載脂蛋白a-1模擬肽以及包含其的用於治療高血脂及高血脂相關疾病的治療劑的製作方法

2023-09-21 07:49:10

專利名稱：載脂蛋白a-1模擬肽以及包含其的用於治療高血脂及高血脂相關疾病的治療劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及載脂蛋白A-I(Ap0-I)模擬肽，以及包含其的用於治療高血脂的治療劑。
背景技術：
高血脂是一種過量脂肪物質在血液中循環且可能在動脈壁中堆積從而引起炎性反應並導致心血管疾病的病症。高血脂的定義為，血脂中的任一項如膽固醇、甘油三酯、磷脂及游離脂肪酸，其濃度高於健康空腹下的範圍。健康空腹下的甘油三酯水平為50-150mg/dl、磷脂為150-250mg/dl、膽固醇為130_230mg/dl、游離脂肪酸為5-10mg/ml。如果不注意，高血脂可能增加嚴重併發症的風險，如高血壓、動脈粥樣硬化(心絞痛、心肌梗塞)以及腦動脈硬化(腦梗塞)。低密度脂蛋白(LDL)的增加是一個獨立的高血脂風險因素。LDL是將肝臟或腸道中的膽固醇運輸到組織的分子之一。LDL同樣被認為是「有害膽固醇」。因為LDL含有高水平的膽固醇，當血流中LDL水平增加時，其可能在動脈壁堆積，導致冠狀動脈疾病和心臟病發作風險增加。因此，已開發幾類可以降低LDL水平的治療劑，用於治療高血脂及相關疾病。然而，近期研究表明，增加高密度脂蛋白(HDL)水平比降低LDL水平對治療高血脂具有更大的作用。因此，正在開發旨在增加HDL水平的藥物。高密度脂蛋白(HDL)由靠近毛細血管的巨噬細胞釋放的膽固醇或膽固醇酯與血流中的載脂蛋白A-I (Apo-I)聚集而產生。與LDL不同，HDL帶走組織中的膽固醇並在血流中將其運送至肝臟而被吸收或降解。因此，當重複此過程時，位於毛細血管附近的巨噬細胞中的膽固醇水平將降低，從而導致動脈巨噬細胞尺寸減小和血管擴張。當通過在血流中增加HDL水平而激活了逆向的膽固醇運輸時，這將具有降低血流或巨噬細胞中血膽固醇水平的作用。因此，血清HDL濃度的增加可以作為治療患者高血脂或冠狀動脈疾病的一個重要因素。直到最近，僅發現了兩個可以增加HDL的靶標。一個是ApoA-1，其有助於釋放自巨噬細胞的膽固醇或膽固醇酯的聚集。Apo A-I蛋白由幾個a-螺旋形成，它們圍繞在不穩定的膽固醇沉積外部以使其穩定成為HDL。因此，如果模擬Apo A-I的化合物存在於血液中，這可以增加血液中HDL的特性。已經在一期和進一步的臨床試驗中證明模擬Apo A-I的兩類肽具有治療作用。另一個靶標蛋白為膽固醇酯轉移蛋白(CETP)。該蛋白誘導HDL向LDL轉化。因此，大型製藥公司如輝瑞(Pfizer)和默克(Merck)已經開發了可以抑制該蛋白功能的CETP抑制劑。然而，輝瑞製藥的主要CETP抑制劑託徹普(Torcetrapib)卻在2006年的臨床試驗中失敗。這提高了人們對CETP抑制劑除了阻斷HDL向LDL轉化以外可能的副作用的關注，也喪失了其作為靶向增加HDL的治療劑的潛能。CETP抑制劑失敗之後，Apo A-I蛋白及其模擬肽作為增加HDL水平的靶標和藥物引起了人們的興趣。已完成一期臨床試驗的兩種模擬Apo A-I蛋白的候選藥物為模擬部分Apo A-I蛋白的ApoA-Iniilan。蛋白以及與Apo A-I具有不同的胺基酸序列但易於形成a螺旋的兩親肽D-4F。這些化合物在2007年底分別進入三期和二期的臨床試驗。D-4F由形成a -螺旋形狀的18個D-胺基酸組成，並已開發用於口服給藥。在親水面中，半數胺基酸為帶正電荷的賴氨酸，其餘為帶負電荷的穀氨酸或天冬氨酸。當此肽形成a -螺旋時，通過與它們的肽的正負電荷相互作用形成大分子，其它肽分子可形成多層結構(layers)。分子組裝體(molecular assembly)的產生是通過將用作圍欄(fence)的單個亞單位的a-螺旋肽排列形成圍欄。分子識別的過程猶如是在膽固醇的周圍形成圍欄。因此，該肽親水面帶正、負電荷的胺基酸殘基被認為具有重要的作用。已有一些實驗通過改變帶正、負電荷的胺基酸殘基的位置來改善D-4F的親水部分。但是，尚未見效果優於D-4F的肽的報導。此外，尚未有採用人工胺基酸修飾D-4F來改善D-4F的嘗試。然而，位於D-4F肽親水面的4個苯基丙氨酸殘基直接與膽固醇相互作用，因此苯基丙氨酸的位置和形狀是非常重要的。早於D-4F合成的4F(由18個L-胺基酸組成)肽表明苯基丙氨酸數量和位置的重要性。當苯基丙氨酸的數量多於或少於4個時，肽的功能·下降。人們認為，苯基丙氨酸通常涉及到疏水性分子膽固醇或膽固醇酯的識別。但是，尚未有利用更加複雜的芳香族胺基酸或人工芳香族胺基酸代替簡單的苯基丙氨酸基團以改善4F原料的嘗試。本發明人已經進行了深入的研究以開發一種可以通過增加HDL來治療高血脂及相關疾病的比現有肽更有效的肽。結果，通過採用非天然胺基酸而非眾所周知天然形成的胺基酸來修飾4F[包含4個結合了 Apo A-I類脂質(Apo A-1 like lipids)的苯基丙氨酸(F)的兩親性a螺旋肽]的親水面和疏水面，本發明人建立了肽庫。通過篩選此肽庫，本發明人證實了 Apo A-I模擬肽在膽固醇外流能力和疏水分子識別上具有優異的功能，因此，通過有效地向肝臟運輸膽固醇用以排洩其可以作為治療高血脂及相關疾病的有效治療劑，由此完成了本發明。

發明內容
技術問題本發明的一個目的是提供載脂蛋白A-I(Apo-I)模擬肽，以及包含其的用於治療聞血脂的治療劑。技術方案為實現所述目的，本發明提供一種兩親肽庫，其包含在兩親a -螺旋肽一側含有
3-8個苯基丙氨酸(F)的兩親肽序列，其中親水性胺基酸中帶正電荷的胺基酸被碳數較少的胺基酸取代，且帶負電荷的胺基酸被碳數較多的胺基酸取代。此外，本發明提供一種兩親肽庫，其包含在兩親a -螺旋肽一側含有3-8個苯基丙氨酸(F)的兩親肽序列，其中疏水性胺基酸中的一個或多個苯基丙氨酸被除苯基丙氨酸以外的芳香族胺基酸取代。本發明還提供一種篩選Apo A-I模擬肽的方法，其包括以下步驟I)製備兩親肽庫；2)通過步驟I)的兩親肽庫分析細胞中的膽固醇外流；以及
3)篩選出與載脂蛋白A-I (Apo A-1)相比顯示出膽固醇外流水平增加的肽。本發明還提供一種篩選Apo A-I模擬肽的方法，其包括以下步驟I)製備兩親肽庫；以及2)將色氨酸螢光探針分子與步驟I)的兩親肽庫混合併用螢光光譜儀檢測，篩選出與載脂蛋白A-l(Ap0 A-1)相比顯示出色氨酸螢光 強度水平增加的肽。本發明還提供一種高密度脂蛋白(HDL)增強劑，其包含通過所述方法篩選出的兩親肽作為活性成分。此外，本發明提供一種用於治療高血脂及相關疾病的治療劑或診斷試劑，其包含通過所述方法篩選出的兩親肽作為活性成分。此外，本發明提供兩親肽在製備用於高血脂及相關疾病的治療劑或診斷試劑中的應用。在下文中，將詳細描述本發明。本發明提供一種兩親肽庫，其包含在兩親a -螺旋肽一側含有3-8個苯基丙氨酸(F)的兩親肽序列，其中親水性胺基酸中帶正電荷的胺基酸被碳數較少的胺基酸取代，且帶負電荷的胺基酸被碳數較多的胺基酸取代。所述兩親肽可以包括含有D-胺基酸的肽，但不限於此。作為本發明兩親肽庫的一個實例，本發明可以包括含有如SEQ ID NO 1所示胺基酸序列(4F)的兩親肽，其中親水性胺基酸賴氨酸(K)中的一個或兩個被鳥氨酸(Orn)、1，
4-二氨基丁酸(Dab)及I，3-二丙酸(Dap)取代，且穀氨酸(E)或天冬氨酸(D)中的一個或兩個胺基酸被穀氨酸或氨基己二酸(Aad)取代，但不限於此。優選地，兩親肽庫可以包含一個或多個具有如SEQ. ID. NO :3_24所示胺基酸序列的肽，更優選包含SEQ. ID. NO :3，但不限於此。此外，本發明提供一種兩親肽庫，其包含在兩親a -螺旋肽一側含有3-8個苯基丙氨酸(F)的兩親肽序列，其中疏水性胺基酸中的一個或多個苯基丙氨酸被除苯基丙氨酸以外的芳香族胺基酸取代。所述兩親肽可以包括含有D-胺基酸的肽，但不限於此。作為本發明兩親肽庫的一個實例，本發明提供含有如SEQ ID NO 1所示胺基酸序列(4F)的兩親肽，其中疏水性胺基酸苯基丙氨酸(F)中的一個或兩個被丙氨酸(A)、色氨酸(W)、I-萘基丙氨酸(Nall)或2-萘基丙氨酸(Nal 2)取代。優選地，兩親肽庫可以包含一個或多個具有如SEQ. ID. NO :25_44所示胺基酸序列的肽，更優選包含SEQ. ID. NO :43，但不限於此。為了發現一種具有改善的膽固醇識別能力同時保持現有Apo A-I模擬肽4F的a -螺旋的Apo A-I模擬肽，本發明人製備了一種肽，其通過保持4F的重要胺基酸序列同時取代親水性或疏水性胺基酸殘基而保持了 a-螺旋結構。親水區的大多數胺基酸為帶正電荷的賴氨酸(K)和帶負電荷的天冬氨酸或穀氨酸。肽分子之間的識別將通過這種正電荷-負電荷的識別而產生。基於通過控制帶電荷胺基酸的碳鏈長度可細微調整所述識別的假設，通過縮短帶正電荷的氨官能團同時增加帶負電荷的酸部分的碳數，研究了識別的差異。而且，兩個緊密相鄰的帶正電荷或負電荷的氨官能團或酸官能團也可能互相識別，因此，通過改變相互間距離最短的兩個胺基酸殘基的碳數來製備肽。將親水性胺基酸賴氨酸(K，從a-碳起包含4個碳)用鳥氨酸(Orn，從a-碳起包含3個碳)、二氨基丁酸(Dab，從a -碳起包含2個碳)或二氨基丙酸(Dap，從a -碳起包含I個碳)取代，或將天冬氨酸(D)用穀氨酸(E，比天冬氨酸多含I個碳)或氨基己二酸(Aad比天冬氨酸多含2個碳)取代(SEQ. ID. NO :3_24)。關於疏水區，現有Apo A-I模擬肽4F中眾所周知的重要因素苯基丙氨酸(F)主要被取代。具體地，製備了其中疏水面的4個苯基丙氨酸(F)被丙氨酸(A)取代的肽(SEQ.ID. NO 25-28)、其中的苯基丙氨酸被色氨酸(W)取代的肽(SEQ. ID. NO :25-28)、其中的苯基丙氨酸被I-萘基丙氨酸(Nall)取代的肽(SEQ. ID. NO :33-36)、其中的苯基丙氨酸被2-萘基丙氨酸(Nal2)取代的肽(SEQ. ID. NO :37-40)以及其中的苯基丙氨酸被1_萘基丙氨酸和2-萘基丙氨酸取代的肽(SEQ. ID. NO 41-44)，並構建了包含一個或多個兩親肽的兩親肽庫。本發明人確定了 Apo A-I模擬肽的計算質量值以及經合成和純化步驟後得到的A-I模擬肽的實際質量值(見表I)。另外，對膽固醇外流進行分析以篩選所述肽。用放射性同位素3H標記的膽固醇處理人的巨噬細胞。然後，用以上製備的各肽處理所述細胞。通 過測量細胞內膽固醇和釋放自巨噬細胞的細胞外膽固醇的量來分析所產生的高密度脂蛋白(HDL)的量。結果，與4F相比，親水性修飾的肽顯示出相近或相對較高的效果(見圖2)。與4F相比，la(SEQ. ID. NO :3)顯示出約150%更高的膽固醇外流水平。與親水性修飾的肽相比，疏水性修飾的肽明顯表現出更高的增加。特別地，其中3位和18位的苯基丙氨酸殘基被2-萘基丙氨酸取代的肽2s，相對於現有4F在膽固醇外流活性方面顯示出超過300%的更高增加。此外，其中的苯基丙氨酸被丙氨酸取代的4個肽顯示出膽固醇外流下降。當苯基丙氨酸被色氨酸或萘基丙氨酸取代時，膽固醇外流顯著增加(見圖3)。這個結果表明4個苯基丙氨酸殘基在膽固醇外流上具有重要的作用，在3位的苯基丙氨酸被色氨酸或萘基丙氨酸取代後顯示出最大的增強效果，因此表明此位置的疏水性殘基在模擬Apo A-I蛋白方面是非常重要的。本發明人分析了 Ia (相對於4F具有150%的增加)或2s (相對於4F具有300%的增加)在脂質或水溶液下對於疏水性分子的識別強度(recognition strength), Ia或2s通過篩選親水面或疏水面修飾的顯示出高膽固醇外流效果的肽而分離出。通過測定肽中色氨酸的色氨酸螢光強度變化對識別強度進行分析。結果，與水溶液中相比，脂質環境中2s肽的螢光強度顯示出增加約4. 30倍，Ia顯示出增加約2. I倍。該結果表明2s肽比4F肽具有更高的效果(見圖4)。因此，證實了 2s肽對於周圍的脂質如膽固醇具有較強的識別。為了理解肽和取決於膽固醇濃度的膽固醇之間的識別差異，採用增加了膽固醇相對量的脂質體對含色氨酸肽的螢光強度增加進行了分析。結果，與不含膽固醇的膜結構相t匕，根據膽固醇量的增加，螢光強度有所增強。此結果證實了膽固醇和肽之間具有密切的相互作用(見圖5)。因此，通過製備效果優於現有4F的Apo A-I模擬肽，該Apo A_1模擬肽通過比現有4F更加有效地選擇性識別膽固醇，從而可以增加血流中的HDL，因此可代替Apo A-I蛋白作為有效的聞血脂治療劑。此外，本發明提供一種採用兩親肽庫篩選Apo A-I模擬肽的方法。具體地，本發明提供一種篩選Apo A-I模擬肽的方法，其包括以下步驟
I)製備兩親肽庫；2)通過步驟I)的兩親肽庫分析細胞中的膽固醇外流；以及3)篩選出與Apo A-I相比顯示出膽固醇外流水平增加的肽。根據上述方法，步驟I)中的細胞優選為巨噬細胞，但不限於此。根據上述方法，步驟2)中的膽固醇外流水平優選通過膽固醇外流檢測進行分析，但不限於此。通過篩選膽固醇外流水平高於Apo A-肽的兩親肽而篩選出的兩親肽可有效地用作Apo A-I模擬蛋白。此外，本發明提供另一種篩選Apo A-I模擬肽的方法。 具體地，篩選Apo A-I模擬肽的方法包括以下步驟I)製備兩親肽庫；以及2)將色氨酸螢光探針分子與步驟I)的兩親肽庫混合併用螢光光譜儀檢測，篩選出與Apo A-I相比顯示出色氨酸螢光強度水平增加的肽。根據以上方法，用於脂質或疏水性分子的識別強度可以從步驟2)中的色氨酸螢光強度來計算。通過篩選色氨酸螢光強度高於Apo A-肽的兩親肽而篩選出的兩親肽可有效地用作Apo A-I模擬蛋白。此外，本發明提供一種高密度脂蛋白(HDL)增強劑，其包含通過所述方法篩選出的兩親肽作為活性成分。通過修飾現有兩親肽的親水性或疏水性胺基酸，本發明製備並篩選了可以增加高密度脂蛋白的Apo A-I模擬肽，並證實了疏水面的苯基丙氨酸被2-萘基丙氨酸取代後，與4F相比在膽固醇外流能力以及疏水分子的識別方面具有優異的功能，因此可有效用作HDL增強劑。此外，本發明提供一種用於治療高血脂及相關疾病的治療劑或診斷試劑，其包含通過所述方法篩選出的兩親肽作為活性成分。此外，本發明還提供一種用於高血脂及相關疾病的診斷試劑，其包含通過所述方法篩選出的兩親肽作為活性成分。高血脂及相關疾病優選為選自下組中的任一種血膽固醇過多、動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、心血管疾病、再狹窄、高血壓、心絞痛、糖尿病、肥胖症及老年痴呆症，但不限於此。治療劑或診斷試劑可以包含Apo A-I模擬肽，也可進一步包含D-胺基酸修飾的肽。通過修飾現有兩親肽的親水性或疏水性胺基酸，本發明製備並篩選了可以增加高密度脂蛋白的Apo A-I模擬肽，並證實了疏水面的苯基丙氨酸被2-萘基丙氨酸取代後，與4F相比在膽固醇外流能力以及疏水分子的識別方面具有優異的功能，因此可有效用作治療高血脂及疾病的治療劑或診斷試劑。與此同時，基於活性成分的總重量，包含Apo A-I模擬肽作為活性成分的該治療劑或診斷試劑可以包含0. 0001-50wt%的量的Apo A-I模擬肽。本發明的治療劑可以進一步包含一種或多種與活性成分具有相同或相近功能的活性成分。在本發明的藥物組合物中，可以存在用於製劑的藥用載體，包括生理鹽水、滅菌水、林格氏液(Ringers solution)、緩衝生理鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糖糊精溶液、甘油、酒精、脂質體以及可以使用其中至少一種的混合物。本發明的藥物組合物可以進一步包括稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和潤滑劑以用於製備成注射劑如水溶液、懸浮液、乳液，丸劑，膠囊劑，顆粒劑或片劑。特異於靶細胞的抗體和其它配體可以與載體一起組合使用與靶細胞進行特異性反應。此外，組合物可以優選地根據各種疾病或配料以本領域合適的方法或《雷明頓的醫藥科學》(賓夕法尼亞州伊斯頓，馬克出版公司)(Remington' sPharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton P)教導的方法進行配製。本發明的藥物組合物可以通過口服或腸胃外給藥。給藥方法可以根據使用目的以口服或腸胃外(例如靜脈內、皮下、腹膜內或局部或鼻腔給藥)進行給藥，優選通過腸胃外給藥，更優選通過鼻腔給藥。本發明藥物組合物的合適劑量可以根據藥物製劑方法、給藥方 法、患者年齡、體重、性別、疾病嚴重程度、飲食、給藥時間、給藥途徑、排洩率以及對所用藥物組合物的敏感度而變化。本發明藥物組合物以0.005-10mg/kg(體重)的每日劑量給藥，優選0. 05-lmg/kg,更優選每天給藥一次至數次。本發明的治療劑可以單獨使用或與其它方法例如外科手術、激素療法、化學療法及用於治療患者的生物應答調控劑(biological response controller)組合使用。本發明還提供一種用於高血脂或相關疾病的治療試劑盒，其包含通過所述方法篩選出的兩親肽作為活性成分。此外，本發明還提供一種用於高血脂或相關疾病的診斷試劑盒，其包含通過所述方法篩選出的兩親肽作為活性成分。高血脂及相關疾病優選為選自下組中的任一種血膽固醇過多、動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、心血管疾病、再狹窄、高血壓、心絞痛、糖尿病、肥胖症及老年痴呆症，但不限於此。通過修飾現有兩親肽的親水性或疏水性胺基酸，本發明製備並篩選了可以增加高密度脂蛋白的Apo A-I模擬肽，並證實了疏水面的苯基丙氨酸被2-萘基丙氨酸取代後，與4F相比在膽固醇外流能力以及疏水分子的識別方面具有優異的功能，因此可有效用作治療和診斷高血脂及相關疾病的治療和診斷試劑盒的一種組成成分。此外，本發明還提供一種治療高血脂及相關疾病的方法，其包括向個體施用治療劑的步驟。此外，本發明還提供一種診斷高血脂及相關疾病的方法，其包括向個體施用治療劑的步驟。適用於本發明的個體為脊椎動物，優選哺乳動物，更優選實驗動物如小鼠、家兔、豚鼠、倉鼠、狗和貓，最優選靈長類如黑猩猩和大猩猩。高血脂及相關疾病優選為選自下組中的任一種血膽固醇過多、動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、心血管疾病、再狹窄、高血壓、心絞痛、糖尿病、肥胖症及老年痴呆症，但不限於此。通過修飾現有兩親肽的親水性或疏水性胺基酸，本發明製備並篩選了可以增加高密度脂蛋白的Apo A-I模擬肽，並證實了疏水面的苯基丙氨酸被2-萘基丙氨酸取代後，與4F相比在膽固醇外流能力以及疏水分子的識別方面具有優異的功能，因此可有效用於治療和診斷聞血脂及相關疾病。本發明的藥物組合物可以腸胃外給藥，腸胃外給藥通過靜脈內注射、腹膜內注射、皮下注射、直腸內注射、腦室內注射或胸腔內注射實現。劑量可以根據體重、年齡、性別、患者健康狀況、飲食、給藥時間、給藥方式、排洩率以及疾病嚴重程度而變化。劑量可以根據體重、年齡、性別、患者健康狀況、飲食、給藥時間、給藥方式、排洩率以及疾病嚴重程度而變化。單次劑量在0. 005-10mg/kg的範圍內，優選0. 05-lmg/kg的範圍內，一天可給藥一次至數次。本發明還提供兩親肽在製備用於高血脂及相關疾病的治療劑或診斷試劑中的應用，其中具有4個苯基丙氨酸(F)的兩親a -螺旋肽的胺基酸序列包含親水性胺基酸中被碳數較少的胺基酸取代的帶正電荷胺基酸，以及親水性胺基酸中被碳數較多的胺基酸取代的帶負電荷胺基酸。
此外，本發明提供兩親肽在製備用於治療高血脂及相關疾病的治療劑或診斷試劑中的應用，其中具有4個苯基丙氨酸(F)的兩親a-螺旋肽的胺基酸序列包含疏水性胺基酸中被除苯基丙氨酸以外的芳香族胺基酸取代的一個或多個苯基丙氨酸。高血脂及相關疾病優選為選自下組中的任一種血膽固醇過多、動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、心血管疾病、再狹窄、高血壓、心絞痛、糖尿病、肥胖症及老年痴呆症，但不限於此。通過修飾現有兩親肽的親水性或疏水性胺基酸，本發明製備並篩選了可以增加高密度脂蛋白的Apo A-I模擬肽，並證實了疏水面的苯基丙氨酸被2-萘基丙氨酸取代後，與4F相比在膽固醇外流能力以及疏水分子的識別方面具有優異的功能，因此Apo A-I模擬蛋白可有效用作用於治療高血脂及相關疾病的治療劑的活性成分。有益效果Apo A-I模擬肽可以用於篩選能增加血液中高密度脂蛋白的兩親肽，而且由於篩選出的疏水面苯基丙氨酸被2-萘基丙氨酸取代的4F肽，與4F相比在膽固醇外流能力以及脂質的識別方面顯示出優異的功能，因此可有效用作治療高血脂及相關疾病的Apo A-I模擬肽以及用作治療劑的候選肽。


圖I是描述本發明所使用的第一代4F的輪形圖(wheel diagram)。圖2是表示兩親肽4F親水側的殘基經修飾後的肽系列的膽固醇外流圖表(每種肽的使用濃度為20 ii M)。圖3是表示兩親肽4F疏水側的殘基經修飾後的肽系列的膽固醇外流圖表(每種肽的使用濃度為20 ii M)。圖4是表示在大單室脂質體(LUV)條件下篩選出的肽的色氨酸螢光強度圖表。黑色代表溶液中肽的螢光強度，灰色代表脂質環境中肽的螢光強度(每種肽的使用濃度為
IU M，脂質體的使用濃度為0. lmg/ml)。圖5是表示根據大單室脂質體(LUV)中膽固醇組成的螢光強度變化圖表。
具體實施例方式現將通過實施例進一步詳細描述本發明。這些實施例旨在更具體地說明本發明，並且如所附權利要求書所述的本發明的範圍不限於實施例或被實施例所限制，這對於本領域技術人員而言是顯而易見的。實施例I肽庫的合成〈1-1>肽的合成採用眾所周知的Fmoc固相肽合成法進行肽的合成。將50mg(0. 064mmol)RinkAmide樹脂(Novabiochem)置於容器中，加入Iml 二氯甲燒使樹脂在容器中溶脹。通過加入 Iml DMF (二甲基甲醯胺)使混合物溶脹5min。使用Iml 20%哌啶(於DMF中)進行樹脂脫保護5分鐘(三次)，然後用Iml DMF洗滌五次。將六當量Fmoc-脫保護的胺基酸與含有六當量(198mg)各PyBop [六氟磷酸(苯並三唑_1_基-氧基)三吡咯烷基磷]和DIPEA ( 二異丙基乙胺)的溶液反應至少60min。反應完成後，用Iml DMF洗滌反應物三次。進行TNBS檢驗以確認反應是否成功完成。具體地，將一滴溶於DMF的10% DIPEA和一滴溶於DMF的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)滴至樣品上。當其無色時，意味著反應完成。一旦醯胺結合完成，採用具有設計序列的Fmoc-胺基酸分步進行18次。結果，合成了 18-mer肽。將該肽再次脫保護，然後加入分別含有6當量醋酸酐和N-羥基苯並三唑(HOBt)的Iml 90% DMF和10%二氯甲烷溶液的混合物，反應45min或更長以在肽的N-末端加上乙醯基。肽的N-末端乙醯化之後，用Iml DMF和Iml甲醇分別洗滌樹脂三次，然後真空乾燥。將50mg含有通過固相肽合成法合成的肽的樹脂置於Iml裂解溶液[2. 5% TIS(三異丙基矽烷)、2. 5%水、95% TFA(三氟乙酸)]中，然後攪拌2h。結果，合成的肽從樹脂上分離。將樹脂過濾，用氮氣除去過量的TFA。將50ml正己烷乙醚(V : V = I I)溶液預先在0°C下冷卻，然後加入以洗提所述合成的肽。肽的純化將來源於實施例〈1-1>的洗提肽溶於二甲亞碸，然後通過使用C18柱的HPLC進行純化。將含有0. 1% TFA的水和乙腈作為HPLC溶劑。特別地，將粗肽溶於二甲亞碸中使其濃度為10mg/ml。將100 ill溶液載入HPLC中，然後從5%乙腈到70%乙腈改變溶劑的組成持續40分鐘，進行肽的純化。此時，流速為3ml/min，檢測波長為220nm。在20-30分鐘的時間點回收肽，並真空蒸發掉乙腈，然後冷凍乾燥。將純化的吖啶_a -螺旋肽絡合物通過採用MOLDI-TOF質譜分析法測定分子質量來鑑別。結果，合成和純化之後測定的合成肽序列、計算質量值和實際質量值如表I所示。表I參考 。I , ,質量(MlH+)
SEQ.ID胺基酸序列-r——
___計算值測定值
1_4F_Ac-DWFKAFYDKVAEKFKEAF2310_2312.2
2_Sc-4F Ac-DWFAKDYFKKAFVEEFAK2309.1 2311.2
3_la_Ac-EWFKAFYDKVAEKFKEAF2323.1 2324.2
4_Ib_Ac-AadWFKAFYDKVAEKFKEAF2337.2 2339.9
5_Ic_Ac-DWFQmAFYDKVAEKFKEAF2295.1 2397 6_Id_Ac-DWFDabAFYDKVAEKFKEAF2281.1 22S2.1
7_Ie_Ac-DWFDapAFYDKVAEKFKEAF2267.1 2268
8_If_Ac-EWFKAFYEKVAEKFKEAF2337.2 2338.8
9_Ig_Ac-EWFKAFYAadKVAEKFKEAF2351.2 2353.1
K)_Ih |Ac-EWFKAFYDOmVAEKFKEAF|2309.1 |2310.9
權利要求
1.一種兩親肽庫，其包含具有在兩親a -螺旋肽一側含有3-8個苯基丙氨酸(F)的胺基酸序列的兩親肽，其中親水性胺基酸中帶正電荷的胺基酸被碳數較少的胺基酸取代，且帶負電荷的胺基酸被碳數較多的胺基酸取代。
2.如權利要求I所述的兩親肽庫，其中帶正電荷的取代胺基酸含有氨基，帶負電荷的取代胺基酸含有酸官能團。
3.如權利要求I所述的兩親肽庫，其包含具有如SEQID NO :1所示胺基酸序列(4F)的兩親肽，其中親水性胺基酸賴氨酸(K)中的一個或兩個被鳥氨酸(Orn)、1，4-二氨基丁酸(Dab)及1，3_ 二丙酸(Dap)取代，且穀氨酸(E)或天冬氨酸(D)中的一個或兩個胺基酸被穀氨酸或氨基己二酸(Aad)取代。
4.如權利要求3所述的兩親肽庫，其中所述兩親肽包含一個或多個含有如SEQ.ID. NO 3-24所示胺基酸序列的肽。
5.一種兩親肽庫，其包含在兩親a -螺旋肽一側含有3-8個苯基丙氨酸(F)的兩親肽序列，其中疏水性胺基酸中的一個或多個苯基丙氨酸被除苯基丙氨酸以外的芳香族胺基酸取代。
6.如權利要求5所述的兩親肽庫，其中除苯基丙氨酸以外的芳香族胺基酸為選自下組中的任一種苯基丙氨酸衍生物、色氨酸及其衍生物、以及萘基丙氨酸及其衍生物。
7.如權利要求5所述的兩親肽庫，其包含含有如SEQID NO: I所示胺基酸序列的疏水性胺基酸苯基丙氨酸(F)中的一個或兩個被丙氨酸(A)、色氨酸(W)、l-萘基丙氨酸(Nall)或2-萘基丙氨酸(Nal2)取代的兩親肽。
8.如權利要求7所述的兩親肽庫，其中所述兩親肽包含一個或多個含有如SEQ.ID. NO 25-44所示胺基酸序列的肽。
9.篩選ApoA-I模擬肽的方法，所述方法包括以下步驟 1)製備權利要求I或權利要求5所述的兩親肽庫； 2)通過所述兩親肽庫分析細胞中的膽固醇外流；以及 3)篩選出與ApoA-I相比顯示出膽固醇外流水平增加的肽。
10.如權利要求9所述的方法，其中步驟I)中的細胞為巨噬細胞。
11.如權利要求9所述的方法，其中通過採用膽固醇外流檢測分析步驟2)中的膽固醇外流。
12.篩選ApoA-I模擬肽的方法，其包括以下步驟 1)製備權利要求I或權利要求5所述的兩親肽庫；以及 2)將色氨酸螢光探針分子與步驟I)的兩親肽庫混合併用螢光光譜儀檢測，篩選出與載脂蛋白A-I (Apo A-1)相比顯示出色氨酸螢光強度水平增加的肽。
13.一種高密度脂蛋白(HDL)增強劑，其包含根據權利要求9或權利要求12所述方法篩選出的兩親肽作為活性成分。
14.一種用於高血脂及相關疾病的治療劑或診斷試劑，其包含根據權利要求9或權利要求12所述方法篩選出的兩親肽作為活性成分。
15.如權利要求14所述的治療劑或診斷試劑，其中所述高血脂及相關疾病為選自以下組的任一種血膽固醇過多、動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、心血管疾病、再狹窄、高血壓、心絞痛、糖尿病、肥胖症、老年痴呆症及多發性硬化。
16.一種治療高血脂及相關疾病的方法，其包括對個體施用權利要求14所述治療劑的步驟。
17.—種診斷高血脂及相關疾病的方法，其包括對個體施用權利要求14所述治療劑的步驟。
18.兩親肽在製備用於高血脂及相關疾病的治療劑或診斷試劑中的應用，所述兩親肽包含在兩親a-螺旋肽中含有4個苯基丙氨酸(F)的兩親肽序列，其中親水性胺基酸中帶正電荷的胺基酸被碳數較少的胺基酸取代，且帶負電荷的胺基酸被碳數較多的胺基酸取代。
19.兩親肽在製備用於高血脂及相關疾病的治療劑或診斷試劑中的應用，所述兩親肽包含在兩親a-螺旋肽中含有4個苯基丙氨酸(F)的兩親肽序列，其中疏水性胺基酸中的 一個或多個苯基丙氨酸被除苯基丙氨酸以外的芳香族胺基酸取代。
全文摘要
本發明涉及載脂蛋白A-1模擬肽，以及包含其的用於治療高血脂及高血脂相關疾病的治療劑。更具體地，本發明的載脂蛋白A-1模擬肽通過修飾現有4F兩親肽的親水面或疏水面以產生Apo A-1模擬肽來製備，該Apo A-1模擬肽與膽固醇酯特異性結合以增加高密度脂蛋白的含量；在這些模擬肽中，4F疏水面中苯基丙氨酸被2-萘基丙氨酸取代的肽，與現有4F肽相比具有優異的膽固醇外流能力和脂質認知功能。因此，本發明的Apo A-1模擬肽可以用作Apo A-1模擬肽，以及用作治療高血脂及高血脂相關疾病的治療劑。
文檔編號C07K14/775GK102753576SQ200980162396
公開日2012年10月24日 申請日期2009年9月30日 優先權日2009年9月30日
發明者俞載勳 申請人:首爾大學教產學協力團