可作為該家族一員用於進一步的功能研究，還可用於與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發明人OSP還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。例如將本發明人OSP的N端與大鼠rPRAP的N端進行交換，以產生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發明人OSP的抗體，用於篩選該家族的其他成員，或者用於親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發明人OSP核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人OSP的表達水平或者抑制人OSP的過度表達。本發明的人OSP蛋白或其活性多肽片段可以施用於病人，以治療或減輕因人OSP缺失、無功能或異常而導致的有關病症。此外，還可以用基於本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預後判斷。
實施例3人OSP在大腸桿菌中的表達在該實施例中，以實施例1中PCR擴增產物A／B為模板，將編碼人OSP的cDNA序列用對應於該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO．5和6)進行擴增，獲得人OSP cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5 ′-TCAGGGATCCATGCGAAAGGTGGTTTTGAT-3′(SEQ ID NO．5)，該引物含有BamHⅠ限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之後是由起始密碼子開始的人OSP編碼序列的20個核苷酸；3′端引物序列為5-TTGGAAGCTTTTATAGGCATGAGCCACTG-3i(SEQ ID NO．6)，該引物含有HindⅢ限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和人OSP的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc．，Chatsworth，CA)上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌複製起點(ori)、一個IPTG-可調啟動子／操縱子(P／O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內切酶克隆位點。
用BamHⅠ和HindⅢ消化pQE-9載體及插入片段，隨後將插入片段連接到pQE-9載體並保持開放讀框在細菌RBS起始。隨後用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15／rep4的E．coli菌株，M15／rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達1acⅠ阻遏物並攜帶卡那黴素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養皿上篩選轉化子，抽提質粒，測序驗證人OSP的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg／ml)和Kan(25μg／ml)的LB液體培養基中過夜培養(O／N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。過夜(O／N)培養物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然後接種到大體積培養基中，培養細胞生長至600光密度(OD600)為0．4-0．6時，加入IPTG(「異丙基硫代-β-D-半乳糖苷」)至終濃度為1mM。通過使1acⅠ阻遏物失活，IPTG誘導啟動P／O導致基因表達水平提高。繼續培養細胞3-4小時，隨後離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞並將細胞沉澱溶於6M的鹽酸胍中。澄清後，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人OSP。用6M鹽酸胍(pH5．0)從柱中洗脫人OSP。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉澱蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化後的蛋白質被結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質變性，隨後用鹽酸胍(pH5．0)洗脫。最後，將可溶的蛋白質用PBS進行透析，然後將蛋白質保存在終濃度為10％(w／v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定表達蛋白的分子量大小為約38．2KDa。
此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQ ID NO．4的序列一致。
實施例4人OSP在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，以實施例1中PCR擴增產物A／B為模板，將編碼人OSP的cDNA序列用對應於該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO．7和8)進行擴增，獲得人OSP cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGAAGCTTATGCGAAAGGTGGTTTTGAT-3′(SEQ ID NO．7)
該引物含有HindⅢ限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之後是由起始密碼子開始的人OSP編碼序列的20個核苷酸；3′端引物序列為5i-TTGGGGATCCTTATAGGCATGAGCCACTG-3i(SEQ ID NO．8)該引物含有BamHⅠ限制性內切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和人OSP的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體複製起點(f1 ori)、一個病毒複製起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用HindⅢ和BamHⅠ消化pcDNA3載體及插入片段，隨後將插入片段連接到pcDNA3載體。隨後用連接混合物轉化E．coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg／ml)的LB液體培養基中過夜培養(O／N)含所需構建物的克隆。抽提質粒經測序驗證人OSP的cDNA片段已正確插入了載體。
質粒轉染CHO細胞是採用脂轉染法，用Lipofectin(GiBco Life)進行的。轉染48小時後，經2-3周的持續G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續傳代培養；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規方法大量培養上述陽性亞克隆。48小時後，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0．05％Triton的50mMTris·HCl(pH7．6)溶液為平衡液及洗脫液，用經預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8．0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8．0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然後以PBS(pH7．4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最後凍幹保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定表達蛋白的分子量大小約為38．2KDa。
此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQ ID NO．4的序列一致。
實施例5製備抗體將實施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離後備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，並用等體積的完全Freund s佐劑乳化。用50-100μg／0．2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天後，用非完全Freundis佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg／0．2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉澱人OSP基因翻譯產物的能力加以評估。結果發現，抗體可特異性地與本發明蛋白發生沉澱。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人復旦大學(ⅱ)發明名稱一種新的人蛋白質及其編碼序列，以及製法和用途(ⅲ)序列數目8(2)SEQ ID NO．1的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度23鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．1TCACTGCTTG GAAGTGTGAG TGC 23(2)SEQ ID NO．2的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度23鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2CTACATGCGC ATGCCACCAC ACC 23(2)SEQ ID NO．3的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度1193bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)序列描述SEQ ID NO．3TCACTGCTTG GAAGTGTGAG TGCGCGAAGA TGCGAAAGGT GGTTTTGATC ACCGGGGCTA 60GCAGTGGCAT TGGCCTGGCC CTCTGCAAGC GGCTGCTGGC GGAAGATGAT GAGCTTCATC 120TGTGTTTGGC GTGCAGGAAC ATGAGCAAGG CAGAAGCTGT CTGTGCTGCT CTGCTGGCCT 180CTCACCCCAC TGCTGAGGTC ACCATTGTCC AGGTGGATGT CAGCAACCTG CAGTCGGTCT 240TCCGGGCCTC CAAGGAACTT AAGCAAAGGT TTCAGAGATT AGACTGTATA TATCTAAATG 300CTGGGATCAT GCCTAATCCA CAACTAAATA TCAAAGCACT TTTCTTTGGC CTCTTTTCAA 360GAAAAGTGAT TCATATGTTC TCCACAGCTG AAGGCCTGCT GACCCAGGGT GATAAGATCA 420CTGCTGATGG ATTTCAGGAG GTGTTTGAGA CCAATGTCTT TGGCCATTTT ATCCTGATTC 480GGGAACTGGA GCCTCTCCTC TGTCACAGTG ACAATCCATC TCAGCTCATC TGGACATCAT 540CTCGCAGTGC AAGGAAATCT AATTTCAGCC TCGAGGACTT CCAGCACAGC AAAGGCAAGG 600AACCCTACAG CTCTTCCAAA TATGCCACTG ACCTTTTGAG TGTGGCTTTG AACAGGAACT 660TCAACCAGCA GGGTCTCTAT TCCAATGTGG CCTGTCCAGG TACAGCATTG ACCAATTTGA 720CATATGGAAT TCTGCCTCCG TTTATATGGA CGCTGTTGAT GCCGGCAATA TTGCTACTTC 780GCTTTTTTGC AAATGCATTC ACTTTGACAC CATATAATGG AACAGAAGCT CTGGTATGGC 840TTTTCCCACC AAAAGCTGAA TCTCTCAATC CTCTGATCAA ATATCTGAGT GGCACCACTG 900CTTTGGAAGA AATTTACATT ATGACCCAGA AGATGGACCT AGATGAAGAC ACTGCTGAAA 960AATTTTATCA AAAGTTACTG GAACTGGAAA AGCACATTAG GGTCACTATT CAAAAAACAG 1020ATAATCAGGC CAGGCTCAGT GGCTCATGCC TATAATTCCA GCACTTTGGG AGGCCAAGGC 1080AGAAGGATCA CTTGAGACCA GGAGTTCAAG ACCAGCCTGA GAAACATAGT GAGCCCTTGT 1140CTCTACAAAA AGAAATAAAA ATAATAGCTG GGTGTGGTGG CATGCGCATG TAG1193(2)SEQ ID NO．4的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度341個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．4MRKVVLITGA SSGIGLALCK RLLAEDDELH LCLACRNMSK AEAVCAALLA SHPTAEVTIV 60QVDVSNLQSY FRASKELKQR FQRLDCIYLN AGIMPNPQLN IKALFFGLFS RKVIHMFSTA 120EGLLTQGDKI TADGFQEVFE TNVFGHFILI RELEPLLCHS DNPSQLIWTS SRSARKSNFS 180LEDFQHSKGK EPYSSSKYAT DLLSVALNRN FNQQGLYSNV ACPGTALTNL TYGILPPFIW 240TLLMPAILLL RFFANAFTLT PYNGTEALVW LFPPKAESLN PLIKYLSGTT ALEEIYIMTQ 300KMDLDEDTAE KFYQKLLELE KHIRVTIQKT DNQARLSGSC L 341(2)SEQ ID NO．5的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度30鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．5TCAGGGATCC ATGCGAAAGGTGGTTTTGAT 30(2)SEQ ID NO．6的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．6TTGGAAGCTT TTATAGGCAT GAGCCACTG 29(2)SEQ ID NO．7的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度30鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．7TCAGAAGCTT ATGCGAAAGGTGGTTTTGAT 30(2)SEQ ID NO．8的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．8TTGGGGATCC TTATAGGCATGAGCCACTG 29
權利要求
1．一種分離出的DNA分子，其特徵在於，它包括編碼具有人OSP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列雜交。
2．如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO．4所示的序列。
3．如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，該序列具有SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列。
4．一種分離的人OSP蛋白多肽，其特徵在於，它包括具有SEQ ID NO．4胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5．如權利要求4所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQ ID NO．4序列的多肽。
6．一種載體，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA。
7．一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8．一種產生具有人OSP蛋白活性的多肽的方法，其特徵在於，該方法包括(a)將編碼具有人OSP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成人OSP蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人OSP蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人OSP蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人OSP蛋白活性的多肽。
9．一種能與權利要求4所述的人OSP蛋白多肽特異性結合的抗體。
10．一種探針分子，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。
全文摘要
本發明提供了一種新的人OSP的cDNA序列,該cDNA編碼的蛋白是大鼠PRAP和小鼠m17HSD7的同系物。本發明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
文檔編號A61K39/395GK1290748SQ99108928
公開日2001年4月11日 申請日期1999年6月29日 優先權日1999年6月29日
發明者餘龍, 傅強, 趙勇, 張宏來, 趙壽元 申請人:復旦大學