一種植物乳桿菌D‑乳酸脫氫酶、其編碼基因及應用的製作方法

2023-09-17 00:18:40

本發明屬於基因工程領域，涉及植物乳桿菌的d-乳酸脫氫酶基因、含有該基因的工程菌及其應用。

背景技術：

苯乳酸(phenyllacticacid，pla)，也稱3-苯基乳酸或β-苯乳酸，即2-羥基-3-苯基丙酸，是近年來發現的新型天然防腐劑。苯乳酸抑菌譜寬，不僅能夠抑制多種食源性致病菌，而且對引起食品腐敗的真菌具有廣泛的作用。此外，苯乳酸安全無毒，有望開發成一種新型生物防腐劑應用於食品工業。它的溶解性好，易於在食品體系中擴散；穩定性高，具有寬廣的ph範圍和熱穩定性，在食品工業中具有廣闊的應用前景，可應用於醫藥與化妝品行業。苯乳酸具有d-苯基乳酸和l-苯基乳酸兩種構型，研究表明，d-苯乳酸的抑菌能力高於l-苯乳酸。

微生物是各種酶的重要來源。通過從環境中篩選分離產酶微生物，利用分子克隆技術從產酶微生物中克隆產酶基因，再將其與合適的載體連接並轉入相應宿主細胞，可進行酶的大量表達。目前，通過基因工程技術手段進行生產酶，已經成為工業用酶的主導。

乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenae，ldh)廣泛存在於多種生物體內，在高等動物體內只有l-乳酸脫氫酶，而在很多細菌內包括乳酸菌內(例如植物乳桿菌)有兩種乳酸脫氫酶，d-乳酸脫氫酶(d-ldh，ec：1.1.1.28)和l-乳酸脫氫酶(l-ldh，ec：1.1.1.27)。這兩種酶能分別催化苯丙酮酸生成d-苯乳酸與l-苯乳酸。

技術實現要素：

本發明的目的是針對植物乳桿菌乳酸脫氫酶在微生物體內的表達受到嚴格調控而致使胞內乳酸脫氫酶含量較低，限制了苯乳酸產量的問題，提供一種植物乳桿菌的d-乳酸脫氫酶。

本發明的另一目的是提供編碼該植物乳桿菌d-乳酸脫氫酶的基因、含有該基因的重組質粒和基因工程菌。

本發明的又一目的是提供該植物乳桿菌d-乳酸脫氫酶的應用。利用基因工程技術獲得高效表達乳酸脫氫酶的工程菌從而提高苯基乳酸產量，開拓苯乳酸在食品與藥品行業的應用前景。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

一種植物乳桿菌d-乳酸脫氫酶，其胺基酸序列為：seqidno.2。

編碼所述植物乳桿菌d-乳酸脫氫酶的核苷酸序列為seqidno.1。該基因全長(從起始密碼子到終止密碼子)為999bp，g+c含量為42.14％，編碼332個胺基酸。

一種重組質粒，該重組質粒是含有上述的植物乳桿菌d-乳酸脫氫酶基因，其載體選用pet-28a(+)質粒。

一種基因工程菌，所述基因工程菌含有上述的植物乳桿菌d-乳酸脫氫酶基因。

所述的基因工程菌的構建方法，包括如下步驟：

(1)利用pet-28a(+)質粒連接植物乳桿菌d-乳酸脫氫酶基因，構建重組質粒；

(2將重組質粒轉化到表達宿主菌e.colibl21(de3)，獲得重組菌；

(3)將所獲得的重組菌轉接到含有50mg/l卡那黴素的平板上，37℃培養12h後，挑取單菌落進行菌落pcr，以及雙酶切驗證，最後經測序驗證基因序列無誤後，保存。

本發明通過對致病性菌株(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、李斯特菌等)的抑菌試驗成功篩選到一株高效抑制致病菌生長的植物乳桿菌菌株，並克隆出d-乳酸脫氫酶基因，該基因表達的產物d-乳酸脫氫酶，能高效的催化苯丙酮酸生產苯乳酸。利用該基因構建的工程菌株能高效表達d-乳酸脫氫酶，該脫氫酶還可以作用於丙酮酸等其它酮類化合物，生產的酶製劑可用於食品加工、醫藥和化工等行業。利用該植物乳桿菌d-乳酸脫氫酶的基因構建的基因工程菌生產的苯乳酸有望開發成一種新型生物防腐劑應用於食品工業，苯乳酸作為丹參素替代品，還可用於冠心病的治療以及合成抗hiv試劑，在醫藥、食品保存、化工行業具有廣闊的應用前景，不僅可以解決化學防腐劑帶來的環境汙染問題，還可以取得可觀的經濟效益。

附圖說明

圖1d-乳酸脫氫酶基因克隆的策略圖。

圖2d-乳酸脫氫酶基因在e.colibl21(pet-29a(+))中高效表達方法流程圖。

具體實施方式

實施例1.高產苯乳酸菌株的篩選

1.1乳酸菌菌種分離、純化

取不同果汁液5ml接種於mrs液體培養基(蛋白腖10g/l，牛肉浸粉8g/l，葡萄糖20g/l，k2hpo41.5g/l，乙酸鈉5g/l，檸檬酸二胺2g/l，mgso4·7h2o0.58g/l，mnso4.4h2o0.2g/l，吐溫801ml/l，酵母粉4g/l，ph6.5)。37℃培養24h進行富集。梯度稀釋，取0.lml適當稀釋度的菌液倒平板，30℃培養24-48h。挑取有透明圈的單菌落劃線，反覆劃線三次。挑取單菌落轉接斜面，培養18-24h後4℃保存備用。

1.2菌種初篩、復篩

取不同果汁液5ml接種於mrs液體培養基中(蛋白腖10g/l，牛肉浸粉8g/l，葡萄糖20g/l，k2hpo41.5g/l，乙酸鈉5g/l，檸檬酸二胺2g/l，mgso4·7h2o0.58g/l，mnso4·4h2o0.2g/l，吐溫801ml/l，酵母粉4g/l，ph6.5)，30℃培養24h進行富集。取0.1ml適當稀釋度的菌液倒平板(內含3％碳酸鈣)，30℃培養18-24h。挑取有碳酸鈣溶解圈的單菌落劃線純化並鏡檢。

1.3牛津杯法測定篩選菌的抑菌活力

將上述步驟所篩選得到的數株乳酸菌接種至最適mrs液體培養基中(蛋白腖10g/l，牛肉浸粉8g/l，葡萄糖20g/l，k2hpo41.5g/l，乙酸鈉5g/l，檸檬酸二胺2g/l，mgso4·7h2o0.58g/l，mnso4·4h2o0.2g/l，吐溫801ml/l，酵母粉4g/l，ph6.5)，在最適溫度37℃下，靜止培養24h，於沸水浴中滅菌15min，然後在8000rpm條件下離心20min，取上清液做抑菌試驗。

將指示菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、李斯特菌)生長培養基(蛋白腖10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，ph7.0)倒入直徑9cm的培養皿中，每皿15ml，待冷卻凝固後加入0.2ml指示菌懸液，l棒塗勻，待乾燥後用無菌鑷子放置牛津杯(內徑6.0±0.1mm，高8.0±0.1mm)。靜置20min後取發酵上清液0.lml加入牛津杯內。小心放入培養箱，使發酵液充分擴散到培養基中，37℃培養48h，使用遊標卡尺測量抑菌圈直徑。每組做3個重複。

1.4高效液相色譜檢測苯乳酸含量

將初篩獲得的乳酸菌接種mrs液體培養基(蛋白腖10g/l，牛肉浸粉8g/l，葡萄糖20g/l，k2hpo41.5g/l，乙酸鈉5g/l，檸檬酸二胺2g/l，mgso4·7h2o0.58g/l，mnso4·4h2o0.2g/l，吐溫801ml/l，酵母粉4g/l，ph6.5)，30℃培養72h後檢測發酵液中的苯乳酸含量，得到高產菌株4℃保存備用。經過16srdna鑑定，確定高產菌株屬於植物乳桿菌屬lactobacillusplantarum。

實施例2d-乳酸脫氫酶基因的克隆

2.1植物乳桿菌菌體總dna的提取

採用高鹽法提取實施例1獲取的苯乳酸高產菌株的染色體總dna：挑取苯乳酸高產菌株單菌落接種於3mllb液體培養基中，30℃、180rpm培養至od600nm≈1.0，12000rpm離心收集菌體；用1.0mlte緩衝液(10mmol/ltris·cl(ph8.0)，1mmol/ledta，ph8.0)重懸洗滌菌體，10000rpm離心5min收集菌體，加入1.0mlten緩衝液(10mmol/ltris·cl(ph8.0)，1mmol/ledta，0.1mol/lnaclph8.0)懸浮菌體，加入5μl的溶菌酶(100mg/ml)，37℃水浴1h，加入25-50μl20％sds和5μl蛋白酶k(20mg/ml)，65℃水浴2h，待液體澄清後，加入340μl飽和nacl溶液劇烈震蕩，12000rpm離心10min，將上清液轉移至無菌潔淨eppendorf管中，用等體積的酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)抽提至界面澄清無白色固體物為止，轉移上清液於另一無菌潔淨eppendort管中，加入0.6倍體積的異丙醇，-20℃放置0.5-1h沉澱dna，12000rpm離心10min，去除上清後用70％乙醇洗滌2次，待乙醇揮發後加入30μl無菌水或ter，放置4℃冰箱過夜溶解，短期4℃保存，長期採用-20℃凍存。

2.2植物乳桿菌d-乳酸脫氫酶基因的pcr擴增

簡併引物是指代表編碼單個胺基酸所有不同鹼基可能性的不同序列的混合物。密碼子具有簡併性，單以胺基酸順序推測編碼的dna序列是不精確的，但可以設計成對簡併引物，擴增所有編碼已知順序的核酸序列。我們根據ncbi上的植物乳桿菌d-乳酸脫氫酶orf，比對出d-乳酸脫氫酶3』端存在3個可能的突變位點，因此根據其位置設計一對簡併引物(其中r＝a/g，y＝c/t，m＝a/c，k＝g/t，s＝c/g，w＝a/t，h＝a/c/t，b＝c/g/t，v＝a/c/g，d＝a/g/t，n＝a/c/g/t)。

根據植物乳桿菌d-乳酸脫氫酶設計引物如下：

上遊引物p1：5』-tgggtcgcggatccgaattcatgaaaattattgcatatgctgt-3』(seqidno.3)帶有ecori酶切位點，

下遊引物p2：5』-gtggtggtggtgctcgagttartcaaacttaacttgygtr-3』(seqidno.4)帶有一個xhoi酶切位點，用於擴增植物乳桿菌脫氫酶基因。引物p2序列中，r、y所在的位點為比對出的3個可能的突變位點。

以提取的植物乳桿菌全基因組為模板，利用梯度pcr儀探索d-乳酸脫氫酶的最佳退火溫度，利用引物p1和p2對植物乳桿菌d-乳酸脫氫酶基因中包含xhoi酶切位點和ecori酶切位點在內的片段進行擴增。

擴增體系：

pcr擴增程序：

a.94℃變性10min，48℃-55℃退火45sec，72℃延伸1min，進行30個循環；

b.72℃延伸10min；

c.4℃冷卻10min。

2.3限制性內切酶xhoi酶和ecori酶雙酶切質粒載體pet-28a(+)體系如下：

質粒10μl

10×bufferh5μl

xhoi1.5μl

ecori1.5μl

雙蒸水至50μl，

37℃酶切2h。加入3μl10×loadingbuffer終止酶切反應。酶切產物經0.75％瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收酶切質粒片段。回收按照試劑盒說明書進行。

2.4d-乳酸脫氫酶目的基因片段與酶切質粒pet-28a(+)(xhoi/ecori)的連接。

一步克隆反應體系(冰上配)：

37℃反應30min。

2.5酶連產物的轉化與陽性克隆的篩選

將20μl酶連產物加入到200μl在冰上融化後的e.colidh5α感受態細胞中，冰浴30min，在42℃水浴鍋中熱激90s後。快速轉移到冰浴中冷卻1～2min，向每管中加入800μl液體lb培養基，37℃搖床80-90rpm溫育45min，復甦細胞。4000rpm離心3min，剩餘200μl感受態細胞塗布於含100mg/l卡那黴素的lb瓊脂平板上，平板倒置於37℃培養箱培養，12-16h後出現單菌落。挑單菌落轉點標記序號同時進行菌落pcr，待菌落pcr驗證正確後，將驗證成功的單菌落接種於5mllb液體試管，待長出菌懸液後提質粒並進行雙酶切驗證。

2.6陽性克隆子質粒的提取與測序

將2.5中篩選得到的陽性克隆子在含卡那黴素的lb培養基中培養過夜，12000rpm離心10min收集菌體，利用質粒提取試劑盒提取重組質粒，送上海捷瑞生物工程有限公司測序。

實施例3.d-乳酸脫氫酶基因在e.colibl21(pet-28a(+))中的高效表達

d-乳酸脫氫酶基因表達流程如圖2所示。

3.1將2.6中提取的重組質粒用ecori和xhoi雙酶切

酶切體系：

在37℃水浴中，反應3h以上。酶切產物進行0.75％的瓊脂糖凝膠電泳切膠回收。

3.2pet-28a(+)(merck-novagen，catno.69871)用ecori和xhoi雙酶切。

3.3轉化和表達

3.1中的回收片段和3.2中酶切好的pet-28a(+)進行酶連得含d-乳酸脫氫酶基因的pet-28a(+)重組質粒。

酶連好的含d-乳酸脫氫酶基因的pet-28a(+)重組質粒轉化到表達宿主菌e.colibl21(de3)(nbe，catno.c2527h)獲得重組菌，塗布含有50mg/l卡那黴素和24mg/liptg的平板，經37℃培養16-20h後，挑取單菌落轉點進行菌落pcr，經測序驗證基因序列無誤。

3.4驗證陽性轉化子表達的酶對苯丙酮酸的催化功能

3.3中得到的陽性克隆子在lb培養基中37c培養至od600nm在0.5-0.6之間，加iptg至濃度0.2mm，18℃繼續培養24h。收集菌體用磷酸緩衝液(ph6.2)重懸後，用超聲處理破碎菌體細胞，20000g離心15min，所得上清即為d-乳酸脫氫酶粗酶液。取50μld-乳酸脫氫酶粗酶液加至2ml含有20mm苯丙酮酸、0.2mmnadh的磷酸緩衝液中，於30℃反應2h後，用高效液相色譜檢測產物苯乳酸的含量。

由於d-乳酸脫氫酶催化苯丙酮酸產苯乳酸需要還原力的參與，因此反應體系裡需要添加一定量的輔酶因子nadh。根據輔酶nadh在340nm吸光值的減小速度來定義酶活。酶活測定溫度30℃，3.0ml的反應體系：ph6.5100mm磷酸鉀緩衝液，含0.6μmolnadh，2.27μmol的丙酮酸或19.6μmol苯丙酮酸及適當的酶液。空白中不含nadh。苯丙酮酸每次試驗現配。每分鐘減少1μmol的ndah所用的酶量為一個酶活單位。比活力定義為：每毫克酶蛋白所含的酶活單位(u/mg)。測得粗酶的比活力為1.3μmol/min/mg，即1mg該粗酶以苯丙酮酸為底物在最適條件下反應每分鐘可消耗1.3μmolnadh。後將該酶通過ni-nta親和層析純化並經超濾濃縮後測得該酶在以苯丙酮酸為底物時的比活力為50μmol/min/mg，即1mg純酶在苯丙酮酸為底物時每分鐘消耗30μmolnadh。該結果表明純化濃縮後的比酶活力約為粗酶的38倍。經液相結果檢測，酶催化苯丙酮酸產苯乳酸轉化率達到100％，全細胞催化苯丙酮酸產苯乳酸產量達到3.2g/l,轉化率達到了73％。

序列表

南京工業大學

一種植物乳桿菌d-乳酸脫氫酶、其編碼基因及應用

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dna

lacticdehydrogenasevirus

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