從生物學樣品富集靶細胞的方法及除去白細胞的方法
2023-09-16 17:28:40 1
專利名稱：從生物學樣品富集靶細胞的方法及除去白細胞的方法
技術領域：
本發明涉及從生物學樣品富集靶細胞的方法及除去白細胞的方法。
背景技術：
包括幹細胞、胎兒細胞、循環腫瘤細胞(CTC)、免疫細胞等在內的 細胞在疾病的預防、檢測、診斷和治療方面有很大應用。
幹細胞是指一類具有自我複製能力的多潛能細胞，包括胚胎幹細胞、 骨髓幹細胞、成體幹細胞、臍血幹細胞、皮膚幹細胞等。在一定條件下， 幹細胞可以分化成多種功能細胞，因此幹細胞具有治療許多疑難病症、提 供器官移植，以及康復、保健，減輕老化、恢復青春活力等等廣泛應用。
己經證明早在妊娠五周母血循環中就可監測出胎兒細胞。目前，獲取 胎兒細胞進行產前診斷的方法主要有羊膜腔穿刺、絨毛活檢和臍血管穿刺。 這些手段對胎兒有一定的風險，有可能造成流產。從母血中分離出胎兒細 胞預示著只需通過簡單的靜脈穿刺途徑即可獲得胎兒細胞。胎兒細胞的臨 床應用將包括早期診斷胎兒染色體或基因異常。
大量報導提示甚至可在以成像分析方式檢測到原發腫瘤之前，可在患 者中發現循環腫瘤細胞(CTC)。除了在早期診斷和預測中的潛在作用外， CTC還可在表徵隨腫瘤進程的遺傳和免疫表型變化中發揮主要作用，從而 有助於指導個體化治療。
由於免疫系統或其他系統的疾病，或由於免疫接種或某些臨床治療措 施及某些外界環境因素的影響，免疫細胞(例如T淋巴細胞、B淋巴細胞， K淋巴細胞或NK淋巴細胞)的數量或功能均可發生變化。因此，進行細 胞免疫檢測，對於某些疾病的診斷和發病機理研究、免疫治療或預防接種 的效果評估及環境因素對機體免疫功能的影響，都具有重要的意義。
但是所述幹細胞、胎兒細胞、循環腫瘤細胞(CTC)、免疫細胞在生儘管已將各種技術用於富集、分離和表徵靶細胞，但是其中許多具有 相似的原理，即基於抗體的正選擇。由於細胞表面標記的異質性表達，這 些用於耙細胞檢測的策略顯然受到以下因素的限制抗不同靶細胞上的生
物標記的抗體的可獲得性、敏感性和特異性。其它策略包括紅細胞(RBC)、 白細胞(WBC)的負除去。目前主要基於大小過濾除去較小的RBC和WBC， 但因為某些靶細胞例如CTC可如WBC —樣小，所述基於大小過濾的方法 有丟失耙細胞的危險。
對於除去白細胞的方法，現有技術中雖存在使用抗CD45包被的30nm 磁珠(Miltenyi產品，Germany)除去白細胞的方法，但該方法不僅昂貴(RMB 600-700/試驗)，費時(超過4小時/試驗)，而且WBC去除效率不高(WBC 去除率為約2-3 logs)。
發明內容
為了克服現有技術的缺陷，本發明創造性地將基於摩爾滲透壓濃度 (osmolality)的方式與免疫親和層析法聯合起來用於分別去除RBC和 WBC，從而達到富集靶細胞，尤其是稀有細胞的目的。該方法不僅成本低， 而且高效地使耙細胞得以富集，並易於後續檢測。所述靶細胞包括幹細胞、 胎兒細胞、循環腫瘤細胞(CTC)、免疫細胞等。
本發明還提供了一種除去白細胞的方法，該方法不僅成本低，省時， 而且效率高。
具體實施例方式
在本發明的一個具體實施方式
中，本發明提供一種從生物學樣品富集
耙細胞的方法，該方法包括
用基於摩爾滲透壓濃度的方式除去紅細胞和用免疫親和層析法除去白 細胞。
本發明創造性地聯合應用基於摩爾滲透壓濃度的方式除去紅細胞和免疫親和層析法除去白細胞來富集靶細胞。利用摩爾滲透壓濃度的方式除去 紅細胞和利用免疫親和層析法除去白細胞這兩個過程沒有特別的順序要 求。例如可以先利用親和層析法除去白細胞然後再利用基於摩爾滲透壓濃 度的方式除去紅細胞；或者用基於摩爾滲透壓濃度的方式除去紅細胞然後 再利用親和層析法除去白細胞。為了更快地、更有效地使白細胞通過親和 層析柱，在本發明的一個優選實施方式中，用基於摩爾滲透壓濃度的方式 除去紅細胞然後再利用親和層析法除去白細胞。
在本發明的一個具體實施方式
中，所述的生物學樣品是體液；優選所 述的體液是血液、骨髓、脊髓或手術液(surgical fluid)。在本發明的一個 實施方式中，以血液為例驗證了本發明方法的有效性。同時由於血液、骨 髓、脊髓或手術液的密度類似且靶細胞在其中的存在狀態類似，所以本發 明的方法可用於骨髓、脊髓或手術液中靶細胞的富集。
為了收集血液，將人或任何其它動物的血樣收集在抗凝血收集管中或 含有任何抗凝劑的管中，所述抗凝劑包括乙二胺四乙酸(EDTA)、枸櫞酸 葡萄糖(ACD)等。為了收集骨髓，可在供者的髂骨部位穿刺採集骨髓； 也可以動員骨髓和其他部位的造血幹細胞大量釋放到外周血中去，然後從 供者的手臂靜脈中採集。脊髓可通過例如脊髓穿刺獲得。手術液可以為利 用手術方式獲得的體液，例如腹腔或胸腔積液，其中包括本發明所述的一 些耙細胞和蛋白。
在本發明的一個優選實施方式中，所用的血液是取血當天，優選取血 起20小時之內，更優選取血起10小時之內，進一步優選取血起5小時之 內或取血起3小時之內或取血起1小時之內，最優選取血起立即獲得的新 鮮血液。上述新鮮血液中的紅細胞對RBC裂解緩衝液敏感，而耙細胞對 RBC裂解緩衝液不敏感。
在本發明的一個具體實施方式
中，其中所述免疫親和層析法中所使用 的免疫顆粒的尺寸為1 pm 20 pm，更優選為2 pm 15 pm，進一步優選為 5pm 10^im。在本發明的一個具體實施方式
中，進一步優選所述的免疫顆 粒具有可再生性。可利用Tris-Glycine等緩衝液對免疫顆粒進行洗滌和重新 使用，從而節約成本。在本發明的一個具體實施方式
中，用基於摩爾滲透壓濃度的方式除去 紅細胞。在本發明的一個優選實施方式中，所述基於摩爾滲透壓濃度的方
式中包括沉澱和裂解紅細胞。所述沉澱優選以500 3000 rpm，更優選100 2000rpm離心1 6分鐘，優選2 4分鐘以沉澱RBC，優選同時除去血漿。 在室溫將所收集的RBC於RBC裂解緩衝液中輕柔旋轉振蕩5 20分鐘。 然後將所獲得的溶液以500 3000 rpm，更優選100 2000 rpm，離心l IO分鐘，更優選3 6分鐘以沉澱未裂解的細胞，所述未裂解的細胞包括白 細胞和稀有細胞。
在本發明的一個具體實施方式
中，所述用於除去白細胞的免疫顆粒位 於親和層析柱中並結合有靶向白細胞的特異性結合物。優選所述的特異性 結合物為識別在白細胞上表達的抗原的抗體。由於CD45 (又稱"白細胞表 面共同抗原")是最認可和接受的白細胞表面抗原，所以更優選所述的抗 體為抗CD45抗體。最優選將抗CD45 mAb(CD45單抗)偶聯到Affi-Gel 10 基質上。可採用本領域技術人員已知的親和層析柱進行層析。在本發明的 一個優選實施方式中，為了除去白細胞，將含有白細胞的溶液以約0.5 8.5 ml/min的流速，優選以約0.75 3.5 ml/min的流速，進一步優選以約1 2.5 ml/min的流速流過親和層析柱。
利用本發明的方法所獲得的靶細胞適於後續分析、操作或應用，當然 也可在獲得了本發明的靶細胞後，對靶細胞內的蛋白和/或基因進行後續分 析、操作或應用。在本發明的一個具體實施方式
中，所述後續分析、操作 或應用為以下之一流式細胞術、聚合酶鏈式反應(PCR)、免疫螢光、免 疫細胞化學、圖像分析、酶學測定、炎症研究、基因表達譜分析、治療效 力測驗、細胞培養和細胞治療、質譜和其它與細胞和/或蛋白相關的研究等。
在本發明的一個具體實施方式
中，用本發明的方法富集的靶細胞包括 幹細胞、胎兒細胞、循環腫瘤細胞(CTC)、免疫細胞中的至少一種。在 利用本發明的方法富集了上述靶細胞的基礎上，可以利用進一步的分離純 化方法獲得循環腫瘤細胞、幹細胞(包括胚胎幹細胞、骨髓幹細胞、成體 幹細胞、臍血幹細胞、皮膚幹細胞等)、胎兒細胞、免疫細胞(包括T淋 巴細胞、B淋巴細胞，K淋巴細胞和NK淋巴細胞)等，並可進一步利用這些純化的循環腫瘤細胞、幹細胞、胎兒細胞、免疫細胞進行預測、檢測、 診斷和治療。
在本發明的一個具體實施方式
中，本發明的方法還包括除去血漿蛋白。 為了更有利於節省時間和減少操作步驟，除去血漿蛋白的步驟可與沉澱紅
細胞的步驟同時進行。例如在本發明的一個實施方式中，將全血以1500離 心3分鐘，以沉澱紅細胞和去除包括血槳蛋白在內的血漿。
在本發明的一個具體實施方式
中，優選回收本發明的方法所除去的白 細胞和/或所除去的血漿蛋白，並將其進一步用於後續分析、操作或應用， 例如，流式細胞術、聚合酶鏈式反應(PCR)、免疫螢光、免疫細胞化學、 圖像分析、酶學測定、炎症研究、基因表達譜分析、治療效力測驗、細胞 培養、細胞治療、質譜和其它與細胞和/或蛋白相關的研究等。例如可利用 進一步的分離純化方法獲得白細胞或血漿蛋白等，並可進一步利用這些純 化的白細胞或血漿蛋白進行預測、檢測、診斷和治療。
在本發明中，術語"富集"以其最廣泛的含義使用，是使一物質比其 原存在環境條件下更加濃縮，其包括"積累"、"濃縮"、"提取"、"分 離"等含義在內。
本發明還提供了一種除去白細胞的方法，該方法包括採用抗CD45抗 體偶聯的Affi-Gd IO除去白細胞。可採用本領域技術人員已知的親和層析 柱進行層析。在本發明的一個優選實施方式中，為了除去白細胞，將含有 白細胞的溶液以約0.5 8.5 ml/min的流速，優選以約0.75 3.5 ml/min的流 速，進一步優選以約1 2.5 ml/min的流速流過親和層析柱。可利用 Tris-Glycine等緩衝液對免疫顆粒進行洗滌和重新使用，從而節約成本。該 方法不僅成本低，省時，而且效率高。
以下以實施例的方式進一步說明本發明，所述實施例並不用於限定本 發明的範圍。
實施例
實施例l、從生物學樣品除去白細胞的方法
將人血稀釋在含有5 mM EDTA的PBS中，加入3倍體積的RBC裂解緩衝液(具體成分見下)，於室溫輕柔旋轉振蕩12分鐘。將樣品於1500 rpm 旋轉離心5分鐘以收集細胞沉澱。棄去上清液中的裂解RBC，並將細胞沉 澱重懸浮在含有5 mM EDTA的3 ml 5 ml的PBS中，並使其通過抗CD45 抗體偶聯的Affi-Gel 10 (Pierce, IL， US)親和層析柱以除去WBC，其中將 細胞以2ml/min的流速於PBS中流過所述親和層析柱，並收集流過液。與 現有技術中利用Miltenyi，s試劑盒去除白細胞相比，本發明除去白細胞的 方法顯著降低了成本(本發明分離方法的成本為RMB 80-150/試驗；而 Multiny，s試劑盒的成本為RMB 600-700/試驗)、縮短了時間(本發明分離 方法每個試驗需不到40分鐘即可完成去除白細胞；而Multiny's試劑盒去 除白細胞需超過4小時/試驗)、而且效率高(本發明方法的WBC去除率 可達約3-4 logs;而Multiny，s試劑盒的WBC去除率僅為約2-3 logs)。
抗CD45抗體偶聯的Affi-Gel 10的製備由於購自Pierce (IL， US)的 Affi-Gel IO含有可供激活的化學基團，所以將抗CD45抗體與Affi-Gel 10 混合約15分鐘，即可完成抗CD45抗體與Affi-Gel 10的偶聯。
RBC裂解緩衝液(pH7.2):
NH4C1 82.9 g
KHC03 10 g
EDTA 二鈉 0.37 g
H20 1 L
實施例2、從生物學樣品富集靶細胞的方法
將5ml 10ml的人血收集在含有EDTA的試管中，以1500 rpm旋 轉離心3分鐘以沉澱RBC和除去包括血漿蛋白在內的血漿。在室溫將所收 集的RBC於10 ml基於NH4C1的RBC裂解緩衝液(具體成分如上)輕柔 旋轉振蕩15分鐘。然後將所獲得的溶液以1500 rpm旋轉離心5分鐘以沉 澱未裂解的細胞，所述未裂解的細胞包括WBC和稀有細胞。將所得未裂 解細胞沉澱重懸浮在5 ml PBS中，並使其通過0.5 ml抗CD45抗體偶聯 的Affi-Gel 10 (Pierce, IL, US)親和層析柱以除去WBC，其中將細胞以 2ml/min的流速於PBS中流過所述親和層析柱，並收集流過液。將所收集的含有稀有細胞的流過液在900 g離心5分鐘以上。將細胞沉澱重懸浮，以 進行後續分析。富集後，可以用10mlTris-Glycine (pH2.5)洗滌親和柱 以除去所有的結合分子，然後用PBS (pH7.4)進行中和以備重新使用。
實施例3、利用摻加研究驗證本發明的富集方法的收率 用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)預先標記靶細胞(例如可從ATCC 獲得的HeLa細胞或MCF-7細胞)然後摻入人血中，使用實施例1所述的 方法富集摻加的細胞。平均回收率為約70% 80%。與現有技術中利用 Miltenyi's試劑盒去除白細胞的富集方法相比，本發明的富集方法顯著降低 了成本(本發明富集方法的成本為RMB 100-200/試驗；而利用Multiny's試 劑盒的僅去除白細胞的成本就為RMB 600-700/試驗)、縮短了時間(本發 明的富集方法每個試驗需不到1小時即可完成去除紅細胞和白細胞；而 Multiny's試劑盒僅去除白細胞就需超過4小時/試驗)、而且效率高(本發 明方法的WBC去除率可達約3-4 logs;而Multiny's試劑盒的WBC去除 率僅為約2-3 logs)。
權利要求
1、一種從生物學樣品富集靶細胞的方法，該方法包括用基於摩爾滲透壓濃度的方式除去紅細胞和用免疫親和層析法除去白細胞。
2、 如權利要求1所述的方法，其中所述的生物學樣品是體液；優選所 述的體液是血液、骨髓、脊髓或手術液。
3、 如權利要求2所述的方法，其中所述的血液是取血當天的新鮮血液。
4、 如權利要求l所述的方法，其中所述免疫親和層析法中所使用的免 疫顆粒的尺寸為1 pm 20 pm，進一步優選為5 pm 10 更進一步優選 所述的免疫顆粒具有可再生性。
5、 如權利要求1所述的方法，其中所述基於摩爾滲透壓濃度的方式包 括沉澱和裂解紅細胞。
6、 如權利要求l所述的方法，其中所述免疫親和層析法中所使用的抗 體為識別在白細胞上表達的抗原的抗體；優選所述抗體為抗CD45抗體；更 優選所述抗CD45抗體偶聯到Affi-Gd 10基質上；進一步優選所述CD45 抗體為抗CD45單抗。
7、 如權利要求1所述的方法，該方法所獲得的靶細胞適於後續分析、 操作或應用，所述後續分析、操作或應用為以下之一流式細胞術、聚合 酶鏈式反應、免疫螢光、免疫細胞化學、圖像分析、酶學測定、炎症研究、 基因表達譜分析、治療效力測驗、細胞培養和細胞治療。
8、 如權利要求1所述的方法，其中所述的靶細胞包括幹細胞、胎兒細 胞、循環腫瘤細胞、免疫細胞中的至少一種。
9、 如權利要求l所述的方法，該方法還包括除去血漿蛋白；優選回收 所除去的白細胞和/或所除去的血漿蛋白。
10、 一種從生物學樣品除去白細胞的方法，該方法包括採用抗CD45 抗體偶聯的Affi-Gd 10除去白細胞。
全文摘要
本發明涉及從生物學樣品富集靶細胞的方法及除去白細胞的方法。具體地說，本發明提供一種從生物學樣品富集靶細胞的方法，該方法包括用基於摩爾滲透壓濃度的方式除去紅細胞和用免疫親和層析法除去白細胞。該方法不僅成本低，而且高效地去除白細胞和紅細胞，從而使靶細胞得以富集，並易於後續檢測。本發明還提供一種從生物學樣品除去白細胞的方法，該方法包括採用抗CD45抗體偶聯的Affi-Gel 10除去白細胞。
文檔編號C12M1/12GK101469310SQ20071030741
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月28日 優先權日2007年12月28日
發明者趙海峰 申請人:北京百奧科生物技術有限公司