愛滋病病毒靶細胞cd4+t細胞抵抗和清除hiv-1的極端表達基因群的製作方法

2023-09-16 17:31:05 1

專利名稱：愛滋病病毒靶細胞cd4+t細胞抵抗和清除hiv-1的極端表達基因群的製作方法
技術領域：
本發明涉及人類基因組的疾病相關基因的表達譜研究和特徵基因群的篩選。具體 的講是在人功能基因組範圍內篩選愛滋病相關基因，利用細胞模型和基因晶片技術相結合 的方法建立的愛滋病病毒靶細胞CD4+T細胞抵抗和清除HIV-I的極端表達基因群，屬生物 醫學領域。
背景技術：
愛滋病(AIDS)是一種由 HIV (human immunodeficiency virus，人類免疫缺陷病 毒)引起的嚴重威脅人類健康的重大傳染病。HIV-I天然的靶細胞CD4+T細胞的活化和增 殖是HIV-I得以大量繁殖和廣泛播散的先決條件。1996年Levine等人意外發現，經同時包 被在磁珠上的⑶3、⑶28抗體(「⑶3/⑶28beadS」)刺激後，活化、增殖的⑶4+T細胞，反而 獲得了既能抵抗感染又能清除病毒的能力——來自HIV-I感染者的CD4+T細胞活化後，能 逐漸清除已感染的病毒，來自健康成人的CD4+T細胞活化後，能抵抗HIV-I而不被感染。我 們以此特殊效應為基礎，同時以高度易感並促進病毒增殖的PHA/IL-2活化細胞為反證，構 建細胞模型並篩選出愛滋病病毒靶細胞CD4+T細胞抵抗和清除HIV-I的極端表達基因群。

發明內容
本發明的目的在於提供愛滋病病毒靶細胞CD4+T細胞抵抗和清除HIV-I的極端表 達基因群。本發明通過採用高通量的人表達譜基因晶片，通過比較未刺激、⑶3/⑶28磁珠刺 激(具備抵抗和清除HIV-I能力)及PHA/IL-2刺激(具備易感和支持HIV-I能力)三種狀 態下的CD4+T細胞基因表達差異，篩選在多樣本中有共同表達趨勢的差異基因，得到一組 愛滋病病毒靶細胞CD4+T細胞抵抗和清除HIV-I的極端表達基因群，共包含6個基因，其部 分或全部組合作為篩查抗愛滋細胞藥物的標誌；該基因群在CD4+T細胞抵抗和清除HIV-I 狀態時高表達且在CD4+T細胞易感和支持HIV-I時低表達，基因群中的各基因的名稱、序列 號及主要描述見表1。表1抵抗和清除HIV-I的極端表達基因群(共6個基因)基因名稱 GenBank序列號基因描述
1ACTN2NM_001103Homo sapiens actinin, alpha 22CTHNM_001902Homo sapiens cystathionase (cystathionine gamma-lyase), transcript variant 13IL2NM_000586Homo sapiens interleukin 24IL24NM_006850Homo sapiens interleukin 24, transcript variant 15MAGIlNM_004742Homo sapiens membrane associated guanylate kinase, WW and PDZ domain containing 1, transcript variant 26PYGLNM—002863Homo sapiens phosphorylase, glycogen; liver (Hers disease, glycogen storage disease type VI) 本發明中的極端表達基因群中的基因均參與了造成不同生物學效應的顯著功能 (Gene Ontology, GO)和信號轉導通路(pathway)，同時在信號轉導網絡(Signal-Net)和基 因的調控網絡(GeneRelNet)中處於關鍵結點或重要地位，因此具有代表意義。


圖1顯示抵抗和清除狀態(B)中高表達且易感和支持狀態(P)中低表達的極端表 達基因。
具體實施例方式1.樣本的選擇和處理3例樣本取自雲南昆明血液中心，均為健康人外周血濃縮白細胞。採用密度梯度 離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)，採用CD4+T Cell Isolation Kit II human試劑 盒(Miltenyi公司)對PBMC進行磁珠陰性分選，獲得靜息狀態的CD4+T細胞。使用6孔 培養板每孔3ml微量培養體系在37°C、5% CO2培養箱中對CD4+T細胞進行體外刺激培養， 培養基為RPMI 1640完全培養液[RPMI 1640+10% FBS+0. lmol/L HEPES(上海生工生物公 司)]。⑶3/⑶28磁珠刺激(B組)按細胞磁珠1 3的比例接種1 X IO6⑶4+T細胞/孔 (Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28，Invitrogen 公司)，每 2 天換半液並傳代，維持 細胞密度為1 2X IO6細胞/ml。PHA/IL-2刺激(P組)接種2X106CD4+T細胞/孔，加 入5mg/ml植物血凝素(PHA)和100U/ml白介素_2(IL_2)進行刺激培養，每3天換半液補 充PHA和IL-2。上述細胞刺激6天，連同未刺激(R組)的⑶4+T細胞提取總RNA後作為基 因晶片雜交的樣本。2.基因晶片雜交2. 1總RNA提取及純化採用TRIzol法提取細胞的總RNA，QIAGEN RNeasy Kit純化總RNA，用 NanodropND-1000 分析 RNA 濃度，瓊脂糖電泳或 Agilent BioAnalyzer 2100 進行質檢。2. 2cDNA第一鏈和第二鏈一步法合成1)取2μ g RNA於1. 5ml離心管中，如下配置反應溶液總RNA 2 μ g (最多 6. 5 μ 1)Τ7 Promotor primer 5 μ 1RNase-free Water X μ 1
總體積11·5μ12) 65 °C保溫10分鐘，冰浴5分鐘。3)配置如下cDNA合成體系5XFirst Strand Buffer 4μ 10. IMDTT 2 μ 1IOmM dNTP mix 1 μ 1MMLV RT 1 μ 1RNase OUT 0. 5 μ 1總體積8. 5μ14)將上述8. 5 μ 1 mix加入變性後冰浴的RNA中。5)用槍頭混勻，之後離心。6)PCR 熱蓋65°C，40°C反應2小時；65°C滅活15分鐘；4°C反應5分鐘。
2. 3aaUTP 標記 cRNA 合成1)試劑配製NTP 的配製IOOmMATP 250 μ 1IOOmM GTP 250 μ 1IOOmM CTP 250 μ 1IOOmM UTP 187. 5 μ 1RNase free Η20 62. 5 μ 1Total 1000 μ 12)如下配置 Transcription mix RNase-free Water 5. 7 μ 14X Transcription Buffer 20 μ 1NTP 16 μ 10. IM DTT 6 μ 150% PEG 6. 4 μ 1aa-UTP(25mM) 4 μ 1RNase OUT 0. 5 μ 1Inorganic Pyrophosphatase 0. 6 μ 1T7RNA Polymerase 0.8 μ 1總體積60 μ 13)加入 60 μ 1 Transcription mix 並混勻。4斤0 儀中熱蓋601，401反應2小時。2. 4cRNA純化與濃度測定採用QIAGEN RNeasy Mini kit純化cRNA，用分光光度計分析RNA濃度。按下面 的計算公式確定調整cRNA的含量調整cRNA 含量=RNAm- (total RNAi) (y)RNAm = IVT 後測得 cRNA 量(μ g)
total RNAi =開始總 RNA 的量(μ g)y =在IVT過程中加入的雙鏈cDNA產物佔全部cDNA產物的百分數。2. 5cRNA樣品螢光標記1)取上述cRNA 4 μ g並濃縮至6. 6 μ 1。2)力口 10 μ 1 DMSO 混勻。3)力口 3. 4 μ 1 的 0. 3Μ 碳酸氫鈉(NaHC03) (ρΗ9· 0)並混勻。4)將上述20 μ IcRNA混合物加入到螢光染料(Cy3)中，並混勻。25°C保溫1小時。5.力卩 9 μ 1 的 4Μ Hydroxylamine 混勻後 25°C保溫 15min。2. 6螢光標記cRNA樣品純化採用QIAGEN RNeasy Mini kit 純化 cRNA。2. 7螢光分子濃度及摻入率計算Cy3_ 濃度(pmol/μ 1) = A552/0. 15Cy3-摻入率(pmol/ yg)= Cy3-濃度 /cRNA 濃度(μ g/μ 1)2. 8cRNA 樣品片段化和晶片雜交(4x44K microarrays)1)按下表配製片段化混合液，然後在60°C溫浴30min進行片段化。Cy3cRNA 875ngIOXBlocking Agent 11 μ 125X Fragmentation Buffer 2. 2 μ 1Nuclease-free water X μ 1總體積 55 μ 12)力口入 55μ1 2XGEx Hybridization Buffer。3)取100 μ 1上晶片，65°C 17小時，IOrpm滾動雜交。2. 9晶片洗滌1)取出晶片於洗液1中洗滌1分鐘。2)再將晶片放入洗液2中洗滌1分鐘(37°C )。2. 10晶片掃描Agilent掃描儀中掃描，解析度為5 μ m，掃描儀自動以100%和10% PMT各掃描一 次，兩次結果Agilent軟體可自動合併。3.數據分析3. 1差異基因篩選利用多重比較檢驗(RVM)的F檢驗進行3組樣本的差異基因篩選，按照Pvalue < 0.01, FDR < 0. 01篩選，得到差異表達基因。3. 2基因表達趨勢分析通過篩選得到3組樣本的差異基因後，按照樣本的邏輯順序(P-R-B)，基於基因在 每個樣本下的表達值，對差異基因進行基因表達趨勢的聚類，根據聚類結果將每種處理狀 態下特有的基因歸類，篩選得到差異基因的表達趨勢。3. 3特徵表達基因群的確認對在抵抗和清除狀態(B)且易感和支持狀態(P)中呈現極端表達趨勢的基因(見 圖1)，進行功能(Gene Ontology, GO)和信號轉導通路(pathway)的顯著性分析，尋找具有顯著功能並參與顯著性信號轉到通路的基因；同時在信號轉導網絡(Signal-Net)和基因 的調控網絡(GeneRelNet)中尋找處於關鍵結點或重要地位的基因，將上述數據整合，最終 篩選出具有最高、代表意義的基因從而構建出特徵性的極端表達基因群(如表1所示)。
本發明的極端表達基因群，有望基於其中單個、多個或全部基因建立基因晶片、分 子雜交和RT-PCR的方法檢測樣本中這些基因的mRNA表達水平，根據這些基因的表達水平 診斷愛滋病及篩選抗愛滋細胞藥物。
權利要求
一組愛滋病病毒靶細胞CD4+T細胞抵抗和清除HIV 1的極端表達基因群，其特徵在於該極端表達基因群包含的名稱分別為ACTN2、CTH、IL2、IL24、MAGI1、PYGL，其部分或全部組合作為篩查抗愛滋細胞藥物的標誌；該群基因在CD4+T細胞抵抗和清除HIV 1狀態時高表達且在CD4+T細胞易感和支持HIV 1時低表達。
2.權利要求1所述的愛滋病病毒靶細胞CD4+T細胞抵抗和清除HIV-I的極端表達基因 群，其特徵在於6個基因由SEQ ID NO 1-6所示的核苷酸序列組成。
全文摘要
本發明涉及愛滋病病毒靶細胞CD4+T細胞抵抗和清除HIV-1的極端表達基因群，屬生物醫學領域。本發明通過採用高通量的人表達譜基因晶片，比較未刺激、CD3/CD28磁珠刺激及PHA/IL-2刺激三種狀態的CD4+T細胞基因表達差異，篩選得到愛滋病病毒靶細胞CD4+T細胞抵抗和清除HIV-1的包含6個基因的極端表達基因群，由SEQ IDNO1-6所示的核苷酸序列組成。本極端表達基因群中的基因均參與了造成不同生物學效應的顯著功能(Gene Ontology，GO)和信號轉導通路(pathway)，同時在信號轉導網絡(Signal-Net)和基因的調控網絡(GeneRelNet)中處於關鍵結點或重要地位，且有望基於其中單個、多個或全部基因建立基因晶片、分子雜交和RT-PCR的方法檢測樣本中這些基因的mRNA表達水平，根據這些基因的表達水平診斷愛滋病及篩選抗愛滋細胞藥物。
文檔編號C12Q1/68GK101979567SQ20101029319
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月27日 優先權日2010年9月27日
發明者張華堂, 徐雯雯, 郭彥, 陳玲, 韓妙君 申請人:中國科學院昆明動物研究所