一種蚓激酶乾粉製作工藝的製作方法
2023-09-16 02:57:10
專利名稱：一種蚓激酶乾粉製作工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥技術領域，尤其涉及一種蚓激酶乾粉製作工藝。
背景技術：
蚓激酶是一種從蚯蚓體內提取分離而得的一組蛋白水解酶類，其主要成分為纖維蛋白溶酶和纖維蛋白溶酶原激活劑，這兩種成分通過直接降解纖維蛋白原和激活纖溶酶的雙重作用，能夠降低纖維蛋白原含量和血小板的聚集率，增強纖溶系統活性，糾正腦梗死後的凝血和纖溶異常，對治療心絞痛、急性腦梗、高血脂、高血壓等疾病，減輕患者病痛都具有良好的療效。蚓激酶是目前最有開發前景的纖溶藥物之一，無論靜脈注射還是口服給藥，溶栓效果都很明顯。目前，製作蚓激酶乾粉首先需要提取蚓激酶，常用的提取蚓激酶的方法有鹽析，繼而採用多種層析及HPLC、FPLC、親和層析、或離子交換、分子篩、凝膠電泳等手段從不同品系的蚯蚓中獲得多種蚓激酶，但此類提取方法操作麻煩，流程長，對酶活力的損失也較大，提取的蚓激酶質量標準低，這些特點限制了蚓激酶乾粉的工業化生產，不能很好的滿足我國重大疾病防治和醫藥產業發展的需求。
發明內容
本發明為解決公知技術中存在的技術問題而提供一種有效成分含量高、質量易控、且利於工業化生產的蚓激酶乾粉製作工藝。本發明為解決公知技術中存在的技術問題所採取的技術方案是:
一種蚓激酶乾粉製作工藝，其特徵在於包括以下步驟:
1)鮮蚓處理:在地面或筐中將蚯蚓體表面的泥土層層除去，然後將蚯蚓鋪成薄層，光照射10-18h，使蚯蚓排出汙物，再利用清洗機清洗蚯蚓表面的泥和粘浮物，塑料桶盛裝經上述處理的蚯蚓，然後放入冷庫中貯存備用；
2)製漿:加入蚯蚓體積3-5倍的濃度為0.lmol/L的乙醇檸檬酸鈉緩衝液，利用膠體磨或高速組織均質機將清理過的蚯蚓進行細胞破碎，製成勻漿；
3)除渣:將經步驟2)製得的勻漿經離心機離心去除粗渣，收集上清液；
4)鹽析:向經步驟3)處理收集的上清液中加入硫酸銨，利用攪拌機攪拌至完全溶解，使製得的飽和溶液中硫酸銨的質量分數為30%-40%，然後靜止放置1-1.5h，製得飽和溶液；
5)離心:利用高速離心機離心分離經步驟4)製得的飽和溶液，去除其中含有的細渣，得到澄清液；
6)超濾:取經步驟5)處理得到的澄清液，採用50000dt的超濾膜超濾，得超濾液；
7)柱層析分離:用泵將超濾液輸送到下料桶，然後混合上樣，待上樣完畢，利用洗滌液洗滌流出液呈淡黃色，PH為7.0-8.0,呈鹼性之後，再用 弱鹼性液洗脫至洗脫液變渾濁，顏色由黃變紅，流出液電導率高於洗脫液電導率時開始收集流出液，當流出液開始變澄清，顏色呈淡橙色，電導率達到洗脫液電導率時停止洗脫，得收集液；8)濃縮和二次超濾:將經步驟7)得到的收集液倒入貯存罐內，開啟濃縮泵，調節轉速為21X12rpm，調節壓力小於等於0.1Mpa，濃縮至收集液體積為原來的1/14-1/15，收集濃縮液按步驟6)進行超濾，超濾至澄清後上洗脫柱用去離子水脫鹽，最後洗脫至濃縮液pH為7.0，體積為收集液體積的1/16-1/20時止，得濃縮液；
9)過濾和除菌:用澄清型和除菌型液淨濾板過濾步驟8)製得的濃縮液2-3遍，至濾液澄清，然後用0.22 μ m的微孔濾膜對濾液進行過濾滅菌，得料液成品；
10)噴幹:利用乾燥塔，控制乾燥塔出口溫度為80-86°C，乾燥經上述步驟處理得到的料液成品，收集乾燥後製得的蚓激酶乾粉。所述步驟2)的乙醇檸檬酸鈉緩衝液的pH7.0-8.0。所述步驟7)的收集液電導率大於或等於9000 μ s/ Cm。
本發明的有益效果為:本發明與現有技術相比，優點在於本發明採用多次超濾和微孔過濾，能有效去除懸浮顆粒和小分子雜蛋白、核酸，雜菌等雜質，提高蚓激酶的純度，進而獲得純度高、活性好的蚓激酶乾粉；另外，整個製作過程各個環節相互緊湊，有效提高了中間介質的純度和處理液的工作能力，且原料來源豐富、價格低廉，適合工業化生產。
具體實施例方式為能進一步了解本發明內容、特點及功效，茲例舉以下實施例詳細說明如下: 實施例1:取IOOKg鮮蚯蚓，在地面將蚯蚓體表面的泥土層層除去，然後將蚯蚓鋪成薄
層，光照射10h，使蚯蚓排出汙物，再利用清洗機清洗蚯蚓表面的泥和粘浮物，塑料桶盛裝經上述處理的蚯蚓，然後放入冷庫中貯存備用；加入蚯蚓體積3倍的濃度為0.lmol/L, pH為
7.8的乙醇檸檬酸鈉緩衝液，利用膠體磨或高速組織均質機將清理過的蚯蚓進行細胞破碎，製成勻漿；將製得的勻漿經離心機離心去除粗渣，收集上清液；向上清液中加入硫酸銨，利用攪拌機攪拌至完全溶解，使製得的飽和溶液中硫酸銨的質量分數為30%，然後靜止放置
1.0h，製得飽和溶液；利用高速離心機離心分離飽和溶液，去除其中含有的細渣，得到澄清液；採用50000dt的超濾膜超濾澄清液，得超濾液；用泵將超濾液輸送到下料桶，然後混合上樣，待上樣完畢，利用洗滌液洗滌流出液呈淡黃色，PH為7.0，呈鹼性之後，再用弱鹼性液NH3H2O洗脫至洗脫液變渾濁，顏色由黃變紅，流出液電導率高於洗脫液電導率時開始收集流出液，當流出液開始變澄清，顏色呈淡橙色，電導率達到洗脫液電導率時停止洗脫，得收集液；將收集液倒入貯存罐內，開啟濃縮泵，調節轉速為21X12rpm，調節壓力為0.1Mpa，濃縮至收集液體積為原來的1/14，收集濃縮液再進行超濾，超濾至澄清後上洗脫柱用去離子水脫鹽，最後洗脫至濃縮液PH為7.0，體積為收集液體積的1/16時止，得濃縮液；用澄清型和除菌型液淨濾板將濃縮液過濾2遍，至濾液澄清，然後用0.22 μ m的微孔濾膜對濾液進行過濾滅菌，得料液成品；最後，利用乾燥塔，控制乾燥塔出口溫度為80°C，乾燥經上述步驟處理得到的料液成品，收集乾燥後製得的蚓激酶乾粉。所述用的乙醇檸檬酸鈉緩衝液的ρΗ5.0,收集液電導率大於或等於9000 μ s/ Cm。實施例2 -M IOOKg鮮蚯蚓，在地面將蚯蚓體表面的泥土層層除去，然後將蚯蚓鋪成薄層，光照射15h，使蚯蚓排出汙物，再利用清洗機清洗蚯蚓表面的泥和粘浮物，塑料桶盛裝經上述處理的蚯蚓，然後放入冷庫中貯存備用；加入蚯蚓體積4倍的濃度為0.1mol/L, pH為7.8的乙醇檸檬酸鈉緩衝液，利用膠體磨或高速組織均質機將清理過的蚯蚓進行細胞破碎，製成勻漿；將製得的勻漿經離心機離心去除粗渣，收集上清液；向上清液中加入硫酸銨，利用攪拌機攪拌至完全溶解，使製得的飽和溶液中硫酸銨的質量分數為35%，然後靜止放置1.3h，製得飽和溶液；利用高速離心機離心分離飽和溶液，去除其中含有的細渣，得到澄清液；採用50000dt的超濾膜超濾澄清液，得超濾液；用泵將超濾液輸送到下料桶，然後混合上樣，待上樣完畢，利用洗滌液洗滌流出液呈淡黃色，PH為7.5，呈鹼性之後，再用弱鹼性液三乙胺洗脫至洗脫液變渾濁，顏色由黃變紅，流出液電導率高於洗脫液電導率時開始收集流出液，當流出液開始變澄清，顏色呈淡橙色，電導率達到洗脫液電導率時停止洗脫，得收集液；將收集液倒入貯存罐內，開啟濃縮泵，調節轉速為21 X 12rpm，調節壓力為
0.0SMpa,濃縮至收集液體積為原來的1/14，收集濃縮液再進行超濾，超濾至澄清後上洗脫柱用去離子水脫鹽，最後洗脫至濃縮液PH為7.0，體積為收集液體積的1/18時止，得濃縮液；用澄清型和除菌型液淨濾板將濃縮液過濾3遍，至濾液澄清，然後用0.22 μ m的微孔濾膜對濾液進行過濾滅菌，得料液成品；最後，利用乾燥塔，控制乾燥塔出口溫度為83°C，乾燥經上述步驟處理得到的料液成品，收集乾燥後製得的蚓激酶乾粉。所述用的乙醇檸檬酸鈉緩衝液的PH5.2，收集液電導率大於或等於9000 μ s/ Cm。實施例3:取IOOKg鮮蚯蚓，在地面將蚯蚓體表面的泥土層層除去，然後將蚯蚓鋪成薄層，光照射18h，使蚯蚓排出汙物，再利用清洗機清洗蚯蚓表面的泥和粘浮物，塑料桶盛裝經上述處理的蚯蚓，然後放入冷庫中貯存備用；加入蚯蚓體積5倍的濃度為0.lmol/L,pH為7.8的乙醇檸檬酸鈉緩衝液，利用膠體磨或高速組織均質機將清理過的蚯蚓進行細胞破碎，製成勻漿；將製得的勻漿經離心機離心去除粗渣，收集上清液；向上清液中加入硫酸銨，利用攪拌機攪拌至完全溶解，使製得的飽和溶液中硫酸銨的質量分數為40%，然後靜止放置1.5h，製得飽和溶液；利用高速離心機離心分離飽和溶液，去除其中含有的細渣，得到澄清液；採用50000dt的超濾膜超濾澄清液，得 超濾液；用泵將超濾液輸送到下料桶，然後混合上樣，待上樣完畢，利用洗滌液洗滌流出液呈淡黃色，pH為8.0，呈鹼性之後，再用弱鹼性液洗脫至洗脫液變渾濁，顏色由黃變紅，流出液電導率高於洗脫液電導率時開始收集流出液，當流出液開始變澄清，顏色呈淡橙色，電導率達到洗脫液電導率時停止洗脫，得收集液；將收集液倒入貯存罐內，開啟濃縮泵，調節轉速為21X12rpm，調節壓力為0.09Mpa，濃縮至收集液體積為原來的1/15，收集濃縮液再進行超濾，超濾至澄清後上洗脫柱用去離子水脫鹽，最後洗脫至濃縮液PH為7.0，體積為收集液體積的1/20時止，得濃縮液；用澄清型和除菌型液淨濾板將濃縮液過濾3遍，至濾液澄清，然後用0.22 μ m的微孔濾膜對濾液進行過濾滅菌，得料液成品；最後，利用乾燥塔，控制乾燥塔出口溫度為86°C，乾燥經上述步驟處理得到的料液成品，收集乾燥後製得的蚓激酶乾粉。所述用的乙醇檸檬酸鈉緩衝液的ρΗ5.3，收集液電導率大於或等於9000 μ s/ Cm。以上對本發明的具體實施方式
進行詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施方式，不能被認為用於限定本發明的實施範圍。凡依本發明申請範圍所作的均等變化與改進等，均應仍歸屬於本發明的專利涵蓋範圍之內。
權利要求
1.一種蚓激酶乾粉製作工藝，其特徵在於包括以下步驟: 1)鮮蚓處理:在地面或筐中將蚯蚓體表面的泥土層層除去，然後將蚯蚓鋪成薄層，光照射10-18h，使蚯蚓排出汙物，再利用清洗機清洗蚯蚓表面的泥和粘浮物，塑料桶盛裝經上述處理的蚯蚓，然後放入冷庫中貯存備用； 2)製漿:加入蚯蚓體積3-5倍的濃度為0.lmol/L的乙醇檸檬酸鈉緩衝液，利用膠體磨或高速組織均質機將清理過的蚯蚓進行細胞破碎，製成勻漿； 3)除渣:將經步驟2)製得的勻漿經離心機離心去除粗渣，收集上清液； 4)鹽析:向經步驟3)處理收集的上清液中加入硫酸銨，利用攪拌機攪拌至完全溶解，使製得的飽和溶液中硫酸銨的質量分數為30%-40%，然後靜止放置1-1.5h，製得飽和溶液； 5)離心:利用高速離心機離心分離經步驟4)製得的飽和溶液，去除其中含有的細渣，得到澄清液； 6)超濾:取經步驟5)處理得到的澄清液，採用50000dt的超濾膜超濾，得超濾液； 7)柱層析分離:用泵將超濾液輸送到下料桶，然後混合上樣，待上樣完畢，利用洗滌液洗滌流出液呈淡黃色，PH為7.0-8.0，呈鹼性之後，再用弱鹼性液洗脫至洗脫液變渾濁，顏色由黃變紅，流出液電導率高於洗脫液電導率時開始收集流出液，當流出液開始變澄清，顏色呈淡橙色，電導率達到洗脫液電導率時停止洗脫，得收集液； 8)濃縮和二次超濾:將經步驟7)得到的收集液倒入貯存罐內，開啟濃縮泵，調節轉速為21X12rpm，調節壓力小於等於0.1Mpa，濃縮至收集液體積為原來的1/14-1/15，收集濃縮液按步驟6)進行超濾，超濾至澄清後上洗脫柱用去離子水脫鹽，最後洗脫至濃縮液pH為7.0，體積為收集液 體積的1/16-1/20時止，得濃縮液； 9)過濾和除菌:用澄清型和除菌型液淨濾板過濾步驟8)製得的濃縮液2-3遍，至濾液澄清，然後用0.22 μ m的微孔濾膜對濾液進行過濾滅菌，得料液成品； 10)噴幹:利用乾燥塔，控制乾燥塔出口溫度為80-86°C，乾燥經上述步驟處理得到的料液成品，收集乾燥後製得的蚓激酶乾粉。
2.如權利要求1所述的一種蚓激酶乾粉製作工藝，其特徵在於所述步驟2)的乙醇檸檬酸鈉緩衝液的PH7.0-8.0。
3.如權利要求1所述的一種蚓激酶乾粉製作工藝，其特徵在於所述步驟7)的收集液電導率大於或等於9000 μ s/ Cm。
全文摘要
本發明提供一種蚓激酶乾粉製作工藝，其特徵在於包括以下步驟鮮蚓處理、製漿、除渣、鹽析、離心、超濾、柱層析分離、濃縮和二次超濾、過濾和除菌，最後噴幹製得的蚓激酶乾粉。本發明與現有技術相比，優點在於本發明採用多次超濾和微孔過濾，能有效去除懸浮顆粒和小分子雜蛋白、核酸，雜菌等雜質，提高蚓激酶的純度，進而獲得純度高、活性好的蚓激酶乾粉；另外，整個製作過程各個環節相互緊湊，有效提高了中間介質的純度和處理液的工作能力，且原料來源豐富、價格低廉，適合工業化生產。
文檔編號C12N9/48GK103146668SQ201310063359
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月28日 優先權日2013年2月28日
發明者蔡霞 申請人:天津市嘉沃科技有限公司