擴增胰島β細胞和使其再分化的方法

2023-09-16 17:15:45

專利名稱：擴增胰島β細胞和使其再分化的方法
擴增胰島β細胞和使其再分化的方法發明領域和背景I型糖尿病是由於胰島產胰島素β細胞的自身免疫破壞所導致的。因為難以調整最佳胰島素劑量，胰島素施用不能阻止該疾病的長期併發症。用經調控的產胰島素細胞替換損傷的細胞被認為是I型糖尿病的終極療法。胰腺移植已獲成功，但受供體缺乏的嚴重限制。隨著新型胰島分離和免疫抑制方法的發展，已報導了每個接受者利用來自2-3個供體的膜島的顯著成功(Shapiro AM, Lakey JR, Ryan EA 等人.New Engl J Med 2000 ；343:230-238)。該進展強調了開發人類胰腺供體的替代形式的迫切需要，即用於移植的培養的人類β細胞的豐富來源。終末分化的、有絲分裂期後的胰島細胞難以在組織培養中擴增(expand)。將成體的和胎兒的人類胰島細胞培養於含IlmM葡萄糖並補充有10% FBS和肝細胞生長因子的RPMI 1640培養基中的HTB-9基質上，其表現以最多10-15次群體倍增增殖，之後經歷衰老。利用逆轉錄病毒將人類端粒酶(hTERT)的催化亞基導入到細胞中，其表達不能延長複製時間跨度(Halvorsen TL, Beattie GM, Lopez AD, Hayek A, Levine F.J Endocrinol 2000 ；166 =103-109)。由於大量的細胞死亡，該方法導致胰島細胞團塊的3-4次擴增。通過延長的培養進行β細胞擴增的過程伴有細胞的去分化。在許多情況下，細胞的去分化伴有表型的重大改變，其中其形態從含大量細胞-細胞連接和細胞角蛋白纖維網絡的上皮細胞的形態變為具有成纖維細胞或間充質外觀的細胞的形態。該去分化的過程稱作上皮細胞-間充質細胞轉變(EMT)，並認為其部分地受鋅指轉錄因子Snail的誘導介導。Slug，是Snail家族成員，已參與皮膚創傷的再上皮化和損傷後受損的骨骼肌的再生。在胰腺幹細胞的領域中，Gershengorn等人[Science，2004，306，2261-2264]，提出了培養的原代β細胞能夠EMT和 去分化為成纖維細胞樣(fibroblastoid-like)的細胞類型。Gershengorn提出了該過程可被逆轉，且這些成纖維細胞樣細胞隨後可通過所謂的間充質細胞-上皮細胞轉變再分化為胰腺內分泌細胞。該文章發表後，Gershongorn收回了該說法並表明，經歷分化的是存在於胰島中的間充質幹細胞而非去分化的β細胞[Davani等人，Stem cells，卷 25，第 12 期，3215-3222 頁，2007]。有絲分裂後的β細胞的被迫擴增的替代方式是誘導具有天然的自我擴增能力的幹細胞/祖細胞分化成產胰島素細胞。胚胎幹細胞的定向分化已生成了與β細胞相比較僅產生少量胰島素的細胞，且其在移植中的潛在用途遭遇倫理上的反對、以及有關畸胎瘤的風險的擔心。還已將成體幹細胞分化為產胰島素細胞。然而，這些細胞類型在組織培養中的擴增效率和其分化為產胰島素細胞的比率需要極大地提高以允許用於移植的大量細胞數目的產生。已清楚地證明，利用激活發育事件的級聯反應的主要基因(dominant gene)可至少部分地使定型細胞重編程。本發明人的美國專利申請第20050244966號教導了通過導向內分泌胰腺發育的主要轉錄因子諸如Pdxl的表達，胎兒肝細胞重編程為β樣產胰島素細胞。誘導人類胎兒肝細胞大量地產生並貯存成熟的胰島素，其中約三分之一由正常β細胞產生，響應於生理葡萄糖水平而釋放，並在STZ-糖尿病非肥胖型糖尿病重症聯合免疫缺陷(NOD-scid)小鼠中替代細胞功能。該修飾的細胞表達多種細胞基因。已在表皮生長因子和神經生長因子的存在下離體(ex vivo)擴增了胰島細胞。雖然這些細胞表現了高胰島素含量，但它們不響應於葡萄糖分泌胰島素(Lechner A.等人，Biochem Biophys Res Commun327:581-588,2005)。國際申請W02006/054305教導了在CMRL-1066培養基中擴增胰島細胞。已顯示大量的因子促進組織培養中的β -細胞增殖和分化二者。生長激素家族成員，包括胎盤催乳激素(PL)、生長激素(GH)和促乳素(PRL)，在新生大鼠胰島細胞中誘導複製。已觀察到肝細胞生長因子(HGF)對人類胎兒和成體胰島以及小鼠胰島的顯著的促分裂效應。在激活素A或煙醯胺存在下，已顯示HGF在培養的胎兒胰島中以及胰腺細胞系中刺激β-細胞分化。已顯示胰高血糖素樣肽I (GLP-1)和其更穩定的類似物exendin-4在胰腺細胞系中刺激β_細胞增殖和誘導胰島素基因表達。還已顯示錶皮生長因子(EGF)家族成員，包括EGF、TGFa和β細胞素(betacellulin)，刺激β-細胞增殖和分化。β細胞素對於包括胰島β (β)細胞的多種細胞類型是有效的有絲分裂原。顯示其可在阿脲和STZ處理的小鼠中增加胰島素新生，並在90%胰腺切除術的大鼠中加速胰島素再生[Li L，等人，Endocrinology 2001；142:5379-5385]。Rukstalis 等人[Endocri nology 147 (6) 2997-3006]教導了轉錄因子 Snail 在永生化的胰腺內分泌細胞系中調節激素表達。而且，公開了，在那些細胞系中利用siRNA使Snail下調提聞了膜島素基因表達。美國專利申請第20060292127號教導了通過將細胞與調控轉錄因子Snail/slug/slit家族的劑相接觸使β細胞去分化而不是再分化。國際申請W02006/054305教導了在含β細胞素和/或ngn_3的培養基中的擴增的β細胞的再分化。發明概沭根據本發明的一些實施方案的方面，提供了離體提高成體胰島β細胞中胰島素含量的方法，該方法包括將成體胰島β細胞暴露於含煙醯胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培養基，該培養基不含血清，從而提高成體胰島β細胞中的胰島素含量。離體提高表達SLUG的祖細胞中胰島素含量的方法，所述方法包括使所述祖細胞中的所述SLUG的量或活性下調，從而提高所述祖細胞中的胰島素含量。根據本發明的一些實施方案的方面，提供了細胞的分離的群體(isolatedpopulation of cells),其包含下調SLUG的siRNA,其中所述細胞分泌胰島素。根據本發明的一些實施方案的方面，提供了根據本發明的方法生成的細胞的分離的群體。根據本發明的一些實施方案的方面，提供了在受治療者中治療糖尿病的方法，所述方法包括將治療有效量的本發明的成體胰島β細胞的群體移植到受治療者中，從而治療糖尿病。根據本發明的一些實施方案的方面，提供了本發明的成體胰島β細胞的群體在受治療者中治療糖尿病的應用。
包含本發明的成體胰島β細胞的群體作為活性成分的藥物組合物。根據本發明的一些實施方案，方法包括:(a)將成體胰島β細胞暴露於含煙醯胺、exendin-4、激動素A的培養基，其中葡萄糖以IO-1OOmM的濃度存在；和隨後(b)將成體胰島β細胞暴露於含煙醯胺和exendin-4的另外的培養基，其中葡萄糖以0.5-10mM的濃度存在。根據本發明的一些實施方案，煙醯胺以1-1OOmM的濃度存在。根據本發明的一些實施方案，exendin-4以1-1OOnM的濃度存在。根據本發明的一些實施方案，激動素A以1-1OOnM的濃度存在。根據本發明的一些實施方案，另外的培養基不含激動素A。根據本發明的一些實施方案，培養基不含β細胞素。根據本發明的一些實施方案，另外的培養基不含β細胞素。
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根據本發明的一些實施方案，成體胰島β細胞包括去分化的成體胰島β細胞。根據本發明的一些實施方案，去分化的成體胰島β細胞包括從β細胞生成的誘導性多能幹細胞。根據本發明的一些實施方案，去分化的成體胰島β細胞通過培養成體胰島β細胞至少10代而生成。根據本發明的一些實施方案，培養在CMRL培養基中進行。根據本發明的一些實施方案，方法還包括在步驟(a)之前擴增胰島β細胞。根據本發明的一些實施方案，步驟(a)進行6天。根據本發明的一些實施方案，步驟(b)進行2天。根據本發明的一些實施方案，方法還包括在步驟(b)之後分離成體胰島β細胞。
根據本發明的一些實施方案，分離利用鋅結合染料來進行。根據本發明的一些實施方案,鋅結合染料包括新點綠(Newport green)。根據本發明的一些實施方案，分離利用抗NCAM抗體來進行。根據本發明的一些實施方案，用胰酶消化成體胰島β細胞。根據本發明的一些實施方案，方法還包括將成體胰島β細胞與下調SLUG的量或活性的劑接觸。根據本發明的一些實施方案，祖細胞選自由去分化的成體胰島β細胞、間充質幹細胞和從β細胞去分化的誘導性多能幹細胞組成的組。根據本發明的一些實施方案，利用針對SLUG的多核苷酸劑進行下調。根據本發明的一些實施方案，利用抗體來進行下調。根據本發明的一些實施方案，多核苷酸包括siRNA劑或shRNA劑。根據本發明的一些實施方案，接觸在暴露之後進行。根據本發明的一些實施方案，去分化的成體胰島β細胞通過培養成體胰島β細胞至少10代而生成。根據本發明的一些實施方案，培養在CMRL培養基中進行。根據本發明的一些實施方案，分離的成體胰島β細胞的群體經遺傳修飾以表達藥劑。
除非另外指定，否則本文所用的所有技術和/或科學術語具有與本發明所屬領域中的普通技術人員所通常理解的相同含義。雖然與本文所描述的方法和材料相似的或等效的那些方法和材料可用於本發明的實施方案的實踐或試驗中，以下描述了示例性的方法和/或材料。如有衝突，以本發明的說明書，包括定義為準。此外，材料、方法和例子僅為示例性的而並不意在必須限制。附圖簡沭本文通過僅舉例的方式參照附圖和圖像描述了本發明的一些實施方案。現詳細地具體參照了附圖，應強調的是以舉例的方式顯示了細節，並用於示例性地討論本發明的實施方案的目的。在這一方面，關於附圖所採用的描述使本領域技術人員清楚可以如何實踐本發明的實施方案。在附圖中:

圖1A-B示出了可在無外源的(xeno-free)和無血清的條件下擴增β細胞來源的細胞。A:在無外源的(XF)或含血清的CMRL 1066培養基(CMRL)中擴增的胰島細胞在第2代的顯微照片。B:對於增殖標誌物Ki67的GFP-標記的β細胞來源的(B⑶)細胞的免疫螢光分析。圖2示出了不同的再分化條件對胰島素mRNA表達的影響。從兩個供體擴增並在不同的再分化條件下孵育共8天，第7代的細胞中的胰島素轉錄子的qPCR分析。完全再分化混合物(RC)包括:CMRL 1066培養基、25mM葡萄糖、抗生素、胰島素、鐵傳遞蛋白、硒(ITS)、N2補充物、B27補充物、煙醯胺(NA)、激活素A (ActA)、β細胞素(BTC)、Exendin 4 (EX) 01.步驟1:第1-6天無BTC的RC步驟2:第7-8天無BTC的RC，5.6mM葡萄糖

2.步驟1:第1-6天無BTC的RC步驟2:第7-8天無BTC和ActA的RC，5.6mM葡萄糖數值為平均值土SD，相對於人類RPLPO標準化。圖3示出了降低的葡萄糖水平誘導胰島素表達，同時減少了其他激素的轉錄子。在RC中再分化8天，第9代的、或在RC中再分化7天、和在帶有5.6mM葡萄糖的RC中在第8天時的細胞中的胰島激素轉錄子的qPCR分析。數值為平均值土SD，相對於人類RPLPO標準化。INS =胰島素，SST =生長激素抑制素，GCG =胰高血糖素，PPY =胰多肽。圖4是顯現活胰島細胞中的分化的顯微照片。用在胰島素啟動子控制下表達螢光標誌物DsRed2的慢病毒感染胰島細胞培養物。通過轉移到RC而在第6代時誘導分化。如通過DsRed2表達所顯現的(右)，這導致了細胞群集和胰島素啟動子活性的激活。左側是相同視野的相差圖像。UTR:未處理的。圖5A-B是示出分選DsRed2表達之後再分化的效應的圖。將第6_7代的擴增的細胞在RC中孵育8-11天，然後通過FACS分選。A:qPCR分析顯示了再分化後胰島素表達的上調。數值為平均值土SD，相對於人類RPLPO(大核糖體蛋白)標準化。B:分選的細胞每百萬個細胞含375ng C-肽，為人類胰島中的水平的8%。UTR:未處理的。圖6A-B示出了利用新點綠(NG)對再分化的細胞的分選。A:使第5代的胰島細胞在RC中分化8天。利用NG對含胰島素的細胞染色，並通過FACS分選。分選的點圖顯示了在P2門中分選的突光細胞的不同群體。B:分選的細胞、未分選的分化的細胞和未處理的(UTR)細胞中胰島素轉錄子的qPCR分析。數值為平均值土SD，相對於人類RPLPO標準化。圖7A-F示出了胰島細胞分化的條件的開發，且表明分化主要代表BCD-細胞再分化。A:在SFM中孵育指定的天數的在第6代的擴增的胰島細胞中的β細胞基因表達的qPCR分析。數值為相對於未處理的細胞(第O天)的平均值土SD(n = 3-4個供體)，並相對於人類RPLPO標準化。*p < 0.05 ;**p 400個細胞)。顯示了代表性的顯微照片。用DAPI將DNA染為藍色。線條=10 μ m。圖8A-E示出了通過可溶性因子誘導的B⑶細胞的再分化。A、B:用RC處理的第5代的胰島細胞中的β細胞基因的誘導的動力學。A:qPCR分析。數值為相對於未處理的細胞(第O天)的平均值土 SE (η = 3-4個供體)並相對於人類RPLPO或GAPDH標準化。*p < 0.05 ;**p 500個細胞。*p < 0.05，相對於未處理的細胞(第O天)。顯示了代表性的顯微照片。線條=25 μ m。C、D:用RC處理8天的第5-7代的胰島細胞中的β細胞基因表達的分析。C:qPCR分析。數值為相對於未處理的細胞(第O天)的平均值 土 SE (對數尺度)(η = 3-4個供體)，並相對於人類RPLPO標準化。*ρ < 0.05 ;#ρ < 0.005 200個細胞。E:在來自4個供體的未培養的胰島細胞、來自4個供體的第5代的擴增的胰島細胞(UTR)、和用RC處理的來自3個供體的第5代的擴增的胰島細胞的cDNA微陣列分析中檢測到的基因表達模式的無監督聚類(unsupervised clustering)。圖9A-D示出了分選的再分化的B⑶細胞中的胰島素產生和分泌。用RIP_DsRed2病毒感染擴增的胰島細胞(第6-7代)並用RC處理8天。分選DsRed2+細胞並分析。Α:β細胞轉錄子的qPCR分析。數值為相對於人類胰島的平均值土 SE (η = 3個供體)，並相對於人類RPLPO標準化。B:新鮮人類胰島和DsRed2分選的RC處理的胰島細胞的人類C-肽含量。數值為平均值土 SE (η = 3個供體)。注意，絕大多數所貯存的胰島素是經加工的(僅9%胰島素原(proinsulin))。C:在16.7mM葡萄糖和IBMX存在下來自人類胰島和RC處理的擴增的胰島細胞的葡萄糖誘導的胰島素分泌。數值為人類C-肽的平均值土SD，相對於OmM葡萄糖和IBMX (η = 3個供體)。D:電子顯微鏡分析顯示在用RC處理8天的第6代的細胞中典型的胰島素分泌囊泡的存在，與在分離的人類胰島中的β細胞中所觀察到的那些相當。線條=0.5ym0圖10Α-Η示出了 B⑶細胞再分化包括間充質細胞-上皮細胞轉變(MET)。A、B:胰島細胞去分化期間SLUG表達的誘導。A:所示的傳代的擴增的胰島細胞的qPCR分析。數值為相對於未培養的胰島的平均值土SE (η = 4個供體)並相對於人類RPLPO標準化。*p<0.05。B:從未培養的胰島和所示的傳代數目的擴增的胰島細胞中提取的蛋白的免疫印跡分析。HSC70，熱休克同源物70。C:在胰島細胞再分化期間SLUG表達的下調。在用RC處理8天後第6-7代的擴增的胰島細胞的qPCR分析。數值為相對於未處理的細胞的平均值土 SE (η = 4個供體)，並相對於人類RPLPO標準化。*ρ < 0.05。D:在用RC處理8天期間第5代的擴增的胰島細胞中的NCAD和ECAD轉錄子的變化的動力學的qPCR分析。數值為相對於未處理的細胞的平均值土 SE (關於ECAD的對數尺度)(η = 4個供體)，並相對於人類RPLPO或GAPDH標準化。*ρ < 0.05 ;#ρ 400個細胞)，和波形蛋白和C-肽的互斥表達。箭頭指向可能已丟失波形蛋白表達但還未激活胰島素表達的細胞。線條=IOym0 F:在用RC處理8天後第5代的擴增的胰島細胞中C-肽和BrdU的共染色。百分比指示在再分化處理的第2-8天摻入BrdU之後，總細胞中BrdU陽性細胞的比例。數據為平均值土SD，基於從3個供體的每個中計數500個細胞。線條=20 μ m。G:用表達兩種SLUG shRNA中的一種或亂序(SCR) shRNA的慢病毒感染的第5代的擴增的胰島細胞的免疫印跡分析。UTR，未處理的細胞。H:用表達兩種SLUG shRNA中的一種或亂序shRNA的慢病毒感染並用RC處理4天的第5代的擴增的胰島細胞中的胰島素轉錄子的qPCR分析。數值為相對於未處理的細胞的平均值土SE (η =
3-6個供體)，並相對於人類RPLPO或GAPDH標準化。p-值為相對於SCR的。UI，用RC處理的未感染的細胞。圖1lA-H分別示出了 B⑶細胞再分化包括胰腺和胰島祖細胞轉錄因子S0X9和NGN3的表達。A:擴增的胰島細胞(第6代)的RC處理導致激素表達細胞而非胰島素表達細胞的生成。用RC處理細胞8天並用對於指定的激素的抗體染色(通過對C-肽的染色鑑定產胰島素細胞)。數值為平均值土 SE (η = 4個供體)，基於從每個供體計數> 500個細胞。綠色的數值指示了在與來自6個供體的譜系示蹤細胞的平行實驗中評分的共1736個激素陽性的eGFP+細胞中對於每種激素呈陽性的細胞的百分比。B-D:再分化期間的S0X9激活。用RC處理第5代的胰島細胞8天。B:S0X9的上調的動力學的qPCR分析。數值為相對於未處理的細胞(第O天)的平均值土 SE (η = 4個供體)，並相對於人類RPLPO或GAPDH標準化。*ρ 500個細胞。( 0.01, ( 0.001,相對於未處理的細胞(第O天)。D:左側，免疫螢光分析檢測單獨的波形蛋白或S0X9染色的細胞，以及雙陽性的細胞。右側，C-肽和S0X9染色是互斥的。線條=IOym0 E:利用表達兩種SLUG shRNA中的一種或亂序的sh RNA的慢病毒感染並用RC處理4天，第5代的擴增的胰島細胞中S0X9轉錄子的qPCR分析。數值為相對於未處理的細胞的平均值土SE (η =4-6個供體)，並相對於人類RPLPO或GAPDH標準化。UI，RC處理的未感染的細胞。F:再分化期間激活了 NGN3。人類胎兒胰腺細胞(左圖)和利用RC處理的胰島細胞處理8天後第5代的擴增的胰島細胞(右圖)中NGN3mRNA表達的原位雜交分析。線條=25 μ m。G-H:胰島細胞去分化期間S0X9的瞬時激活。G:所示的傳代的擴增的胰島細胞的qPCR分析。數值為相對於未培養的胰島的平均值土 SE (η = 3個供體)並相對於人類RPLPO標準化。*p
<0.05。H:從未培養的胰島和所示的傳代數目的擴增的胰島細胞中提取的蛋白的免疫印跡分析。圖12A-B示出了 β細胞中RIP-CreER轉基因表達的特異性。利用RIP-CreER病毒感染人類胰島細胞並在感染後2-3天對Cre蛋白和4種胰島激素共染色(胰島素+細胞通過對C-肽的染色而鑑定)。數值為平均值土 SD (η = 3個供體；基於從每個供體計數400個細胞)。圖13Α-Β示出了 RC處理期間胰島祖細胞基因的上調的動力學。用RC處理所示的天數的第5代的擴增的胰島細胞的qPCR分析。數值為相對於未處理的細胞(第O天)的平均值土SE (η = 4個供體)，並相對於人類GAPDH標準化，*p < 0.05，#p ( 0.01，***p ^ 0.001。圖14示出了 RC處理後INSMl的上調。在用RC處理8天後第5代的擴增的胰島細胞中的INSMl轉錄子的qPCR分析。數值為相對於未處理的細胞的平均值土SE (η = 4個供體)，並相對於人類RPLPO標準化。發明具體實施方式
的描述本發明，在其一些實施方案中，涉及在成體胰島β細胞中增加胰島素含量的方法。在詳細解釋本發明的至少一個實施方案之前，應理解，本發明的應用不必限於以下描述中所列出的或通過實施例所示例的細節。本發明能夠以其他實施方案或能夠以多種方式實踐或進行。因此，根據本發明的一方面，提供了離體提高成體胰島β細胞中胰島素含量的方法，所述方法包括將成體胰島β細胞暴露於含煙醯胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培養基，所述培養基不含血清，從而提高成體胰島β細胞中的胰島素含量。如本文所用的短語「離體(ex-vivo) 」指從活的生物體中移出並在生物體外(例如，在試管中)培養的細胞。如本文所用的，短語「成體胰島β細胞」指出生後的(例如，非胚胎的)胰島內分泌細胞，其能夠響應於增高的葡萄糖濃度分泌胰島素並表達典型的β細胞標誌物。β細胞標誌物的例子包括,但不限於,胰島素和Pdx。本發明的該方面的分離的成體胰島β細胞可以是同種性質的或異種性質的(homogeneous or heterogeneous nature)。因此，例如，本發明的該方面的成體胰島β細胞可被包括在分離的胰島中。胰島細胞可包括以下:1)產生胰島素的β細胞；2)產生胰高血糖素的α細胞；3)產生生長激素抑制素的S細胞(或D細胞)；和/或產生胰多肽的F細胞。這些細胞中的多肽激素(胰島素、胰高血糖素、生長激素抑制素和胰多肽)以分泌顆粒的形式貯存於分泌囊泡中。分離胰島的方法是本領域中熟知的。 例如，可利用膠原酶和ficoll梯度從胰腺組織中分離胰島。優選地將本發明的成體胰島β細胞分散成單細胞懸液-例如，通過添加胰酶或通過研磨。可將成體胰島β細胞進一步分離，使其基本上不含在其體內環境中存在的其他物質(例如，其他細胞、蛋白、核酸等)，例如，通過FAC分選來分離。成體胰島β細胞可獲自任何自體的或非自體的(即，同種異體的或異種的)哺乳動物供體。例如，細胞可從人類屍體中分離。成體胰島β細胞的去分化可通過擴增(即，培養)延長的傳代數目而進行，-例如，在CMRL培養基中。如本文所用的，術語「擴增(expanding) 」指通過細胞分裂的過程而非簡單地通過過度生長而擴大,增加本發明的成體胰島β細胞的數目和總量。根據一個實施方案，細胞在含約IO-1OOmM葡萄糖，更優選地為10_50mM，更優選地為10-25mM，比如例如25mM濃度的葡萄糖的Mesencult XF培養基中擴增。優選地擴增細胞至少6代、7代、8代、9代、10代、11代、12代、13代、14代、15代、或至少16代。根據一個具體的實施方案，擴增在粘附條件下進行，所述粘附條件包括在選自由層粘連蛋白、纖連蛋白、基質月父和Mesencult XF粘附基質組成的組的粘附培養基上鮮育。

根據另一個實施方案，成體胰島β細胞的去分化可通過利用已知生成誘導性多能幹細胞(iPS)細胞的基因轉染細胞來實現。已將Oct-3/4和Sox基因家族的某些成員(Soxl、Sox2、Sox3和Soxl5)鑑定為參與誘導過程的關鍵轉錄調控子，其缺失使誘導不可能。然而，已鑑定包括Klf家族的某些成員0(1€1、1(1€2、1(1€4和1(1€5)、1^(3家族的某些成員(C-myc、L-myc和N_myc)、Nanog和LIN28的另外的基因提高誘導效率。根據一個實施方案，通過以下使細胞再分化:(a)在含煙醯胺、exendin-4、激活素A和10_50mM葡萄糖的培養基中孵育成體胰島β細胞，該培養基不含血清；和隨後(b)在含煙醯胺、exendin-4和0.5-10mM葡萄糖的另外的培養基中孵育成體胰島β細胞。煙醯胺的示例性的濃度範圍包括Ι-lOOmM，更優選地為l_50mM、更優選地為l-20mM,比如例如10mM。exendin 4的示例性的濃度範圍包括1-lOOnM，更優選地為1_50ηΜ，更優選地為1-20ηΜ,比如例如8nM。激活素A的示例性的濃度範圍包括1-lOOnM，更優選地為1_50ηΜ，更優選地為1-20ηΜ,比如例如8nM。對於步驟A，葡萄糖的示例性的濃度範圍包括lO-lOOmM，更優選地為10_50mM，更優選地為10-25mM，比如例如25mM。對於步驟B，葡萄糖的示例性的濃度範圍包括0.5-10mM,更優選地為l_10mM，更優選地為2.5-7.5mM,比如例如5.6mM。利用本文描述的方法獲得的細胞能夠以葡萄糖響應方式分泌胰島素並典型地表達β細胞特異性基因(例如rox-1)。根據一個特定的實施方案，根據本文描述的方法生成的分離的群體的細胞的至少10%是由β細胞再分化的細胞。根據一個特定的實施方案，根據本文描述的方法生成的分離的群體的細胞的至少20%是由β細胞再分化的細胞。根據一個特定的實施方案，根據本文描述的方法生成的分離的群體的細胞的至少30%是由β細胞再分化的細胞。根據一個特定的實施方案，根據本文描述的方法生成的分離的群體的細胞的至少40%是由β細胞再分化的細胞。根據又一個另外的實施方案，根據本文描述的方法生成的分離的群體的細胞的至少20%分泌胰島素。根據又一個另外的實施方案，根據本文描述的方法生成的分離的群體的細胞的至少30%分泌胰島素。根據又一個另外的實施方案，根據本文描述的方法生成的分離的群體的細胞的至少40%分泌胰島素。根據又一個另外的實施方案，根據本文描述的方法生成的分離的群體的細胞的至少50%分泌胰島素。優選地，本文所描述的群體中的細胞中的大多數表達Η)Χ1、ΝΚΧ2.2、NKX6.1、IAPP和PCI/3和β細胞功能必需的其他蛋白。優選地，如通過RT-PCR所測量的，與非再分化的β細胞相比較，細胞表達增加的量的β細胞轉錄因子(例 如，HBLX9、NEUROD, ΝΚΧ2.2和ΝΚΧ6.1)。可以在本文所描述的分離的群體中被上調的其他基因包括KIR6.2、SURl和GCK。本發明人已顯示，以上所描述的再分化方案導致了稱作SLUG(snail同源物2，編碼具有Swiss prot編號043623的蛋白)的基因-GenBankTM登錄號BC014890的下調。將理解的是，本發明涵蓋用於該再分化方案(或任何另外的再分化方案)的下調SLUG的另外的方式(例如，通過利用特異性地針對該蛋白的劑，比如通過利用抗體或SiRNA劑)。以下是能夠下調SLUG的表達水平和/或活性的劑的列表。能夠下調SLUG的劑的一個例子是能夠特異性地結合SLUG的抗體或抗體片段。優選地，該抗體特異性地結合SLUG的至少一個表位。如本文所用的，術語「表位」指抗原上與抗體的互補位結合的任何抗原決定簇。如本發明所用的術語「抗體」包括完整的分子以及能夠與巨噬細胞結合的其功能性片段，比如Fab、F(ab' )2和Fv。這些功能性抗體片段如下所定義:(I)Fab，含有抗體分子的單價抗原結合片段的片段，可通過用木瓜蛋白酶消化整個抗體生成完整的輕鏈和一個重鏈的部分而產生；(2)Fab'，可通過用胃蛋白酶處理整個抗體，然後還原，產生完整的輕鏈和重鏈的部分而獲得的抗體分子的片段；每個抗體分子獲得兩個Fab'片段；(3)(Fab' )2，可通過用胃蛋白酶處理整個抗體而不進行隨後的還原而獲得的抗體的片段；F(ab' )2是通過兩個二硫鍵保持在一起的兩個Fab'片段的二聚體；(4)Fv，定義為含表達為兩個鏈的輕鏈的可變區和重鏈的可變區的遺傳工程化的片段；和(5)單鏈抗體(「SCA」)，含輕鏈的可變區和重鏈的可變區的遺傳工程化的分子，通過適宜的多肽連接物連接作為遺傳融合的單鏈分子。
SLUG的下調還可通過RNA沉默來實現。如本文所用的，短語「 RNA沉默」指由RNA分子所介導的一組調控機制[例如，RNA幹擾(RNAi)、轉錄基因沉默(TGS)、轉錄後基因沉默(PTGS)、壓制、共抑制和翻譯阻抑]，導致對應的蛋白編碼基因的表達的抑制或「沉默」。已在包括植物、動物和真菌的許多類型的生物體中觀察到RNA沉默。如本文所用的，術語「RNA沉默劑」指能夠特異性地抑制或「沉默」靶基因的表達的RNA。在某些實施方案中，RNA沉默劑能夠通過轉錄後沉默機制阻止mRNA分子的完全加工(例如，完整的翻譯和/或表達)。RNA沉默劑包括非編碼RNA分子，例如包括成對的鏈的RNA雙鏈體，以及前體RNA，可由其生成小的非編碼RNA。示例性的RNA沉默劑包括dsRNA諸如siRNA、miRNA和shRNA。在一個實施方案中，RNA沉默劑能夠誘導RNA幹擾。在另一個實施方案中，RNA沉默劑能夠介導翻譯阻抑。根據本發明的一個實施方案，RNA沉默劑對於靶標RNA(例如，SLUG)是特異性的，且並不交叉抑制或沉默與靶基因表現99%或更小總體同源性的基因或剪接變體，所述更少總體同源性例如，與靶基因小於 98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81% 的總體同源性。RNA幹擾指在動物中由短幹擾RNA(SiRNA)介導的序列特異性轉錄後基因沉默的過程。在植物中對應的過程通常稱作轉錄後基因沉默或RNA沉默，且在真菌中還被稱作壓制。轉錄後基因沉默的過程被認為是用於阻止外源基因表達的進化保守的細胞防衛機制，並通常為多種植物群(flora)和動物門(phyla)所共有。這種對於外源基因表達的阻止可經由特異性地破壞同源的單鏈RNA或病毒基因組RNA的細胞反應響應於雙鏈RNA(dsRNA)的產生而演變，所述雙鏈RNA來源於病毒感染或來自隨機整合進入到宿主基因組中的轉座子元件。細胞中的長dsRNA的存在刺激了稱作dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer參與將dsRNA加工成稱作短幹 擾RNA(siRNA)的dsRNA的短片段。來源於dicer活性的短幹擾RNA通常長度約21至約23個核苷酸，且包括約19個鹼基對雙鏈體。RNAi響應還以核酸內切酶複合物為特徵，其通常稱作RNA誘導的沉默複合物(RISC)，其介導具有與siRNA雙鏈體的反義鏈互補的序列的單鏈RNA的切割。靶RNA的切割發生在與siRNA雙鏈體的反義鏈互補的區域中部。因此,本發明的一些實施方案涵蓋dsRNA用於下調從mRNA的蛋白表達的用途。根據一個實施方案，dsRNA大於30bp。長dsRNA (即，dsRNA大於30bp)的用途非常有限，由於認為這些雙鏈RNA的較長的區域將導致幹擾素的誘導和PKR應答。然而，使用長dsRNA可提供大量的優點，原因在於細胞可選擇最佳沉默序列，減少了試驗大量siRNA的必要；長dsRNA將允許沉默文庫具有比siRNA必需的複雜性小的複雜性；並且，可能最重要的是，當用作治療劑時，長dsRNA能夠阻止病毒逃逸突變。多項研究證明長dsRNA可用於沉默基因表達，而不會誘導應激反應或導致顯著的偏離IE標效應_參見例如[Strat等人，Nucleic Acids Research, 2006,卷34,第13號 3803-3810 ；Bhargava A 等人.Brain Res.Protoc.2004 ；13:115-125 ；Diallo Μ.，等人，Oligonucleotides.2003 ； 13:381-392 ；Paddison P.J.,等人，Proc.Natl Acad.Sc1.USA.2002 ；99:1443-1448 ；Tran N.，等人，FEBS Lett.2004 ；573:127-134]。具體地，本發明根據其一些實施方案涵蓋導入長dsRNA (超過30個鹼基轉錄子)以用於其中不激活幹擾素途徑的細胞(例如，胚細胞和卵母細胞)中的基因沉默，參見例如 Billy 等人,PNAS 2001,卷 98,第 14428-14433 頁.和 Diallo 等人，Oligonucleotides,2003 年 10 月 I H,13(5):381-392.do1:10.1089/154545703322617069。本發明根據其一些實施方案還涵蓋導入特別設計以不誘導幹擾素和PKR途徑的長dsRNA 以用於下調基因表達。例如，Shinagwa和 Ishii [Genes & Dev.17 (11): 1340-1345,2003]已開發了稱作pDECAP的載體，以從RNA聚合酶II (Pol II)啟動子表達長的雙鏈RNA。由於來自pDECAP的轉錄子缺少協助ds-RNA輸出到細胞質的5』 -帽結構和3』 -聚腺苷酸尾巴二者，來自pDECAP的長ds-RNA不會誘導幹擾素應答。避開哺乳動物系統中的幹擾素和PKR途徑的另一種方法是通過經由轉染或內源性表達而導入小抑制性RNA(siRNA)。術語「 siRNA」指誘導 RNA幹擾(RNAi)途徑的小抑制性RNA雙鏈體(通常在18_30鹼基對之間)。通常，siRNA是化學合成的21mer，具有中央的19bp雙鏈體區域和對稱的末端2-鹼基3』 -懸突，雖然最近已描述，化學合成的25-30鹼基長度的RNA雙鏈體與在相同的位置的21mer相比較可具有多達100倍增高的效力。理論認為在觸發RNAi時利用較長的RNA獲得的所觀察到的增高的效力起因於向Dicer提供了底物(27mer)而非產物(2Imer),且這提高了 siRNA雙鏈體進入到RISC的速率或效率。已發現3』 -懸突的位置影響著siRNA的效力，且在反義鏈上具有3』 -懸突的不對稱的雙鏈體一般比在有義鏈上具有3』-懸突的那些更有效(Rose等人，2005)。這可歸因於不對稱的鏈載入到RISC中，因為當靶向反義轉錄子時觀察到相反的效率模式。可連接雙鏈幹擾RNA (例如，siRNA)的鏈以形成髮夾或莖-環結構(例如，shRNA)。因此，如所提到的，本發明的一些實施方案的RNA沉默劑還可以是短髮夾RNA(shRNA)。如本文所用的，術語「 shRNA」指具有莖-環結構的RNA劑，包括具有互補序列的第一區域和第二區域，互補的程度和區域的方向足以使區域之間發生鹼基配對，第一區域和第二區域通過環區域連接，環由環區域中的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺少鹼基配對而引起。環中的核苷酸的數目是3至23、或5至15、或7至13、或4至9、或9至11之間並包括端點的數目。環中的某些核苷酸可參與與環中的另外的核苷酸的鹼基配對相互作用。可用於形成環的寡核苷酸序列的例子包括5' -UUCAAGAGA-3' (Brummelkamp,T.R.等人.(2002) Science 296:550)和 5' -UUUGUGUAG-3' (Castanotto,D.等人.(2002) RNA 8:1454)。本領域技術人員將認識到，所得的單鏈寡核苷酸形成包括能夠與RNAi機器(RNAimachinery)相互作用的雙鏈區域的莖-環或髮夾結構。根據另一個實施方案，RNA沉默劑可以是miRNA。miRNA是由編碼不同大小的初級轉錄子的基因產生的小RNA。其已在動物和植物二者中被鑑定。初級轉錄子(稱作「初級-miRNA」)經過多種核水解(nucleolytic)步驟被加工成較短的前體miRNA,或「前-miRNA」。前-miRNA以摺疊的形式存在，從而最終的(成熟)miRNA以雙鏈體存在，該兩個鏈被稱作miRNA (將最終與靶標鹼基配對的鏈)。前-miRNA是將miRNA雙鏈體從前體移除的dicer形式的底物，之後，與siRNA類似，雙鏈體可被捕獲到RISC複合物中。已證明miRNA可轉基因地表達且通過前體形式而非整個初級形式的表達而生效。(Parizotto等人.(2004)Genes & Development 18:2237-2242 和 Guo 等人.(2005)Plant Cell 17:1376-1386)。
不同於siRNA, miRNA僅以部分互補性結合轉錄子序列(Zeng等人,2002, Molec.Cell 9 =1327-1333)並抑制翻譯而不影響穩態的RNA水平(Lee等人，1993，Cell 75:843-854 ;Wightman 等人，1993，Cell 75:855-862)。miRNA 和 siRNA 二者被 Dicer 加工並與RNA誘導的沉默複合物的組分締合(Hutvagner等人,2001, Science 293:834-838 ；Grishok等人，2001, Cell 106:23-34 ；Ketting 等人，2001, Genes Dev.15:2654-2659 !Williams等人，2002，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 99:6889-6894 ;Hammond 等人，2001，Science 293:1146-1150 ；Mourlatos 等人,2002, Genes Dev.16:720-728)。最近的報告(Hutvagner 等人，2002, Sciencexpress 297:2056-2060)假設，通過miRNA途徑還是通過siRNA途徑進行基因調控是僅由與靶轉錄子的互補性的程度來決定的。據推測，與mRNA靶標僅部分相同的siRNA將與miRNA相似地在翻譯抑制而非觸發RNA降解中起作用。適用於本發明的一些實施方案的RNA沉默劑的合成可按如下來進行。首先，在SLUG mRNA序列的AUG起始密碼子的下遊掃描AA 二核苷酸序列。將每個AA和3』鄰近的19個核苷酸的存在記錄為可能的siRNA靶位點。優選地，siRNA靶位點選自開放讀碼框，因為非翻譯區(UTR)中調控蛋白結合位點較為豐富。UTR結合蛋白和/或翻譯起始複合物可幹擾siRNA核酸內切酶複合物的結合[Tuschl ChemBiochem.2 =239-245]。然而將理解的是，針對非翻譯區的siRNA也可以是有效的，如對GATOH所證明的，其中針對5』UTR的siRNA介導了細胞GAPDH mRNA約90%的下降並完全消除了蛋白水平(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。其次，利用任何序列比對軟體，諸如從NCBI伺服器可獲得的BLAST軟體(www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/),將可能的祀位點與適當的基因組資料庫(例如，人類、小鼠、大鼠等)比較。過濾掉與另外的編碼序列表現出顯著同源性的推測的靶位點。選擇符合條件的靶序列作為siRNA合成的模板。優選的序列是包括低G/C含量的那些序列，因為已證明這些序列與具有高於55%的G/C含量的那些序列相比較更有效地介導基因沉默。沿著靶基因的長度，優選選擇多個靶位點用於評價。為了更好地評價所選擇的siRNA，優選地共同使用陰性對照。陰性對照siRNA優選地包括與該siRNA相同的核苷酸組成，但與基因組無顯著同源性。這樣，優選地使用該siRNA的亂序的核苷酸序列，條件是其不會表現出與任何其他基因的任何顯著的同源性。將理解的是，本發明的一些實施方案的RNA沉默劑不必限於僅含RNA的那些分子，而還包括化學修飾的核苷酸和非核苷酸。在一些實施方案中，本文提供的RNA沉默劑可在功能上與細胞滲透肽」結合。如本文所用的，「細胞滲透肽」是包括短(約12-30個殘基)胺基酸序列或功能基序的肽，其賦予與膜可滲透複合物跨細胞的質膜和/或核膜的轉運有關的不依賴能量的(即，非內吞作用)移位性質。本發明的一些實施方案的膜可滲透複合物中所用的細胞滲透肽優選地包括至少一個非功能的半胱氨酸殘基，其是游離的或被衍生以與雙鏈核糖核酸形成二硫鍵，所述雙鏈核糖核酸已經被修飾以用於這樣的鍵合。賦予這樣的性質的代表性的胺基酸基序在美國專利第6，348，185號中列出，其內容在此通過引用明確地併入。本發明的一些實施方案的細胞滲透肽優選地包括但不限於，穿膜肽(penetratin)、轉運素(transportan)、plsl、TAT (48-60)、pVEC、MTS、和 MAP。 能夠下調SLUG的另一種劑是能夠特異性地切割SLUG的mRNA轉錄子或DNA序列的脫氧核酶(DNAzyme)分子。脫氧核酶是單鏈的多核苷酸，其能夠切割單鏈的和雙鏈的靶序列二者(Breaker, R.R.和 Joyce, GChemistry and Biologyl995 ；2:655 ；Santoro, S.W.&Joyce, G.F.Proc.Natl, Acad.Sc1.USA 1997 ；943:4262)。已提出了脫氧核酶的一般模型(「10-23」模型)。「10-23」脫氧核酶具有15個脫氧核糖核苷酸的催化域，側翼為各7至9個脫氧核糖核苷酸的兩個底物識別域。該類型的脫氧核酶可在嘌呤:嘧啶連接處有效地切割其底物RNA(Santoro, S.W.& Joyce,G.F.Proc.Natl, Acad.Sc1.USA 199 ;關於脫氧核酶的綜述參見 Khachigian，LM[Curr Opin Mol Ther 4:119-21(2002)]。Joyce等人的美國專利第6，326，174號中公開了識別單鏈和雙鏈祀切割位點的合成的、工程化的脫氧核酶的構建和擴增的實例。最近觀察到相似設計的針對人類尿激酶受體的脫氧核酶抑制尿激酶受體表達，且成功地在體內抑制結腸癌細胞轉移(Itoh等人，20002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther www.asgt.0rg)。在另一個應用中，與bcr-abl癌基因互補的脫氧核酶成功地在白血病細胞中抑制癌基因表達，並在CML和ALL病例中的自體骨髓 移植中減少了復發率。SLUG的下調還可通過利用能夠與編碼SLUG的mRNA轉錄子特異性地雜交的反義多核苷酸來進行。能夠下調SLUG的另一種劑是能夠特異性地切割編碼SLUG的mRNA轉錄子的核酶分子。核酶正在被越來越多地用於通過切割編碼感興趣的蛋白的mRNA而序列特異性抑制基因表達[Welch等人，Curr Opin Biotechnol.9:486-96 (1998)]。設計核酶以切割任何特定的靶RNA的可能性使其成為基礎研究和治療應用中有價值的工具。調控細胞中SLUG基因的表達的另一種方法是經由三鏈體形成寡核苷酸(TFO)。最近的研究已顯示，可設計能夠以序列特異性的方式識別並結合雙鏈螺旋DNA中的多嘌呤/多卩密唳區域的TFO0這些識別規則由以下所概述:Maher III, L.J.,等人，Science, 1989 ；245:725-730 ；Moser, H.E.，等人，Science, 1987 ；238:645-630 ；Beal, P.A.，等人 Science,1992 ；251:1360-1363 ；Cooney, Μ.，等人，Science, 1988 ；241:456-459 ;和 Hogan，Μ.Ε.，等人，歐洲公布375408。對寡核苷酸的修飾，諸如引入嵌入劑和骨架取代，以及優化結合條件(pH和陽離子濃度)，已幫助克服了對TFO活性的固有障礙，比如電荷排斥和不穩定性，且最近已顯示可使合成的寡核苷酸祀向特定的序列(關於最近的綜述參見Seidman和Glazer,J Clin Invest 2003;112:487-94)。一般，三鏈體形成寡核苷酸具有序列對應:寡核苷酸3' —A G G T雙鏈體5' —A G C T雙鏈體3' -T C G A然而，已顯示A-AT和G-GC三鏈體具有最大的三螺旋穩定性(Reither和Jeltsch，BMC Biochem, 2002,9 ^ 12日，電子出版)。相同的作者已證明，根據A-AT和G-GC規則設計的TFO不會形成非特異性三鏈體，表明三鏈體形成確實是序列特異性的。 因此對於SLUG調控區域中的任何給定的序列，可設計三鏈體形成序列。三鏈體形成寡核苷酸長度優選地為至少15bp，更優選地為25bp，更加優選地為30bp或更多核苷酸，長達 50bp 或 IOObp。用TFO轉染細胞(例如，經由陽離子脂質體)，且與靶DNA形成三螺旋結構誘導了空間的和功能的改變，阻斷了轉錄起始和延伸，允許在內源性的DNA中導入所需的序列改變並導致基因表達的特異性下調。這種在用TFO處理的細胞中抑制基因表達的例子包括哺乳動物細胞中的游離體supFGl基因和內源性HPRT基因的敲除(Vasquez等人，Nucl AcidsRes.1999 ；27:1176_81，和 Puri，等人，J Biol Chem, 2001 ；276:28991-98)，和在前列腺病因中重要的Ets2轉錄因子(Carbone，等人，Nucl Acid Res.2003 ;31:833-43)，以及促炎性ICAM-1基因(Besch等人，J Biol Chem, 2002 ；277 =32473-79)的表達的序列和靶標特異性下調。此外，Vuyisich和Beal最近已顯不,序列特異性的TFO能夠與dsRNA結合,抑制dsRNA依賴性酶諸如RNA依賴性激酶的活性(Vuyisich和Beal，Nuc.Acids Res 2000 ；28:2369-74)。此外，根據上述原則設計的TFO可誘導能夠實現DNA修復的定向誘變，從而提供了內源性基因的表達的下調和上調二者(Seidman和Glazer，J Clin Invest 2003 ；112:487-94)。有效的TFO的設計、合成和施用的詳細描述可見於Froehler等人的美國專利申請第 2003 017068 號和第 2003 0096980 號、和 Emanuele 等人的第 2002 0128218 號和第 20020123476號、和Lawn的美國專利第5，721，138號。能夠下調SLUG的另一種劑可以是與SLUG結合和/或切割SLUG的任何分子。這樣的分子可以是SLUG拮抗劑、或SLUG抑制肽。將理解的是，SLUG的至少催化部分或結合部分的非功能類似物也可用作下調SLUG的劑。可與本發明的一 些實施方案一起使用以下調SLUG的另一種劑是阻止SLUG激活或DNA結合的分子。還可進一步修飾(例如，遺傳修飾)本發明的成體胰島β細胞的群體以表達藥齊U，諸如治療劑、端粒酶基因、減少免疫介導的排斥的劑或標誌物基因。預期治療劑諸如抗代謝物(例如，嘌呤類似物、嘧啶類似物)、酶抑制劑和肽模擬物在本發明中通常可以是有用的。可減少免疫介導的排斥的基因的例子是子宮珠蛋白基因。子宮珠蛋白是在孕期表達的蛋白，其賦予免疫耐受性並阻止炎症反應。上文描述了遺傳修飾本發明的成體胰島β細胞的方法。根據一個實施方案，再分化之後，將β細胞與胰島中存在的其他胰腺細胞分離。這可利用鋅結合染料諸如新點綠來進行(參見Parnaud G,等人.Proliferation of sortedhuman and rat beta cells.Diabetologia 2008.51:91-100)或利用抗 NCAM 抗體來進行(參見 Banerjee M, Otonkoski T.A simple two-step protocol for the purificationof human pancreatic beta cells.Diabetologia 2009.52:621-625.)。因為本發明的成體胰島細胞以葡萄糖響應方式貯存和分泌胰島素，其可用於治療與胰島素缺乏相關的疾病比如糖尿病。因此，根據本發明的另一方面，提供了在受治療者中治療糖尿病的方法，所述方法包括將治療有效量的本發明的離體擴增和再分化的成體胰島β細胞的群體移植到受治療者中，從而治療糖尿病。如本文所用的，「糖尿病」指在生物體中由因為胰島素的生物合成或產生的缺陷所致的胰島素的絕對缺乏引起(I型糖尿病)或由存在胰島素抵抗即受損的胰島素作用的胰島素的相對缺乏引起(2型糖尿病)的疾病。因此糖尿病患者具有絕對的胰島素缺乏或相對的胰島素缺乏，並除其他症狀和病徵外表現出增高的血糖濃度、尿中葡萄糖的存在和排尿過多。短語「治療」指在患有或診斷為疾病、疾患或病症的個體中抑制或阻止疾病、疾患或病症的發展和/或導致疾病、疾患或病症的減少、減輕或消退。本領域技術人員將知道可用於評估疾病、疾患或病症的發展的多種方法和測定，和類似地，可用於評估疾病、疾患或病症的減少、減輕或消退的多種方法和測定。如本文所用的，「移植」指利用任何適宜的途徑提供本發明的再分化的成體胰島β細胞。雖然設想了其他施用方法，通常，β細胞治療通過利用導管注射到肝的門靜脈中而實現。如上所述，本發明的成體胰島β細胞可來源於自體來源或來源於同種異體來源諸如人類屍體或供體。因為當非自體細胞被施用於身體時可能誘導免疫反應，已開發了一些方法來減少非自體細胞的排斥的可能性。這些方法包括抑制接受者的免疫系統，或在移植前將非自體細胞膠囊化到免疫隔離的半滲透性膜中。膠囊化技術通常分類為包括小球形囊泡的微囊化和包括較大的平面片和中空纖維膜的巨囊化(Uludag, H.等人.Technology of mammalian cell encapsulation.AdvDrug Deliv Rev.2000 ；42:29-64)。製備微膠囊的方法是本領域中已知的，且包括例如以下中所公開的:Lu MZ,等人，Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly (allylamine).Biotechnol Bioeng.2000,70:479-83, Chang TM 和 PrakashS.Procedures for microencapsulation of enzymes,cells and genetically engineeredmicroorganisms.Mol Biotechnol.2001,17:249-60,和 Lu MZ,等人，A novel cellencapsulation method using photosensitive poly (allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate).J Microencapsul.2000,17:245-51。

例如，微膠囊的製備是通過將改性的膠原與2-甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)的三元聚合物殼複合，生成2-5 μ m厚的膠囊。這樣的微膠囊可利用另外的2-5 μ m的三元聚合物殼進一步膠囊化以賦予帶負電荷的平滑表面並使血楽■蛋白吸附最小化(Chia, S.M.等人.Mult1-layered microcapsules for cellencapsulation Biomaterials.2002 23:849-56)。其他微膠囊是基於海洋多糖藻酸鹽(Sambanis, A.Encapsulated islets indiabetes treatment.Diabetes Thechnol.Ther.2003, 5:665-8)或其衍生物。例如，微膠囊可通過在氯化鈣存在下在聚陰離子藻酸鈉和硫酸纖維素鈉與聚陽離子聚(亞甲基-共-胍)鹽酸鹽之間的聚合電解質絡合來製備。將理解的是，當使用較小的膠囊時，細胞膠囊化得以改進。因此，當膠囊尺寸從Imm降低到400 μ m時，膠囊化的細胞的質量控制、機械穩定性、擴散性質和體外活性提高了(Canaple L.等人，Improving cell encapsulation through size control.J BiomaterSci Polym Ed.2002 ; 13:783-96)。並且，發現具有良好控制的小至7nm的孔徑、定製的表面化學和精確的微結構的納米孔生物膠囊成功地免疫隔離了細胞的微環境(WilliamsD.Small is beautiful:microparticle and nanoparticle technology in medicaldevices.Med Device Technol.1999,10:6~9 ；Desai, T.A.Microfabrication technologyfor pancreatic cell encapsulation.Expert Opin Biol Ther.2002, 2:633-46)。免疫抑制劑的例子包括但不限於，氨甲蝶呤、環磷醯胺、環孢素、環孢黴素A、氯喹、輕氯喹、硫氮磺胺批唳(sulphasalazopyrine)、金鹽、D-青黴胺、來氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滯素、英夫利昔單抗(REMICADE.sup.R)、靶向炎性細胞因子的生物劑TNFa阻斷劑依那西普、和非留體類抗炎藥(NSAID)。NSAID的例子包括但不限於，乙醯水楊酸、膽鹼水楊酸鎂、二氟尼柳、水楊酸鎂、雙水楊酯、水楊酸鈉、雙氯芬酸、依託度酸、非諾洛芬、氟吡洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氧胺苯酸鈉、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、託美汀、撲熱息痛、布洛芬、Cox-2抑制劑和曲馬多。可將本發明的成體胰島β細胞本身，或在其中其與適宜的運載體(carrier)或賦形劑混合的藥物組合物中移植到人類受治療者中。如本文所用的「藥物組合物」指本文所描述的一種或多種活性成分與其他化學組分諸如生理上適宜的運載體和賦形劑的製品。藥物組合物的目的是為了協助將化合物施用到生物體。本文中術語「活性成分」指負責生物效應的本發明的成體胰島β細胞。下文中，短語「生理學上可接受的運載體」和「藥學上可接受的運載體」可互換地使用，指不會對生物體產生顯著的刺激和不會消除所施用的化合物的生物活性和性質的運載體或稀釋劑。這些短語中包括佐劑(adjuvant)。

本文中術語「賦形劑」指添加到藥物組合物中以進一步協助活性成分的施用的惰性物質。非限制地，賦形劑的例子包括碳酸鈣、磷酸鈣、多種糖類和澱粉類型、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。本發明的藥物組合物可通過本領域中熟知的方法來製造，例如，通過常規的混合、溶解、粒化、製造糖衣藥丸、磨細、乳化、膠囊化、包埋(entrapping)或凍幹工藝。因此用於根據本發明的用途的藥物組合物可以常規的方式利用一種或多種生理學上可接受的運載體來配製，所述生理學上可接受的運載體包括賦形劑和助劑，其協助將活性成分加工為可用於藥學應用的製品。合適的製劑取決於所選擇的施用途徑。對於注射，藥物組合物的活性成分可在水溶液中配製，優選地在生理學相容的緩衝液諸如漢克氏溶液、林格氏溶液或生理鹽緩衝液。適用於本發明中的藥物組合物包括其中含有有效實現預期目的的量的活性成分的組合物。更具體地，治療有效量意為有效預防、減輕或改善疾患(例如，糖尿病)的症狀或延長被治療的受治療者的生存的活性成分(產胰島素細胞)的量。治療有效量的確定完全在本領域技術人員的能力之內，尤其是根據本文提供的詳細的公開內容。對於本發明的方法中所用的任何製品，可從動物模型(例如，STZ糖尿病小鼠)估計治療有效量或劑量以達到想要的濃度或效價。這樣的信息可用於更準確地確定在人類中有效的劑量。本文所描述的活性成分的毒性和治療效力可在實驗動物中通過標準的藥學方案來確定。可將從這些動物研究中獲得的數據用於配製一系列用於人類的劑量。根據所用的劑型和所用的施用途徑，劑量可以是不同的。確切的製劑、施用途徑和劑量可由每個醫師參照患者的狀況來選擇。(參見，例如，Fingl,等人，1975,於"The Pharmacological Basisof Therapeutics ",中第 I 章第 I 頁)。施藥量和間隔可單獨地調整以提供足以誘導血糖量正常的細胞數(最低有效濃度，MEC)。對於每種製品，MEC將是不同的，但可從體外數據來估計。獲得MEC所必需的劑量將取決於個體的特徵和施用的途徑。可使用檢測測定來確定血漿濃度。當然，待施用的組合物的量將取決於被治療的受治療者、疾病的嚴重度、施用的方式、處方醫師的判斷等。若需要，本發明的組合物可存在於包裝或分配器裝置中，比如FDA批准的藥盒，其可含有一種或多種含活性成分的單位劑型。包裝可以，例如，包括金屬箔或塑料箔，比如泡罩包裝。包裝或分配器裝置可附有施用說明書。包裝或分配器還可設有與容器一起的須知，該須知為監管藥物的製造、使用或銷售的政府機構指定的形式，其反映了組合物的形式或人類施用或獸醫施用獲機構批准。這樣的須知，例如，可以是關於處方藥由美國食品與藥物管理局批准的標籤，或批准的產品內頁。還可製備在相容的藥物運載體中配製的包括本發明的製劑的組合物，並將其置於適當的容器中，並貼上關於適應症(indicated condition)的治療的標籤，如以上所詳述。術語「包含(comprises)」、「包含(comprising) 」、「包括(includes) 」、「包括(including) 」、「具有(having) 」和其同根詞意為「包括但不限於」。術語「由......組成」意為「包括且限於」。術語「基本上由......組成」意為該組合物、方法或結構可包括另外的成分、步驟 和/或部件不會實質性地改變所請求保護的組合物、方法或結構的基本的和新穎的特徵。如本文所用的，除非文中另外清楚地規定，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」和「該(the) 」包括複數指代對象。例如，術語「化合物」或「至少一種化合物」可包括多種化合物，包括其混合物。遍及本申請，本發明的多種實施方案可以範圍形式來呈現。應理解的是，範圍形式的描述僅為方便和簡潔，並不應解釋為對本發明的範圍的硬性限制。因此，應認為範圍的描述具體地公開了該範圍中的所有可能的子範圍以及單獨的數值。例如，應認為比如從I至6的範圍的描述具體地公開了子範圍比如從I至3、從I至4、從I至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及該範圍中的單獨的數目，例如，1、2、3、4、5和6。無論範圍的寬度如何其均適用。當本文指定了數值範圍時，其意在包括該指定的範圍中的任何引用的數字(分數或整數)。短語第一指定數字和第二指定數字「之間的範圍(ranging)/範圍(ranges) 」和短語第一指定數字「至」第二指定數字「之間的範圍(ranging)/範圍(ranges) 」在本文可互換地使用，且意為包括第二和第二指定的數字和其間的所有分數和整數。如本文所用的術語「方法」指用於實現給定的任務的方式、工具、技術和方案，包括但不限於，化學、藥理學、生物學、生物化學和醫學領域中的專業人員已知的或易於從其已知的方式、工具、技術和方案中開發的那些方式、工具、技術和方案。如本文所用的，術語「治療」包括消除、基本上抑制、減緩或逆轉病症的發展，基本上減輕病症的臨床上的或美學上的症狀，或基本上阻止病症的臨床上或美學上的症狀的出現。
應理解的是，為清楚起見而在分開的實施方案中描述的本發明的某些特徵，也可在單一的實施方案中組合地提供。相反地，為簡便起見而在單一的實施方案中描述的本發明的多種特徵，也可分開來提供，或以任何適宜的子組合來提供，或在本發明的任何其他所描述的實施方案中適宜地提供。多個實施方案中描述的某些特徵不應被認為是那些實施方案的必要特徵，除非無那些元素時該實施方案不生效。如上文所描繪和以下權利要求書部分中所請求保護的本發明的多個實施方案和方面在以下的實施例中得到實驗支持。
實施例現參考以下實施例，其連同以上描述以非限制的方式示出了本發明的一些實施方案。一般，本文所用的名稱和本發明中所用的實驗室方案包括分子技術、生物化學技術、微生物技術和重組DNA技術。文獻中充分地解釋了這些技術。參見，例如，「Molecular Cloning:A laboratory Manual，，Sambrook等人，(1989) ；uCurrent Protocolsin Molecular Biology」 卷 1-1II Ausubel, R.M.，編(1994) ；Ausubel 等人，「CurrentProtocols in Molecular Biology」，John Wiley and Sons, Baltimore,Maryland(1989)；Perbal, iiA Practical Guide to Molecular Cloning，，，John Wiley & Sons，NewYork (1988) ;Watson 等人，「Recombinant DNA」，Scientific American Books，New York ；Birren 等人.(編)「Genome Analysis:A Laboratory Manual Series」，卷 1-4，ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York(1998);如以下中所列出的方法:美國專利第 4，666，828 號；第 4，683，202 號；第 4，801，531 號；第 5，192，659 號和第 5，272，057 號；「Cell Biology:ALaboratory Handbook，，，卷 1-1II Cellis，J.E.，編(1994) ;Freshney 的「Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique, Wiley-Liss,N.Y.(1994)，第三版；「Current Protocols in Immunology」卷 1-1II Coligan J.E.，編(1994) ;Stites 等人.(編)，「Basic and Clinical Immunology，，(第八片反)，Appleton & Lange, Norwalk,CT (1994) ；Mishell 和 Shiigi (編)，「Selected Methods in Cellular Immunology」，W.H.Freeman and C0.，New York (1980);可獲得的免疫測定在專利和科學文獻中廣泛地描述，參見，例如，美國專利第3，791，932號；第3，839，153號；第3，850，752號；第3，850，578號；第 3，853，987 號；第 3，867，517 號；第 3，879，262 號；第 3，901，654 號；第 3，935，074號；第 3，984，533 號；第 3，996，345 號；第 4，034，074 號；第 4，098，876 號；第 4，879，219號；第 5，011，771 號和第 5，281，521 號,Oligonucleotide Synthesis」Gait，Μ.J.，編(1984) ；iiNucleic Acid Hybridization」Hames，B.D.，和 Higgins S.J.，編.(1985)；「Transcription and Translation」 Hames，B.D.，和 Higgins S.J.，編(1984) ;「AnimalCell CulturenFreshney,R.1.，編(1986) Immobilized Cells and Enzymes^IRL Press,(1986) ;「A Practical Guide to Molecular Cloning」 Perbal，B.，(1984)和「Methodsin Enzymology，，卷 1-317，Academic Press ;「PCR Protoeols:A Guide To Methods AndApplicatiohs」，Academic Press，San Diego, CA(1990) ;Marshak 等人，「Strategies forProtein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual，，CSHLPress (1996);其全部通過引用併入，如同其在本文中完全列出。遍及本文提供了其他一般參考文獻。其中的方案被認為是本領域中熟知的，並為方便讀者而提供。其中所含的全部信息通過引用併入本文。實施例1作為胰島素來源的擴增的β細胞材料和方法無外源條件下的擴增:將成體人類胰島細胞鋪板到包被有MesenCult XF附著基質(Stem Cell Technology, Canada)的平板中並在 MesenCult XF 培養基(Stem CellTechnology, Canada)中擴增。在可溶性因子混合物中的再分化:再分化方案基於超低附著平板中的無血清培養基(SFM)中的細胞的群集，並以2個步驟暴露於可溶性因子的混合物:步驟1:在含25mM葡萄糖並補充有I % BSA級分V、100U/ml青黴素、100 μ g/ml鏈黴素、ITS (胰島素、鐵傳遞蛋白、硒)、N2補充物、B27補充物、IOmM煙醯胺、8nM exendin-4和8nM激活素A的CMRL 1066培養基中孵育6天。步驟2:在含5.6mM葡萄糖並補充有I % BSA級分V、100U/ml青黴素、100 μ g/ml鏈黴素、ITS、N2補充物、B27補充物、IOmM煙醯胺和8nM exendin-4的CMRL 1066培養基中孵
育2天。新點綠(NG):將再分化的細胞經胰酶消化成單細胞懸液，在PBS中2.5 μ M NG中與0.00125%普朗尼克F-127 —起孵育10分鐘，並進行FACS分析。結果誘導細胞以與血清存在時細胞生長的速率相當的速率進行複製(圖1Α)。如通過Ki67染色所判斷的(圖1B)，顯示譜系示蹤β細胞來源的(BCD)細胞在這些條件下複製。與試驗的所有其他組合相比，再分化方案導致了最高水平的胰島素mRNA(圖2)。這些水平與組合中的一些相比是其4倍以上。步驟2中葡萄糖濃度的降低不僅導致了較高的胰島素mRNA水平，還導致了其他胰島激素的較低的mRNA水平(圖3)。利用我們的譜系示蹤方法，本發明人已顯示該處理導致了 BCD細胞的特異性再分化，這與來自存在於胰島製品中的其他細胞類型的細胞不同。在獲自4個不同的人類供體的細胞中，再分化後C-肽陽性細胞的百分比為9.1 ±3.5%。因為β細胞佔原代胰島細胞群體的約40% (43±3%)，且BCD細胞的比例在擴增期間保持穩定，C-肽陽性細胞的百分比代表BCD細胞中約23%再分化。使用了報告子RIP-DsRed2慢病毒以允許通過追尋活細胞中紅色螢光的出現而優化再分化方案(圖4)。該標記方法還允許在步驟2結束時分選再分化的胰島素陽性細胞。DsRed2陽性細胞含胰島素mRNA水平為人類胰島中發現的胰島素mRNA水平的52% (圖5A)。人類C-肽含量為374±160ng/106細胞，代表其在人類胰島中的水平的8% (圖5B)。胰島素原含量為171±22ng/106細胞,表不85.6%的胰島素原被加工為成熟的胰島素。再分化方案重複地對來自所有供體的細胞起作用。顯示響應於該處理的目前最近的傳代為第12代，代表著4096倍擴增。
新點綠(NG)，已知與Zn++離子結合的一種螢光染料，用於標記β細胞，β細胞在胰島素囊泡中含Zn++離子。已顯示該染料與細胞生存力和功能完全相容。如圖6Α中所見，被標記的細胞可易於與未標記的細胞區分和通過FACS分選。分選導致胰島素陽性細胞的大量富集(圖6B)。實施例2B⑶細胞再分化的條件的開發材料和方法 細胞培養:分離後2.8±1.2天收到人類胰島。如通過雙硫腙染色所確定的，胰島純度為83±9%。將來自單獨的供體的胰島(參見表I中的供體列表)分散為單細胞，如先前所描述(1-4)的標記β細胞並在含5.6mM葡萄糖和補充有10% FCS、青黴素(50單位/ml)和鏈黴素(50 μ g/ml)(均來自Gibco-1nvitrogen)的CMRL 1066培養基(除另指明外，組織培養試劑來自 Biological Industries, Israel)中擴增。表I
權利要求
1.一種離體提高表達SLUG的祖細胞中的胰島素含量的方法，所述方法包括下調所述祖細胞中的所述SLUG的量或活性,從而提高所述祖細胞中的胰島素含量。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述祖細胞選自由去分化的成體胰島β細胞、間充質幹細胞和從β細胞去分化的誘導性多能幹細胞組成的組。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述下調通過利用多核苷酸劑來進行。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述下調通過利用針對所述SLUG的抗體來進行。
5.如權利要求3所述的方法，其中所述多核苷酸劑包括針對所述SLUG的siRNA劑或shRNA 劑。
6.如權利要求2所述的方法，其中所述下調通過將所述去分化的成體胰島β細胞暴露於含煙醯胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培養基來進行，所述培養基不含血清。
7.如權利要求6所述的方法，包括: (a)將所述成體胰島β細胞暴露於含 所述煙醯胺、所述exendin-4、所述激活素A的培養基，其中所述葡萄糖以IO-1OOmM的濃度存在；和隨後 (b)將所述成體胰島β細胞暴露於含所述煙醯胺和所述exendin-4的另外的培養基，其中所述葡萄糖以0.5-10mM的濃度存在。
8.如權利要求6或7所述的方法，其中所述煙醯胺以1-1OOmM的濃度存在。
9.如權利要求6或7所述的方法,其中所述exendin-4以1-1OOmM的濃度存在。
10.如權利要求6或7所述的方法，其中所述激活素A以1-1OOnM的濃度存在。
11.如權利要求7所述的方法，其中所述另外的培養基不含激活素A。
12.如權利要求6或7所述的方法，其中所述培養基不含β細胞素。
13.如權利要求7所述的方法，其中所述另外的培養基不含β細胞素。
14.如權利要求2或6所述的方法，其中所述去分化的成體胰島β細胞通過培養所述成體胰島β細胞至少10代而生成。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述培養在CMRL培養基中進行。
16.如權利要求7所述的方法，還包括在步驟(a)之前擴增所述胰島β細胞。
17.如權利要求7所述的方法，其中步驟(a)進行6天。
18.如權利要求7所述的方法，其中步驟(b)進行2天。
19.如權利要求7所述的方法，還包括在步驟(b)之後分離所述成體胰島β細胞。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述分離利用鋅結合染料來進行。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述鋅結合染料包括新點綠。
22.如權利要求19所述的方法，其中所述分離利用抗NCAM抗體來進行。
23.如權利要求2所述的方法，其中用胰酶消化所述去分化的成體胰島β細胞。
24.一種離體提高成體胰島β細胞中的胰島素含量的方法，所述方法包括將所述成體胰島β細胞暴露於含煙醯胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培養基，所述培養基不含血清，從而提高所述成體胰島β細胞中的胰島素含量。
25.如權利要求24所述的方法，包括: (a)將所述成體胰島β細胞暴露於含所述煙醯胺、所述exendin-4、所述激活素A的培養基，其中所述葡萄糖以IO-1OOmM的濃度存在；和隨後 (b)將所述成體胰島β細胞暴露於含所述煙醯胺和所述exendin-4的另外的培養基，其中所述葡萄糖以0.5-10mM的濃度存在。
26.如權利要求24所述的方法，其中所述煙醯胺以1-1OOmM的濃度存在。
27.如權利要求24所述的方法，其中所述exendin-4以1-1OOnM的濃度存在。
28.如權利要求24所述的方法，其中所述激活素A以1-1OOnM的濃度存在。
29.如權利要求25所述的方法，其中所述另外的培養基不含激活素A。
30.如權利要求24所述的方法，其中所述培養基不含β細胞素。
31.如權利要求25所述的方法，其中所述另外的培養基不含β細胞素。
32.如權利要求24所述的方法，其中所述成體胰島β細胞包括去分化的成體胰島β細胞。
33.如權利要求32所述的方法，其中所述去分化的成體胰島β細胞包括從β細胞生成的誘導性多能幹細胞。
34.如權利要求32所述的方法，其中所述去分化的成體胰島β細胞通過培養所述成體胰島β細胞至少10代而生成。
35.如權利要求34所述的方法，其中所述培養在CMRL培養基中進行。
36.如權利要求25所述的方法，還包括在步驟(a)之前擴增所述胰島β細胞。
37.如權利要求25所述的方法，其中步驟(a)進行6天。
38.如權利要求25所述的方法，其中步驟(b)進行2天。
39.如權利要求25所述的方法，還包括在步驟(b)之後分離所述成體胰島β細胞。
40.如權利要求39所述的方法，其中所述分離利用鋅結合染料來進行。
41.如權利要求40所述的方法，其中所述鋅結合染料包括新點綠。
42.如權利要求39所述的方法，其中所述分離利用抗NCAM抗體來進行。
43.如權利要求24所述的方法，其中用胰酶消化所述成體胰島β細胞。
44.如權利要求24所述的方法,還包括將所述成體胰島β細胞與下調SLUG的量或活性的劑接觸。
45.如權利要求44所述的方法，其中所述接觸在所述暴露之後進行。
46.一種細胞的分離的群體，包含下調SLUG的siRNA，其中所述細胞分泌胰島素。
47.一種細胞的分離的群體，根據權利要求24-45中任一項所述的方法生成。
48.一種在受治療者中治療糖尿病的方法，所述方法包括將治療有效量的權利要求46或47所述的成體胰島β細胞的群體移植到所述受治療者中，從而治療糖尿病。
49.權利要求46或47所述的成體胰島β細胞的群體用於在受治療者中治療糖尿病的用途。
50.如權利要求46或47所述的分離的成體胰島β細胞的群體，所述成體胰島β細胞經遺傳修飾以表達藥劑。
51.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如權利要求46或47所述的成體胰島β細胞的群體作為活性成分和藥學上可接受的運載體。
全文摘要
本發明提供了離體提高表達SLUG的祖細胞中的胰島素含量的方法。該方法包括使祖細胞中的SLUG的量或活性下調。還提供了從而生成的細胞的群體和其用途。
文檔編號C12N5/071GK103210082SQ201180054714
公開日2013年7月17日 申請日期2011年9月15日 優先權日2010年9月15日
發明者西蒙·埃弗拉特, 霍爾格·A·魯斯 申請人:雷蒙特亞特特拉維夫大學有限公司