花側柏烷型倍半萜化合物及其製備方法和用途與流程

2023-09-17 02:21:35 2

本發明涉及醫藥
技術領域：
，涉及花側柏烷型倍半萜化合物及其製備方法和用途。具體涉及從百山祖冷杉（abiesbeshanzuensis）的樹皮中提取分離得到的兩個重排的花側柏烷型倍半萜新化合物及其製備方法。進一步經生物活性測試證明該類化合物具有顯著的抗流感甲型病毒（h3n2）抑制活性，可用於製備預防、延緩或治療甲型流感及其併發症和其他h3n2病毒介導的疾病的藥物。
背景技術：
：資料顯示，流行性感冒簡稱流感（influenza），是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。流感病毒（influenzavirus）屬於正粘病毒科（orthomyxoviridae），根據流感病毒內部核蛋白（nucleoprotein，np）和基質蛋白（matrixprotein，m1）的抗原性分為甲型（a），乙型（b），丙型（c）流感病毒，目前有報導提出存在丁（d）型流感病毒（collinetal.,j.virol.2015,89:1036–1042）；其中甲型流感病毒感染的範圍最廣，常以急性呼吸道傳染病的形式出現，可引起世界大流行,對人類健康危害最為嚴重(baigentetal.,bioessays2003,25:657–671)，另外，由於其潛伏期短，經呼吸道飛沫傳播，傳播迅速，抗原易發生變異，人群對變異株普遍易感，防控難度大。研究報導，h3n2是一種由粘病毒引起的嚴重的甲型流感病毒，可引起嚴重的呼吸系統疾病，通過多種動物的呼吸道傳播（狗，雞,鴨等），感染者多表現出普通流行性感冒的症狀，有時會出現腹瀉和嘔吐，重者繼發肺炎和呼吸衰竭，甚至死亡。h3n2亞型流感病毒自1968年引起流感大流行以來一直是人群中存在的主要甲型流感病毒亞型，其通過抗原漂移和抗原轉換逃避宿主的免疫識別，不斷引起新的流行，近幾十年來，全世界已經有數百萬人死於h3n2病毒引起的流感（rambautetal.,nature2008,453:615–619;johnsonetal.,bull.hist.med.2002,76:105–115）；另據報導，快速進化變異的甲型h3n2流感自產生後常年持續在人群中流行，每年季節性的暴發都造成全球大量的感染與死亡。實踐顯示，由於h3n2流感病毒的抗原變異能力強，加之個體免疫力的不同，有關疫苗的保護率並不高，並且h3n2病毒具有快速進化變異的特點，導致新型疫苗的研製常滯後於h3n2病毒變異的速度(bonhoefferetal.,vaccine2009,27:2289–2297)。目前用於預防和治療h3n2流感的藥物主要有金剛乙胺、奧司米韋和利巴韋林等，但是這些藥物不但具有嚴重的神經及消化系統的毒副作用，而且在逐漸使用過程中產生了耐藥性，引起新的h3n2流感病毒耐藥株出現。中醫藥治療h3n2流感病毒的藥物有蓮花清瘟膠囊、清開靈口服液、雙黃連注射液、藿香正氣丸，參麥注射液等清熱解毒，增強人體免疫力的中成藥，這些藥毒副作用少，耐藥性低，綜合療效較好,但是成分和靶點不明確，導致在市場上的應用前景較少。所以開發新的治療效果好、靶點明確、副作用小的抗h3n2流感病毒的藥物已迫在眉睫。天然產物具有結構複雜性和結構多樣性的特點，是新藥發現的重要來源。天然產物及其衍生物獨特的化學結構，使其具有高藥效和對特定靶點高選擇性的優點以及潛在的獨特的作用機制等優點（newman,etal.,nat.prod.rep.2000,17:215–34;newmanetal.,j.nat.prod.2012,75:311–335）。研究統計表明瀕危植物次生代謝產物的成藥性較高，是發現具有新穎結構和獨特作用機制的新藥物的重要來源，在國際上正引起高度重視（ibrahimetal.,proc.natl.acad.sci.usa.2013,110:16832–16837;zhuetal.,proc.natl.acad.sci.usa.2011,108:12943–12948）。百山祖冷杉（abiesbeshanzuensis）隸屬松科（pinaceae）冷杉屬（abies）植物，是一種常綠喬木，成年後高達30餘米，是我國特有的面臨瀕危滅絕的珍稀樹種之一，於1992年10月被列為國家珍稀樹種第一批一級保護樹種（fuetal.,chinaplantreddatabook,sciencepress:beijing;newyork,1992）；其天然僅分布於我國浙江省慶元縣百山祖南坡海拔1740m的山脊懸巖陡坡；1987年被國際自然保護聯盟（internationalunionforconservationofnature,iucn）列為全球最瀕危的12種植物之一。目前其化學成分和藥理活性尚未有任何報導。基於現有技術的現狀，本發明的申請人基於即能能保護性地採集少許百山祖冷杉植物樣品，又將會積極促進利用這一瀕危珍稀資源為人類服務；擬從百山祖冷杉樹皮中分離得到具有顯著的抗流感甲型病毒（h3n2）的活性的花側柏烷型倍半萜新化合物。技術實現要素：本發明目的是提供新的花側柏烷型倍半萜化合物及其製備方法和用途，具體涉及從百山祖冷杉（abiesbeshanzuensis）的樹皮中提取分離得到的兩個重排的花側柏烷型倍半萜新化合物；進一步經生物活性測試證明該類化合物具有顯著的抗流感甲型病毒（h3n2）抑制活性，可用於製備預防、延緩或治療甲型流感及其併發症和其他h3n2病毒介導的疾病的藥物。本發明的另一目的是提供該類化合物的製備方法。本發明的重排的花側柏烷型倍半萜化合物具有如下式（ⅰ）化學結構式：（ⅰ）本發明所述的化合物可通過從植物中分離純化得到；也可經本領域技術人員熟知的化學方法合成獲得。本發明的實施例中，所述的化合物通過下述提取分離方法製得，其包括步驟：乾燥粉碎的百山祖冷杉樹皮用甲醇室溫浸泡提取，提取液減壓回收溶劑，合併後得浸膏；浸膏用水分散後依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，得石油醚部分、乙酸乙酯部分和水溶性部分；乙酸乙酯部分經矽膠、sephadexlh-20及反相半製備hplc分離製備，得到化合物beshanzuenonea和beshanzuenoneb。本發明對所製得的倍半萜化合物進行了生物活性測試，結果表明，所述的化合物具有顯著的抗流感甲型病毒（h3n2）的活性，可進一步用於製備預防、延緩或治療甲型流感及其併發症和其他h3n2病毒介導的疾病的藥物。本發明所述的化合物可單獨應用或者合用，亦可與藥學上可接受的載體或賦形劑結合，按照常規方法製成口服或者非口服劑型。本發明具有如下優點：所述目標化合物beshanzuenonea和beshanzuenoneb為非常罕見的重排的花側柏烷型倍半萜新化合物，首次從自然界種子植物門中分離得到；該類化合物具有顯著的抗流感甲型病毒（h3n2）的活性，對甲型流感病毒導致的上呼吸道感染等症狀具有預防或治療應用前景。具體實施方式下面實施例對本發明作進一步闡述，但這些實施例絕非對本發明有任何限制。本領域技術人員在本說明書的啟示下對本發明實施中所作的任何變動都將落在權利要求書的範圍內。下述製備例中，比旋光測試通過jascop-1020旋光儀完成；紫外和紅外光譜數據分別通過shimadzuuv-2550紫外光譜儀和nicoletavatar360型紅外光譜儀獲得；nmr用brukeravanceii400型儀測定；lr-ms由agilent1100serieslc/msdg1946d型儀測定,hr-ms由absciextripletof5600型儀測定；所使用的矽膠和薄層板為煙臺康比諾公司生產，sephadexlh-20凝膠為瑞士gehealthcarebio-sciences公司生產；半製備hplc為waterse2695，配備2998pda和2424蒸發光散射雙檢測器以及sunfireods(5μm,250×10mm)半製備柱；所有試劑均為上海國藥集團化學試劑有限公司生產。實施例1：製備重排的花側柏烷型倍半萜新化合物取百山祖冷杉樹皮500g，粉碎後用90%甲醇室溫冷浸提取5次，合併提取液，減壓濃縮，得浸膏30g。浸膏用水分散後依次用石油醚與乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯部分12.0g。乙酸乙酯部分經100-200目矽膠柱層析，以石油醚：乙酸乙酯15:1-0:1及乙酸乙酯：甲醇15:1-0:1梯度洗脫，得到6個組分（fr.1-fr.6）；亞組分fr.3（613mg）以石油醚：乙酸乙酯5:1-0:1梯度洗脫，得到3個組分（fr.3a-3c），其中fr.3b經過半製備型hplc進一步分離，以45%甲醇和55%水等度洗脫（流速：3ml/min），分別得到化合物beshanzuenonea（3.5mg,tr=18.5min）和beshanzuenoneb（5.0mg,tr=21.5min）；化合物beshanzuenonea和beshanzuenoneb為重排的花側柏烷型倍半萜新化合物，它們的光譜及理化數據如下：beshanzuenonea:colorlessmonocliniccrystals(acetone-h2o,9:1);[α]d20–37(c0.04,meoh);uv(meoh)λmax(logε)226(0.92)nm;ecd(c1.5×10-3m,meoh),λmax(δε)214(+7.5),232(–10.3)nm;ir(kbr)νmax3426,2926,2882,2876,1726,1672,1652,1384,1261,1052,962,878cm−1;1hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.20(3h,s,me-12),1.27(3h,s,me-14),1.45(3h,s,me-13),1.91(2h,m,h2-5),2.31(1h,m,h-4b),2.43(1h,dd,j=18.0,6.0hz,h-1a),2.45(1h,m,h-4a),2.53(1h,dd,j=18.0,3.6hz,h-1b),3.94(1h,s,h-10),6.00(1h,s,h-8),6.95(1h,m,h-2).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ39.0(c-1),138.7(c-2),130.3(c-3),22.6(c-4),33.6(c-5),39.3(c-6),193.1(c-7),126.1(c-8),208.6(c-9),84.2(c-10),50.3(c-11),26.2(c-12),25.4(c-13),24.7(c-14),170.4(c-15);(+)esimsm/z265[m+h]+,287[m+na]+,(–)esimsm/z263[m–h]－;hresimsm/z265.1435[m+h]+(calcdforc15h21o4,265.1434,δ=0.3ppm).beshanzuenoneb:colorlessmonocliniccrystals(meoh-h2o,9:1);[α]d20+25(c0.05,meoh);uv(meoh)λmax(logε)223(1.17)nm;cd(c1.9×10-3m,meoh):λmax(δε)214(+60.3),238(–36.6)nm;ir(kbr)νmax3422,2926,2882,2876,1724,1676,1652,1384,1261,1052,962,862cm−1;1hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.14(3h,s,me-12),1.33(3h,s,me-14),1.48(3h,s,me-13),1.71(1h,m,h-5a),2.11(1h,m,h-5b),2.11(1h,m,h-4b),2.25(1h,brd,j=18.0hz,h-1a),2.35(1h,m,h-4a),2.70(1h,brd,j=18.0hz,h-1b),3.96(1h,s,h-10),5.94(1h,s,h-8),6.98(1h,brs,h-2).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ39.1(c-1),139.1(c-2),131.0(c-3),23.1(c-4),34.6(c-5),39.8(c-6),190.4(c-7),127.1(c-8),208.5(c-9),84.2(c-10),50.3(c-11),26.5(c-12),25.1(c-13),27.0(c-14),170.4(c-15);(+)esimsm/z265[m+h]+,287[m+na]+,(–)esimsm/z263[m–h]－;hresimsm/z265.1435[m+h]+(calcdforc15h21o4,265.1434,δ=0.3ppm).。實施例2：甲型流感病毒h3n2抑制活性測定細胞病變（cytopathiceffect,cpe）抑制試驗:狗腎（madin–darbycaninekidney,mdck）細胞按每毫升2.0x106個細胞的濃度接種於96孔培養板，每孔100µl，置37%、5%co2，培養24小時，形成細胞單層後，用不含血清的培養基（minimumessentialmedium,mem）液洗滌細胞2次，加入流感病毒液感染細胞2小時，然後換入對細胞最大無毒濃度（細胞活性＞＝95%時的濃度）以下的樣品稀釋液設置6個樣品濃度，分別為3.13,6.25,12.5,25.0,50.0和62.5µg/ml，再經72小時培養後，顯微鏡下觀察細胞病變（cpe），確定樣品對流感病毒的抑制作用。每個劑量藥物設6孔加入，實驗同時設細胞對照組，陽性藥物對照組及病毒對照組與實驗組同時觀察cpe。以發生cpe細胞比例表示cpe的程度，按以下6級標準判斷：細胞正常生長，無病變出現(－)；病變細胞少於整個細胞單層的10％(±)；病變細胞少於整個細胞單層的25％(+)；25％－50％細胞產生病變(++)；50％～75％細胞產生病變(+++)；75％－100％細胞產生病變(++++)。根據cpe的程度，採用reed－muench法計算，確定藥物半數有效濃度(ic50)，實驗重複三次，結果取三次的平均值；其中陽性對照利巴韋林（ribavirin）的ic50值為15.0µg/ml；測試結果表明上述兩個化合物均表現出顯著的抑制活性，表明本發明所述化合物可用於製備預防、延緩或治療甲型流感及其併發症和其他h3n2病毒介導的疾病的藥物。表1顯示了化合物beshanzuenonea和b抗流感病毒h3n2活性的ic50值。表1compoundic50(µg/ml)beshanzuenonea30.8±2.60beshanzuenoneb30.9±3.04ribavirin15.0±1.46當前第1頁12