Sj16重組蛋白及其在製備血吸蟲病疫苗、診斷試劑、治療藥物中的應用的製作方法

2023-09-17 05:40:30

專利名稱：Sj16重組蛋白及其在製備血吸蟲病疫苗、診斷試劑、治療藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物製劑，尤其是涉及SJ16蛋白在製備血吸蟲病疫苗、診斷試劑、治 療藥物中的應用。
背景技術：
血吸蟲病是危害人民身體健康最重要的寄生蟲病。醫藥業界普遍認為研製血吸蟲 疫苗可能是控制血吸蟲流行最終措施。血吸蟲疫苗的研究已有60多年的歷史，至今尚未找 到一種真正有價值的疫苗。其原因是多方面的，但人們對血吸蟲感染的保護性免疫機制及 血吸蟲逃避機體免疫攻擊的機制的認識不足可能是一個重要原因。現已有十餘個被公認有 前途的日本血吸蟲(中國大陸棟)亞單位候選抗原在國內獲得了克隆和表達.如，如穀胱 甘肽轉移酶、副肌球蛋白、脂肪酸結合蛋白和23ku膜蛋白等，但其中大多數候選疫苗分子 尚未達到所要求的等於或大於40%減蟲率的免疫保護力。血吸蟲病的早期診斷也是一個尚未解決的難題。感染血吸蟲1個月後，感染者的 糞便中才能檢測到蟲卵，而特異性抗體的出現時間一般在感染後1周左右，且針對抗原的 血清抗體在宿主體內長期存在，不能區分早期和既往感染，沒有療效考核價值。此外，目前 用於檢測特異性抗體的診斷抗原主要是成蟲抗原和蟲卵抗原，但這類抗原成分複雜，也不 易大量獲得。一般認為宿主體內(體液中)存在血吸蟲抗原，表明有活動性感染的可能，故 檢測宿主體內是否存在血吸蟲循環抗原，可用於血吸蟲病的診斷和療效。但循環抗原進入 血液系統後，以抗原抗體複合物的形式存在，降低了檢測的靈敏度，給診斷帶來了困難。特 別是慢性血吸蟲病患者感染度普遍偏低，血清和尿液中檢測循環抗原的陽性率較低。在慢 性血吸蟲病患者血清中，由於CAg不斷與血清抗體結合形成血吸蟲循環免疫複合物(CIC)， 故CAg含量較少。目前尚缺乏能實際應用的抗原檢測試劑。學者們也為解決血吸蟲病療效考核的方法問題作了大量研究。目前國內外在研究 短程抗體的檢測方面取得了較大進展，如用抗獨特型抗體，重組抗原，或用某些血吸蟲抗 原組分對抗體亞類進行檢測。但敏感性不及檢測總抗體者為高，故對其應用價值還有待於
進一步探索。綜上，尋求新的血吸蟲病疫苗候選分子和具有早期診斷價值的血吸蟲生物標誌物 是當前血吸蟲病診斷技術實現突破的關鍵。我們注意到，日本血吸蟲(S. japonicunOSjie 是蟲體分泌蛋白，其基因序列已被克隆，並建立了重組表達體系。但尚未有人對SJ16進行 在診斷和免疫預防中的價值的研究。

發明內容
本發明對SJ16蛋白在血吸蟲病診斷和免疫預防中的價值進行了研究，目的在於 提供一種含有活性成分的SJ16重組蛋白，並提供含有活性成分基因編碼所述的融合蛋白 的多核苷酸及該多核苷酸序列相應的核酸構建體系、表達載體和宿主細胞。
進一步的目的在於提供一種日本血吸蟲疫苗。再進一步的目的在於，將SJ16蛋白作為診斷抗原，製備克隆抗體，並由此提供一 種日本血吸蟲病診斷試劑及其使用方法。更進一步的目的在於，在此研究的基礎上提供治療日本血吸蟲病的藥物。具體的技術方案為一、關於SJ16重組蛋白及帶活性基因編碼的多核苷酸首先，我們對SJ16蛋白全長序列(SEQ ID NO 4)進行了分析，發現有2個核定位 序列肽段。分別將這兩個核定位序列肽段去除，或同時去除，得到了三個不同的活性成分片 段。SJ16在本發明中的作用，包括SJ16在日本血吸蟲在診斷方面的應用；SJ16蛋白的疫苗 活性成分；並發現SJ16蛋白，以及SJ16蛋白的前、中、後三個活性片段並優選其活性片段應 用於診斷和製備血吸蟲疫苗。在本發明中，對這三個活性片段分別命名為SJ16-l、SJ16-2、 SJ16-3(對應於 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，基因編碼見序列表)。在對全長的SJ16及三個活性片段進行了克隆表達和對小鼠的保護性實驗中，證 實了 SJ16蛋白及這些活性片段或它們的任意組合都能引起特異性免疫反應，對實驗動物 具有免疫保護作用。並跟據需要針對活性片段進行重組表達，希望得到更優質的活性蛋白。 通過實驗證明，在重組蛋白中，與SJ16蛋白或其活性片段具有70%以上的同一性的功能 性變體或這些功能性變體的組合物都具有較好的免疫保護作用，其中更優選的範圍是具有 80%以上的同一性的功能性變體或這些功能性變體的組合物。在對上述SJ16蛋白及其活性片段進行重組多肽的研究結果也表明，含SJ16蛋白 活性胺基酸片段的數量為10以上的多肽的免疫保護作用較好。在此研究的過程中，我們還提供了含有SJ16蛋白活性成分基因編碼所述的融合 蛋白的多核苷酸及該多核苷酸序列相應的核酸構建體系、表達載體和宿主細胞。二、應用於製備日本血吸蟲病疫苗居於上述第一點研究的基礎上，我們將上述活性物質應用於製備預防日本血吸蟲 的疫苗。該疫苗包含上述所提及的重組蛋白作為活性成分。即該疫苗的蛋白組成多肽序列 包含SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段SEQ ID NO :1或SEQID NO :2或SEQ ID NO 3序列 其中的一種或幾種。或包含與SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段具有70%以上的同一性的 功能性變體中的一種或幾種。三、應用於製備日本血吸蟲病診斷試劑在血吸蟲感染過程中，由於SJ16蛋白參與了免疫逃避，在患者體內不引起強烈的 免疫應答。SJ16蛋白主要以游離形式存在，因此，我們認為可以通過對SJ16的檢測來區分 既往感染或現行感染；並可以達到很高的靈敏度。通過動物感染實驗也證實了這一點，感染 1天後，即可檢測到血清中SJ16，比檢測特異性抗體的時間明顯提前，因此認為以SJ16蛋白 作為診斷抗原，其檢測特異性抗體的靈敏度明顯高於現有的診斷抗原，並具有早期診斷價 值。具體方案為，以SJ16蛋白活性成份作為診斷抗原，通過抗體克隆技術得到對應的 克隆抗體作為診斷試劑，檢測到血清中SJ16蛋白。使用方法為將生物樣品與克隆抗體接 觸，並檢測是否產生免疫反應，從而判斷是否感染。四、應用於製備日本血吸蟲病的治療藥物
在本發明的研究過程中，我們觀察到，所涉及的這些活性蛋白及多肽片段有減蟲 和減卵的作用；可以用於製備治療日本血吸蟲病的藥物。即該藥物由SJ16蛋白、其活性片 段或其同一性為70%以上的功能性變體製備。本發明與現有技術相比，有以下優點和創新第一，本發明首次提出將SJ16蛋白應用於血吸蟲病診斷，製備診斷試劑。該方法 不但可以區分血吸蟲的既往或現行感染，且檢測靈敏度高，具有確切的早期診斷價值。第二，本發明首次提出將SJ16應用於血吸蟲病的疫苗製備及治療藥物製備。第三，本發明提供的新型免疫抑制劑來源於病原體生物資源，具有極其廣闊的市 場空間和較好的社會、經濟效益。
具體實施例方式實施例1根據日本血吸蟲SJ16基因序列設計引物，經PCRDESIGN軟體分析，由上海生工生 物工程公司合成，引物Pl為5，GCCATATGAACATGACTTTAATTAAC，引入NdeI酶切位點；引物P2 為 5，ACTTAATACTTTGTAGAATTCGAACCjIA HindIII 酶切位點。擴增出全長 SJ16 基因。實施例2SJ16全長的表達和鑑定及純化利用所設計的一對引物(P1、P2)成功擴增。將其克隆到PGEX-4T-1載體上，挑 取篩選到的pGEX-4T-l-Sjl6-l重組質粒的DNA，以其為模板，用Pl、P2引物進行PCR擴增 獲取的特異性條帶；雙酶切驗證其大小與預期序列一致；將所篩選的重組質粒送TaKaRa 公司測序，測序結果無誤。獲得的重組質粒確實為pGEX-4T-l-Sjl6-l重組質粒。將 PGEX-4T-1-SJ16-1重組質粒轉化的工程菌經IPTG誘導表達後，15% SDS-PAGE電泳顯示在 分子量約46kDa處出現一明顯蛋白條帶，而空質粒轉化菌在誘導前後以及重組質粒工程菌 在誘導前後均無此條帶的出現，表明此蛋白條帶可能為目的蛋白條帶。菌體裂解上清上亦 有此蛋白條帶的出現，顯示該蛋白為可溶性表達。將裂解上清經過GST親和層析柱，經過 thrombin酶酶切以後，可以得到分子量為19kDa左右的單一蛋白。pGEX-4T BL21轉化菌經誘導後出現一分子量約為26kDa明顯表達帶，此為GST蛋 白。pGEX-4T-l轉化的BL 21-DE3菌經IPTG誘導後，較誘導前於約40Da出現一條明顯的融 合蛋白表達條帶。免疫印跡分析，該蛋白能特異地被抗GST抗體(1 500稀釋)識別，於 約40Da位置有一條條帶，pGEX24T-l轉化菌經誘導於約26kDa處有一條條帶為pGEX_4T_l 轉化菌經誘導表達GST蛋白能特異地被抗GST抗體識別。ST柱親和層析純化。實施例3SJ16-1、SJ16-2、Sj 16-3 的表達和鑑定。根據SJ16-1的蛋白序列直接合成相應的DNA序列，命名為SJ16-1序列。根據 SJ16-2、SJ16-3之間引入柔性臂(-GGAGGA-)，使SJ16-2、SJ16-3融合；再根據其蛋白序列設 計相應的核酸序列。分別將其克隆到PGEX-4T-1載體上，挑取篩選到的pGEX-4T-l-Sjl6-l、 pGEX-4T-l-Sjl6-2、pGEX-4T-l-Sjl6_3重組質粒的DNA,以其為模板，用相應引物進 行PCR擴增獲取的特異性條帶；雙酶切驗證其大小與預期序列一致；將所篩選的重組 質粒送TaKaRa公司測序，測序結果無誤。獲得的重組質粒確實為pGEX_4T_ 1 -Sj 16-1、pGEX-4T-l-Sj 16-2-3 重組質粒。將 pGEX_4T-l-Sjl6-l、pGEX-4T-l_Sj 16-2-3 重組質粒轉化 的工程菌經IPTG誘導表達後，15% SDS-PAGE電泳顯示其分別在分子量約40kDa、84kDa處 出現一明顯蛋白條帶，而空質粒轉化菌在誘導前後以及重組質粒工程菌在誘導前後均無此 條帶的出現，表明此蛋白條帶可能為目的蛋白條帶。菌體裂解上清上亦有此蛋白條帶的出 現，顯示該蛋白為可溶性表達。將裂解上清經過GST親和層析柱，經過thrombin酶酶切以 後，可以得到分子量為14kDa、36kDa左右的單一蛋白pGEX-4T-l轉化的BL21-D E3菌經IPTG誘導後，較誘導前於約40kDa、84kDa出現 一條明顯的融合蛋白表達條帶。免疫印跡分析，該蛋白能特異地被抗GST抗體(1 500稀 釋)識別，於約40kDa、84kDa位置有一條條帶，pGEX24T 21轉化菌經誘導於約26kDa處有 一條條帶為PGEX-4T-1轉化菌經誘導表達GST蛋白能特異地被抗GST抗體識別。GST柱親 和層析純化。實施例4SJ16單克隆抗體的製備純化SJ16抗原50 μ g加福氏完全佐劑皮下多點注射純種BALB/C小鼠免疫3_4次， 末次加強免疫3天後，取脾融合；取108脾淋巴細胞懸液備用。取對數生長骨髓瘤細胞離 心；取得X107細胞備用。選用小鼠腹腔巨噬細胞製備飼養細胞層，調整細胞數至1X105/ ml備用。進行細胞融合。將骨髓瘤細胞與脾細胞按1 10比例混合，用無血清不完全培養 液洗1次；90s內加入37°C預溫的Iml 45% PEG(分子量4000)溶液，。37°C水浴作用90s ； 加37度預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入lml、2ml、3ml、4ml、5ml 和6ml ；離心，去上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養液重懸。將上述細胞，加到已有飼養 細胞層的96孔板內，每孔加100μ 1。培養板置37°C、5% C02培養箱中培養。用SJ16蛋白進行ELISA檢測，篩選出陽性雜交瘤細胞。篩選出的陽性細胞株進行 單克隆抗體製備。實施例5製備SJ16單克隆抗體，然後以SJ16單克隆抗體用ELISA方法檢測感染血吸蟲動 物血清；平行實驗對照為M r 31 000/32 000抗原單克隆抗體。以血吸蟲尾蚴免疫小鼠， 每組動物各8隻，感染45天後殺鼠取的血清，SJ16單克隆抗體ELISA檢測，陽性檢出率為 92. 1% ；M r 31 000/32 000抗原單克隆抗體檢出率52. 3%，無假陽，無交叉。SJ16單克隆抗體檢出靈敏度和特異性比M r 31 000/32 000高。兩者相比有統計 學意義。實施例6SJ16-1核酸疫苗保護實驗構建了 DNA疫苗SJ16-1，並且加不同的佐劑用肌肉注射法分別免疫昆明鼠及 BALB/c小鼠，與對照組相比，裸露DNA誘導小鼠產生了 Sjl6-1特異性抗體，並對日本血吸蟲 的攻擊感染顯示了一定的保護效果。成蟲減少率為45.7%，肝卵EPG減少率為40. 1%，腸 卵減少率為37. 4%，肝臟表面結節也明顯的減少，統計學分析有顯著性意義。實施例7SJ16-1、SJ16-2、Sj 16-3 蛋白疫苗保護實驗
重組蛋白Sjl6-1、Sj 16-2, Sjl6_3分別與等量FCA混合，皮下注射免疫BALB/c 小鼠(以FCA作對照)，與PBS注射對照組相比，免疫組減蟲率達42.9%，肝卵減少率為 44.9%，腸卵減少率為40.3%。統計學上差異有顯著性。上述結果提示Sjl6-1、Sjl6-2、 Sjl6-3蛋白可誘導小鼠產生明顯的抗日本血吸蟲攻擊感染的保護力。實施例8:SJ16蛋白功能性變體疫苗保護實驗通過序列分析，將SJ16-1定點突變，得到新的功能性變體，其序列MK VTPIIF AVFCVVGGMTLITGTTLEQGPHPSEKDMELVYIDAEYEKE AGLKSICNEIKRSFREDLGM KM LDVAKI L。通過定點技術，得到相應 的核酸序列，並重組克隆到pET-32a載體，構建了重組蛋白SJ16-lt。將重組蛋白Sjl6_lt 與等量FCA混合，皮下注射免疫BALB/c小鼠(以FCA作對照)，與PBS注射對照組相比，免 疫組減蟲率達44. 9%，肝卵減少率為50. 2%，腸卵減少率為43. 3%。統計學上差異有顯著 性。上述結果提示Sjl6-lt蛋白可誘導小鼠產生明顯的抗日本血吸蟲攻擊感染的保護力。
權利要求
一種SJ16重組蛋白，其特徵在於該蛋白組成多肽序列包含SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或SEQ ID NO3序列或與上述蛋白具有70％以上同一性的功能性變體中的一種或幾種。
2.如權利要求1所述的重組蛋白，其特徵在於所述功能性變體的同一性為80%以上。
3.—種重組多肽，其特徵在於該重組多肽包含權利要求1所述的任一蛋白胺基酸片 段的數量為10以上。
4.一種多核苷酸，其特徵在於該核苷酸包含權利要求1所述的任何一種蛋白的核酸 序列。
5.一種如權利要求4所述的多核苷酸的載體，其特徵在於該載體含有權利要求4所 述的核酸序列。
6.一種抗體，其特徵在於該抗體由權利要求1所述的重組蛋白製備。
7.權利要求1所述的重組蛋白在製備血吸蟲病診斷試劑中的應用，該診斷試劑包括權 利要求6所述的抗體。
8.權利要求1所述的重組蛋白在製備血吸蟲病疫苗中的應用，該疫苗由權利要求1所 述的重組蛋白製備。
9.權利要求1所述的重組蛋白在製備治療血吸蟲病藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一系列SJ16重組蛋白及其在製備血吸蟲病疫苗、診斷試劑、治療藥物中的應用技術。包括由SJ16蛋白分離得到活性片段SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3，通過蛋白重組得到系列同一性70％以上的功能性變體。進一步將上述蛋白應用於製備血吸蟲病疫苗、診斷試劑、治療藥物。本發明是首次提出將SJ16蛋白應用於血吸蟲病診斷製備診斷試劑，該方法不但可以區分血吸蟲的既往或現行感染，且檢測靈敏度高，具有確切的早期診斷價值。也是首次提出將SJ16應用於血吸蟲病的疫苗和治療藥物的製備。而且，本發明提供的新型免疫抑制劑來源於病原體生物資源，具有極其廣闊的市場空間和較好的社會、經濟效益。
文檔編號A61K39/00GK101985468SQ20101050178
公開日2011年3月16日 申請日期2010年9月30日 優先權日2010年9月30日
發明者劉靈輝, 卞國武, 呂志躍, 吳忠道, 孫希, 楊琳琳, 胡少敏, 阮志燕 申請人:中山大學